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8.5: Métodos de clasificación e identificación de microorganismos - Biología

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8.5: Métodos de clasificación e identificación de microorganismos

Capítulo 3 Clasificación

Clasificación

Las bacterias se clasifican e identifican para distinguir entre cepas y agruparlas según criterios de interés para microbiólogos y otros científicos.

Nomenclatura

Las bacterias se nombran para que los investigadores puedan definirlas y discutirlas sin la necesidad de enumerar sus características.

Especies

Las especies, grupos de organismos similares dentro de un género, se designan por criterios bioquímicos y otros fenotípicos y por parentesco con el ADN, que agrupa las cepas en función de su similitud genética general.

Identificación diagnóstica

Las bacterias se identifican de forma rutinaria mediante pruebas morfológicas y bioquímicas, complementadas según sea necesario con pruebas especializadas como la serotipificación y los patrones de inhibición de antibióticos. Las nuevas técnicas moleculares permiten identificar las especies por sus secuencias genéticas, a veces directamente de la muestra clínica.

Subtipado

Debido a las diferencias en la patogenicidad o la necesidad de caracterizar un brote de enfermedad, las cepas de interés médico a menudo se clasifican por debajo del nivel de especie por serotipificación, tipificación de enzimas, identificación de toxinas u otros factores de virulencia, o caracterización de plásmidos, patrones de proteínas o ácidos nucleicos. .

Especies nuevas e inusuales

Los laboratorios no tienen dificultad para identificar la mayoría de las bacterias. Se desarrollan problemas con cepas atípicas y la identificación errónea de especies raras o recientemente descritas puede conducir a una atención inadecuada al paciente. Por lo tanto, el personal de laboratorio y los médicos (al menos los especialistas en enfermedades infecciosas) deben mantenerse actualizados con respecto a los cambios en la taxonomía y el reconocimiento de nuevas especies.

Papel del laboratorio clínico

Los científicos de los laboratorios clínicos detectan, aíslan, identifican y determinan los patrones de susceptibilidad a los antimicrobianos de microbios clínicamente relevantes a pedido de los médicos, e interactúan con los laboratorios de salud pública.


Introducción

Los patógenos transmitidos por los alimentos se están estudiando cada vez más debido a su capacidad para cambiar y adaptarse a diferentes condiciones ambientales y de supervivencia. La capacidad de estos patógenos para mutar ha contribuido a su adaptabilidad y supervivencia en una amplia gama de condiciones. La presencia de ciertos anticuerpos, genes virulentos y / u otros mecanismos defensivos complejos producidos por patógenos transmitidos por los alimentos también contribuye a su adaptabilidad y supervivencia en diversas condiciones ambientales. La supervivencia de patógenos transmitidos por los alimentos en una variedad de condiciones ambientales justifica el desarrollo y uso de técnicas de aislamiento, detección, diferenciación, clasificación y / o tipificación eficientes y confiables para su vigilancia (Adzitey y Nurul 2011 Adzitey et al. 2011). Los estudios de vigilancia proporcionan datos epidemiológicos para rastrear la fuente de infección con fines clínicos y de tratamiento. Además, los estudios de vigilancia proporcionan datos que ayudan a reducir la aparición y colonización de patógenos transmitidos por los alimentos y a adaptar las estrategias adecuadas para prevenir y controlar la propagación de los mismos.

Se han aislado (mediante estudios de vigilancia) una variedad de patógenos transmitidos por los alimentos de diferentes productos alimenticios, animales, plantas y muestras ambientales que han estado implicados en enfermedades transmitidas por los alimentos, intoxicaciones y / o intoxicaciones que se produjeron de forma esporádica o por brotes. En particular, la manipulación y el consumo de carnes y productos de aves de corral crudos contaminados se han visto implicados en la mayoría de los casos (Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC) 2003 Humphrey et al.2007 Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) 2008 Frederick y Huda 2011). Las carnes de pato y los huevos también se han relacionado con varios brotes. Por ejemplo, un brote de Salmonela El tipo de fago definitivo (DT) de Typhimurium 8 se asoció con huevos y productos de pato, y fue responsable de la hospitalización de dos personas y la muerte de una (Clarke 2010). El contacto con pichones y patitos en una escuela de párvulos se ha relacionado con el brote de Salmonela infección (Merritt y Herlihy 2003). La salmonelosis también se ha asociado con pollitos y patitos (Informe Semanal de Morbilidad y Mortalidad (MMWR) 2000).

La vigilancia eficaz de los patógenos transmitidos por los alimentos se puede lograr mediante una combinación de las técnicas convencionales y varias basadas en reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) (Loncarevic et al. 2008 Aurora et al. 2009 Adzitey y Corry 2011). Los métodos estándar convencionales o culturales parecen haberse utilizado desde el inicio del muestreo microbiológico (Adzitey y Huda 2010 Adzitey y Nurul 2011). Estos métodos implican principalmente enriquecimiento (pre-enriquecimiento y / o enriquecimiento selectivo) seguido de placa en agar selectivo o directamente en agar selectivo sin enriquecimiento, y confirmación de presuntas colonias de bacterias mediante pruebas bioquímicas (Corry et al.2003 Adzitey et al. 2011). Se utilizan ampliamente y tienen la ventaja de que son más baratos, detectan solo bacterias viables y producen aislamientos que pueden caracterizarse y estudiarse más a fondo (Engberg et al. 2000 Adzitey y Nurul 2011). Sin embargo, son laboriosos, relativamente lentos y menos eficientes (Keramas et al. 2004 Myint et al. 2006). Las técnicas moleculares también se han utilizado ampliamente en la vigilancia, la mutación y otros estudios genéticos de patógenos transmitidos por los alimentos para aumentar nuestro conocimiento sobre la fuente principal de patógenos transmitidos por los alimentos, la fuente de infección y la diversidad genética. Las técnicas moleculares tienen la ventaja de que son rápidas, menos laboriosas y más sensibles, específicas y eficientes en comparación con el método convencional (Magistrado et al. 2001 Keramas et al. 2004). No obstante, ciertos componentes / compuestos en alimentos como grasas, lípidos y sales, medios de enriquecimiento o solución de extracción de ADN pueden inhibir la sensibilidad de los métodos basados ​​en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Rossen et al. 1992 Wilson, 1997).

El propósito de este artículo es destacar algunas técnicas moleculares comúnmente disponibles, sus ventajas y uso para detectar, caracterizar y / o tipificar patógenos transmitidos por alimentos aislados de patos y muestras relacionadas con patos.


Tipos de tinción


Tinción simple

Determina la forma celular, el tamaño y la disposición de los microorganismos. Es un método muy rápido o sencillo de realizar y utiliza una única mancha. Estos son de dos tipos, a saber, tinción directa e indirecta.

Diferencias características entre tinción directa e indirecta:

CaracteristicasTinción directaTinción indirecta
Mancha usadaMancha básicaMancha ácida
Carga de manchaPositivoNegativo
Ejemplos deAzul de metileno, violeta cristal, carbol fuschinNigrosina, tinta china, rojo Congo
SalirTiñe la muestraMancha el fondo
Vista general después de la tinción
Principio de decoloraciónDebido a la mancha cargada positivamente, se atrae hacia la celda cargada negativamente, por lo tanto, se fija a la celda que retiene el color de la mancha y da como resultado un fondo incoloro con celda coloreada.Debido a la mancha cargada negativamente, es repelida por la celda cargada negativamente, por lo tanto, no se fija a la celda, lo que da como resultado una celda incolora con un fondo de color.

Tinción diferencial

Distingue entre las propiedades físicas y químicas de dos grupos diferentes de un organismo, dependiendo de las características de la pared celular. Utiliza múltiples o más de una tinción. Se puede clasificar en dos tipos que se indican a continuación:

Proporciona una herramienta importante para diferenciar los dos grupos principales de bacterias, es decir, grampositivas y gramnegativas. El Dr. Hans Christian Joachim Gram introdujo este método en 1884. Se lleva a cabo mediante el uso de una tinción diferencial conocida como tinción Gram & # 8217s.

Procedimiento:

Tinción de GramProtocoloBacterias Gram positivasBacterias Gram-negativo
Tinción primariaEl frotis fijado con calor se inunda con violeta cristal y se deja reposar durante 1 minuto.
MordantingDespués del lavado, se inunda con yodo y se deja reposar durante 1 minuto.
DecoloraciónDespués del lavado, se agrega alcohol que se lava inmediatamente.
Contador de tincionesPor último, la safranina se inunda sobre el frotis y se deja reposar durante 30 segundos, luego se lava con agua.
ObservaciónDespués de secar al aire, coloque una gota de aceite en aceite sobre el frotis y ajuste el microscopio para identificar la muestra, ya sea gramnegativa o grampositiva.
Aparecen de color púrpura debido al ácido teicoico que resiste la mancha primaria.Aparecen de color rosa debido a la falta de ácido teicoico, el alcohol crea un poro en la célula que decolora la mancha primaria

Diferencia las especies de micobacterias de los otros grupos de bacterias. Paul Ehrlich la desarrolló por primera vez en 1882. Y más tarde, esta técnica fue modificada por un científico llamado Ziehl Neelson.

Procedimiento

Tinción ácido rápidoProtocoloBacterias acidorresistentesBacterias no acidorresistentes
Tinción primariaEl frotis fijado con calor se inunda con fuschin carbol y se deja reposar durante 1 min.
DecoloraciónDespués del lavado, se agrega alcohol ácido.
Contador de tincionesPor último, se inunda el frotis con azul de metileno y se deja reposar durante 30 segundos, luego se lava con agua.
ObservaciónDespués de secar al aire, coloque una gota de inmersión en aceite sobre el frotis y ajuste el microscopio para identificar la muestra, ya sea que la muestra sea resistente al ácido o no.
Aparece de color rojo debido a la presencia de ácido micólico que resiste el color de la mancha primaria y no decolora.Aparece de color azul, ya que carecen de ácido micólico, el alcohol crea un poro en la célula que decolora la mancha primaria.

Tinción especial

Ayuda en la identificación de componentes estructurales internos y externos particulares de la muestra. Incluye tinción de cápsulas, endosporas y flagelos.

Diferencia la cápsula del resto del cuerpo celular. Esto se lleva a cabo mediante el uso de tintes tanto positivos como negativos.

Cápsula: Puede definirse como la envoltura de polisacárido, que rodea la pared celular. La cápsula realiza muchas funciones como la protección celular contra la desecación, acciones fagocíticas y también ayuda en la unión celular al huésped. Una cápsula es responsable de la patogenicidad o virulencia de un organismo. Se puede ver en las células de las bacterias grampositivas y gramnegativas.

Procedimiento

Tinción de cápsulasProtocoloDiagrama
Tinción primariaSe coloca una gota de tinta china en un portaobjetos limpio.
UntarA continuación, se unta el inóculo con un tinte.
ArrastrandoUse otro portaobjetos para arrastrar la mezcla en una película delgada y luego secar al aire.
Tinción secundariaLa violeta de cristal se inunda sobre la película delgada y luego se seca al aire.
ObservaciónExamine las células si están encapsuladas o no.
Interpretación del resultado
Positivo: la formación de zonas se produce sobre un fondo oscuro
Negativo: la formación de zonas no ocurre

Diferencia la endospora de la célula vegetativa y utiliza tintes tanto ácidos como básicos.

Endospora: Un término en sí mismo define su significado, en el que endo significa interior y espora representa una estructura reproductiva. Por tanto, las endosporas son las estructuras reproductivas inherentes a la célula. Actúa como una espora inactiva, que puede resistir duras condiciones físicas y químicas. Las endosporas se encuentran comúnmente en bacterias grampositivas. Según su posición, son de tres tipos, como se indica a continuación:

Procedimiento

Tinción de endosporasProtocoloDiagrama
Tinción primariaEl verde de malaquita se inunda sobre el frotis
Fijación por calor Luego, la mezcla se fija con calor.
DecoloraciónDecolorado por el agua
Contador de tincionesLa safranina luego se inunda sobre la mezcla y luego se seca al aire.
ObservaciónExamine el portaobjetos bajo el microscopio, ya sea que haya endosporas o no
Interpretación del resultado:
Positivo: si hay endosporas, aparecerá de color verde, mientras que la célula vegetativa aparecerá de color rosa.
Negativo: Y si no hay endosporas, solo las células vegetativas aparecerán de color rosa.

Ayuda en la identificación de la motilidad bacteriana a través de la presencia o ausencia de flagelos. Hace uso de tinción ácida y neutra.

Flagelos: Son estructuras largas, en forma de hilo, que sobresalen de la membrana celular. Su función principal es proporcionar motilidad o locomoción. Según la disposición, estos son de los siguientes tipos:

Atrichous: Estos son sin flagelos.
Monotrichous: Un solo flagelo está presente en un extremo.
Anfítrico: Un solo flagelo está presente en ambos extremos.
Lophotrichous: Grupos de flagelos están presentes en un extremo.
Peritrichous: Los flagelos están presentes en toda la superficie celular.

Procedimiento

Tinción de flagelosProtocoloDiagrama
Tinción primariaUna gota de tinte de Leifson se inundó sobre el frotis
Tinción secundariaDespués de eso, se agrega azul de metileno y se deja reposar durante un minuto.
ObservaciónExaminar la apariencia de los flagelos para saber si la bacteria es móvil o no.
Interpretación del resultado:
Positivo: si hay flagelos, aparecerán de color rojo mientras que la celda se verá azul
Negativo: Y si no está presente, solo la celda aparecerá en color azul

Ejemplos de bacterias en diferentes métodos de tinción

Aplicaciones

  • Los métodos de tinción tienen una amplia aplicabilidad tanto en la investigación biológica como en la bioquímica.
  • Se utiliza en la tinción de metales.
  • Utilizado para teñir la madera.

Conclusión

Se utilizan varias técnicas de tinción para diferentes propósitos, como estudiar la morfología bacteriana y examinar los componentes celulares internos y externos. También se puede utilizar para identificar el grupo particular de bacterias, después de lo cual podemos clasificar aún más el tipo de muestra, en función de su comportamiento de crecimiento y características microscópicas.


8.5: Métodos de clasificación e identificación de microorganismos - Biología

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Clasificación de bacterias

Ahora vamos a entrar en detalles sobre el clasificación de bacterias. Esta clasificación se realiza en función de la forma, la pared celular, los flagelos, la nutrición y la morfología.

Clasificación de bacterias sobre la base de la forma: -

En el año 1872, el científico Cohn clasificó las bacterias en 4 tipos principales, según sus formas, que son los siguientes: - 1) Cocci: Estos tipos de bacterias tienen forma unicelular, esférica o elíptica. Pueden permanecer como una sola celda o pueden agregarse para varias configuraciones. Son los siguientes:


I) Monococcus: - También se denominan micrococos y están representados por una sola célula redonda discreta. Ejemplo: Micrococcus flavus. ii) Diplococcus: - la célula del Diplococcus se divide en un plano particular y después de la división, las células permanecen unidas entre sí. Ejemplo: - Neumonía por Diplococcus.

Diferentes formas de bacterias

iii) Estreptococo: - aquí las células se dividen repetidamente en un plano para formar una cadena de células. Ejemplo: - Streptococcus pyogenes.

iv) Tetracoccus: - Este consta de cuatro celdas redondas, que desafían en dos planos en ángulo recto entre sí. Ejemplo: - Gaffkya tetragena. v) Estafilococo: - aquí las celdas se dividen en tres planos formando una estructura estructurada como racimos de uva dando una configuración irregular. Ejemplo: - Staphylococcus aureus. vi) Sarcina: -en este caso estas celdas se dividen en tres planos pero forman una configuración en forma de cubo que consta de ocho o dieciséis celdas pero tienen una forma regular. Ejemplo: –Sarcina lutea. 2) Bacilos: - se trata de bacterias cilíndricas o en forma de varilla que permanecen solas o en parejas. Ejemplo: –Bacillus cereus. 3) Vibro: -los vibro son las bacterias curvas, en forma de coma y representadas por un solo género. Ejemplo: - Vibro cholerae. 4) Spirilla: - este tipo de bacterias son espirales o primaverales con múltiples curvaturas y flagelos terminales. Ejemplo: –Spirillum volutans.

Clasificación de bacterias sobre la base de la nutrición: -

Sobre la base de la nutrición, las bacterias se clasifican de la siguiente manera: 1) Bacterias autotrópicas: - estas bacterias son no patógenas, de vida libre, autosuficientes por naturaleza, que preparan sus propios alimentos mediante la utilización de energía solar y componentes inorgánicos como dióxido de carbono, nitrógeno, etc. Son de dos tipos: i) Fotoautótrofos: - estas bacterias contienen bacterio-clorofila y bacterioviridina y pueden preparar sus propios alimentos fijando el dióxido de carbono de la naturaleza mediante la utilización de energía solar. ii) Quimioautótrofos: -Estas son las bacterias que preparan su alimento obteniendo la energía de la oxidación de sustancias inorgánicas como dióxido de nitrógeno, dióxido de carbono, etc. y también pueden fijar dióxido de carbono y agua para su nutrición. 2) Bacterias heterotróficas: - este tipo de bacterias no pueden fijar Carbone inorgánico sino que dependen de Carbone orgánico externo para su nutrición. También se pueden clasificar según la presencia y ausencia de vuelo y según el medio en el que crecen las bacterias.

Clasificación de bacterias sobre la base de la pared celular: -

Diferentes tipos de bacterias

Dependiendo de las reacciones de tinción de las bacterias de la tinción de Gram se pueden clasificar en dos tipos, que son: i) Gram positivas: -Este tipo de bacterias retiene los cristales de fuego encendido o tinción de Gram que aparecen violados. Ejemplo: - Streptococcus. ii) Gram negativo: - no retienen la tinción de Gram, pero retoman el color rojo de la tinción de mostrador. Ejemplo: - Saffranina (Escherichia coli). Clasificación sobre la base de la respuesta a la temperatura: - Las bacterias se pueden clasificar en cuatro tipos principales en función de su respuesta a la temperatura, como se indica a continuación: - i) Bacterias psicrofílicas: -Este tipo de bacterias crece justo por encima de la temperatura de congelación, pueden provocar la contaminación de los alimentos almacenados en el frigorífico. Ejemplo: -Pseudomonas. ii) Bacterias mesofílicas: -Estas bacterias crecen a temperatura normal en los cuerpos de agua, productos alimenticios, liberan gases y provocan cambios en la textura. Ejemplo: -Lactobacillus. iii) Bacterias termofílicas: - Estos tipos de bacterias pueden sobrevivir a temperaturas más altas y pueden soportar la temperatura de pasteurización. Ejemplo: - Clostridium, Bacillus. iv) Bacterias termofílicas: - Estos tipos de bacterias pueden sobrevivir a la pasteurización pero no pueden crecer a la temperatura de pasteurización. Ejemplo: - Micrococcus, Streptococcus.

Clasificación de bacterias sobre la base del número de flagelos: -

Sobre la base de los flagelos, las bacterias se pueden clasificar: - i) Atrichos: - Estas bacterias no tienen flagelos. Ejemplo: -Corynebacterium diptherae. ii) Monotrichous: - Un flagelo está unido a un extremo de la célula bacteriana. Ejemplo: - Vibro cholera. iii) Lophotrichous: - Un manojo de flagelos se adhiere a un extremo de la célula bacteriana. Ejemplo: - Pseudomonas. iv) Anfítrico: - Montón de flagelos que surgen de ambos extremos de la célula bacteriana. Ejemplo: - Rhodospirillum rubrum. v) Peritrichous : - Los flagelos se distribuyen uniformemente rodeando toda la célula bacteriana. Ejemplo: -Bacillus.


Métodos

Recolección de muestras ambientales y aislamiento de ADN

Las muestras de consorcios microbianos analizadas en este estudio se obtuvieron de entornos especializados en digestión anaeróbica y producción de metano, como el tanque de (I) fermentador (ABF) y (II) hidrolizador (ABH) de una planta de biogás agrícola en Miedzyrzec Podlaski, Polonia (III) purines de ganado (CS) y (IV) estiércol de ganado (CM) de una granja en Mikanow, Polonia (V) sedimentos del fondo de efluentes de una antigua mina de oro (GM) en Zloty Stok, Polonia (VI) turba de un pantano de tierras bajas ( LB) en Otwock, Polonia (VII) lodos de depuradora sin tratar de una planta de tratamiento de aguas residuales (WTP) “Czajka” en Varsovia, Polonia. Las muestras semilíquidas, como los lodos de la planta agrícola, la planta de tratamiento de aguas residuales y el purín de ganado, se recolectaron luego de remover el material ubicado en las cercanías de una válvula de drenaje mediante la liberación de al menos 20 L.Asimismo para muestras más estables , como estiércol de ganado y turba, se excluyó una superficie superior y las muestras se recolectaron a una profundidad de aproximadamente 30 cm (estiércol) y 90 cm (turba). En el caso de la muestra de la mina de oro, el material se recogió como sedimentos del fondo y líquidos circundantes. Cuando fue posible (sin aireación indeseable), las muestras se mezclaron completamente. Las muestras compuestas de sólidos y líquidos se mantuvieron en condiciones nativas durante un máximo de 16 h antes de la extracción de ADN. Cuando no fue posible mantener las condiciones nativas, las muestras se almacenaron en hielo seco.

El aislamiento del ADN metagenómico se realizó de acuerdo con Dziewit et al. [18]. Brevemente, se resuspendió 1 g de una muestra de biomasa (muestra cruda de CM y LB, o material de sedimento después de la centrifugación de muestras de ABF, ABH, CS, GM, WTP) en 2 ml de un tampón de lisis (Tris-HCl 100 mM (pH 8,0) EDTA 100 mM (pH 8,0) Na 100 mM2HPO4 (pH 8,0) NaCl 1,5 M al 1% (p / v) CTAB). Luego, el ADN metagenómico se extrajo mediante un protocolo de batido de perlas de cinco pasos, combinado con congelación y descongelación. El aislamiento de ADN metagenómico se realizó por triplicado por muestra. La purificación final del ADN a partir de proteínas, sustancias húmicas y otros compuestos se llevó a cabo mediante ultracentrifugación en gradiente de densidad de CsCl. La concentración y la calidad del ADN purificado se estimaron utilizando un espectrofotómetro NanoDrop 2000c (NanoDrop Technologies) y mediante electroforesis en gel de agarosa.

Amplificación de amplicones

El ADN aislado de toda la comunidad (triplicados combinados) se utilizó como plantilla para la amplificación de los marcadores de metanogénesis, como describieron Dziewit y colaboradores [18]. Los genes amplificados incluían metil-CoM reductasa (subunidades mcrA, mcrB, mcrG1) así como subunidades de metiltransferasa específica de metanol (mtaB) y metiltransferasa específica de metilamina (mtbA). Los cebadores utilizados fueron: MLf / MLr LMCRB / RMCRB LMCRG1 / RMCRG1 LMTAB / RMTAB LMTBA / RMTAB [18, 57]. Además, como control de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la pureza de cada ADN metanogenómico, se amplificaron fragmentos de ADNr 16S bacterianos y arqueales (cebadores: SD-Arch-0349-aS-17 / SD-Arch-0786-aA-20 y SD-Bact-0341-bS-17 / SD-Bact-0785-aA-21) [58]. Todas las reacciones de PCR se realizaron en un termociclador TProfessional (Biometra) con ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion (Thermo Scientific).

Operación de reactores de laboratorio

El experimento de cultivo se llevó a cabo en biorreactores a escala de laboratorio con un volumen de trabajo de 800 mL, compuestos por botellas de vidrio GL 45 de 1 L (Schott Duran, Alemania) conectadas con depuradores Dreschel y bolsas de gas Tedlar de 1 L (Sigma, Alemania) como colector de biogás. Los reactores discontinuos se inocularon con 10 gvs L −1 de diferentes consorcios metanogénicos y suplementado con 9,6 gvs L −1 de ensilaje de maíz. Los biorreactores se llenaron con agua de manantial baja en minerales hasta el volumen de trabajo de 800 ml y luego se ajustó el pH a 7,2 con carbonato de sodio. Después de nuestros estudios preliminares, la digestión anaeróbica se realizó a 37 ° C durante 21 días durante doce pasajes. Los pases se realizaron cada 21 días, con un 20% (160 mL) del volumen de trabajo de los nuevos biorreactores (pases del 2 al 12) provenientes del pase anterior como inóculo. Además, el cultivo por lotes se dividió en dos pasos en función del aporte de sustrato: (I) 9,6 gvs L −1 de ensilaje de maíz (pasajes 1 a 7) y (II) 28,8 gvs L -1 de ensilaje de maíz (pasajes 8-12) como clasificación de las concentraciones de sustrato es un método de uso frecuente para la adaptación de comunidades microbianas. Con el fin de estabilizar los consorcios de mejor desempeño, se realizó un cultivo semicontinuo en biorreactores de dos etapas. Para ello, se submuestrearon los restos de biomasa de los pasajes 8-12 y se cultivaron posteriormente en reactores discontinuos para lograr una cantidad suficiente de consorcios para la inoculación de reactores de biogás de dos etapas y acelerar la fase inicial del proceso. El biorreactor de dos etapas se construyó de acuerdo con la patente polaca núm. PL197595 [59]. El reactor estaba equipado con agitación hidráulica y funcionó en un modo casi continuo. El ADN metagenómico que representa a los consorcios de laboratorio se aisló después de 30 días de cultivo en biorreactores de dos etapas. El procedimiento de aislamiento fue idéntico al descrito para muestras ambientales.

En todos los experimentos, los biorreactores se alimentaron con ensilado de maíz proporcionado por una granja ubicada en Mikanow, Polonia. Se transportó una gran cantidad de ensilaje de maíz desde Mikanow al laboratorio a temperatura ambiente, se dividió en porciones en bolsas de plástico y se almacenó a 4 ° C.

Métodos analíticos

Para caracterizar los perfiles físico-químicos de los ambientes estudiados, se determinaron los siguientes parámetros: contenido de metano, contenido de ácidos grasos volátiles (AGV), contenido de sólidos totales (TS), contenido de sólidos volátiles (VS), demanda química de oxígeno (DQO) y pH. Los análisis de TS y VS se realizaron de acuerdo con los métodos estándar de la Asociación Estadounidense de Salud Pública [60]. El contenido de AGV y DQO ​​se determinaron utilizando kits Nanocolor® (Macherey – Nagel, Alemania). El contenido de metano se analizó mediante cromatografía de gases GC-MS (Agilent, EE. UU.).

Preparación y secuenciación de bibliotecas

Se utilizó ADN metagenómico aislado de comunidades ambientales y de laboratorio (triplicados combinados) para la preparación de la biblioteca con un kit de preparación de muestras de ADN Illumina TruSeq de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las purificaciones de los fragmentos de ADN se realizaron con perlas Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter). Las bibliotecas se analizaron mediante electroforesis en geles de agarosa al 2% (tampón TAE 1x) con tinción GelGreen, ensayo de ADN de alta sensibilidad 2100 Bioanalyzer (Agilent) y kit de cuantificación de bibliotecas KAPA para Illumina. Las bibliotecas obtenidas se secuenciaron en la plataforma Illumina HiSeq 1500 (HiSeq Reagent Kit v2, 300 ciclos) en un modo de pares con una longitud de lectura de 150 pb.

Análisis de datos secuenciados

Las secuencias sin procesar metagenómicas se cargaron en anotaciones rápidas metagenómicas utilizando el servidor de tecnología de subsistemas (MG-RAST) [24]. Los metagenomas utilizados en este trabajo están disponibles en el marco del proyecto de adhesión mgp16315. Los perfiles taxonómicos de los consorcios se crearon contra la base de datos RefSeq y los perfiles funcionales se generaron utilizando las coincidencias con la base de datos de los subsistemas SEED con los parámetros predeterminados.

La clasificación filogenética de las anotaciones funcionales relevantes para el proceso de metanogénesis se realizó utilizando MetAnnotate [25] basado en la búsqueda de HMM y la ubicación filogenética y el enfoque del mejor resultado con parámetros predeterminados. Los perfiles HMM disponibles de las familias de proteínas PFAM [61] y TIGRFAM [62] se incluyeron en el análisis de las siguientes enzimas: formilmetanofurano deshidrogenasa (PF02663, TIGR03121, TIGR03122) formilmetanofurano-tetrahidrometanopterina formiltransferasa (PF02663) metanopterina formiltransferasa (PF019133) methenopterina norte5,norte10-metilen-tetrahidrometanopterina deshidrogenasa (PF03201) metilen-5,6,7,8-tetrahidrometanopterina deshidrogenasa (PF01993) 5,10-metilenotetrahidrometanopterina reductasa (TIGR03555) acetato quinasa (TIGR00016) fosfato acetiltransferasa (T1700) sintetransferasa (T16-acetiltransferasa) CO deshidrogenasa / acetil-CoA sintasa (PF03598, PF03599, TIGR00314, TIGR00315, TIGR00381) tetrahidrometanopterina Smetiltransferasa (PF04208, PF05440, PF04211, PF04207, PF04206, PF09472, PF04210, PF02007, TIGR01111, TIGR04166, TIGR01148, TIGR01112, TIGR01113, TIGR02507, TIGR01114, TIGR00314, TIGR00315, TIGR00381), metanol metiltransferasa (PF12176) metilamina metiltransferasa (PF05369, PF06253, PF09505, TIGR02368, TIGR02369) metil-com reductasa (PF02249, PF02745, PF02241, PF02783, PF04609, PF02505, PF02240, TIGR03256, TIGR03257, TIGR03259, TIGR03260, TIGR03264) COB-coM heterodisulfide reductasa (TIGR03288, TIGR03290).

Las asignaciones filogenéticas de las secuencias de metanogénesis se enumeran en Tax-Fun MetAnnotate, archivo adicional 2. Para una mejor legibilidad, se combinaron las anotaciones clave de metanogénesis (ver Tax-Fun MetAnnotate combinado, archivo adicional 2) y se presentaron como mapas de calor creados con el análisis estadístico del perfil metabólico Software (SELLO) [63].

La diversidad taxonómica (índice de Shannon-Wiener, H) se calculó utilizando la función de diversidad del paquete vegano en R [64]. Eveness (J, índice de Pielou) se calculó usando la fórmula J = H / log (S), donde H es el índice de Shannon-Wiener y S es la riqueza de especies para la muestra dada. Las distancias de Bray-Curtis se calcularon utilizando la función vegdist del paquete vegano y se procesaron utilizando la función metaMDS para producir gráficos de escala multidimensional (MDS).


8.5: Métodos de clasificación e identificación de microorganismos - Biología

  • El análisis del genoma se puede utilizar para la identificación microbiana.
  • o para escribir más allá del nivel de especie
  • Requiere una inversión significativa en equipos de capital y capacitación de técnicos.
  • La secuenciación del genoma completo (WGS) se está convirtiendo rápidamente en un método de tipificación factible para los laboratorios de microbiología.

Desde que los microorganismos se aislaron y cultivaron por primera vez en cultivo puro, los laboratorios de microbiología han necesitado caracterizar los aislados para poder diferenciarlos entre sí. Los esquemas que se pueden utilizar para describir las características de un aislado microbiano son esenciales en todas las ramas de la microbiología y su desarrollo y refinamiento han sido constantes. El advenimiento de la biología molecular en la década de 1980 contribuyó con un conjunto de nuevas y poderosas herramientas que han ayudado a los microbiólogos a detectar las variaciones más pequeñas dentro de las especies microbianas e incluso dentro de las cepas individuales. Esto ha añadido una dimensión completamente nueva a una ciencia que estaba en peligro de verse limitada por su dependencia de las técnicas tradicionales de laboratorio.

De hecho, la tecnología ha progresado mucho más allá del nivel que necesitan la mayoría de los laboratorios de rutina, donde es probable que la identificación de las especies de cualquier aislamiento sea suficiente. Es más probable que la distinción entre diferentes cepas de la misma especie (tipificación) sea de valor en un laboratorio de investigación o en campos más especializados, como la epidemiología. Sin embargo, los métodos y equipos diseñados para ayudar con la identificación y tipificación de especies están disponibles comercialmente para una variedad de aplicaciones.

Identificación de especies La identificación de un aislado microbiano a nivel de especie solo equivale a una caracterización parcial del aislado, pero sigue siendo una información muy útil. El conocimiento de la especie permite al laboratorio acceder al cuerpo de conocimientos que existe sobre esa especie. Por ejemplo, ¿es un patógeno humano o animal conocido, o es probable que se multiplique en un producto y cause deterioro? La identificación de la especie también puede proporcionar una pista sobre la fuente de un contaminante.

El número de géneros y especies reconocidos de microorganismos crece constantemente y este proceso se ha acelerado desde que los microbiólogos adquirieron la capacidad de investigar las relaciones genéticas entre diferentes aislamientos. A finales de 2013, The Lista de nombres procariotas con posición en la nomenclatura (LPSN) contenía casi 16.000 taxones; en 1980 había poco más de 2.300. A pesar de esto, todavía es posible que los laboratorios de microbiología de rutina identifiquen muchos aislamientos por género y, a menudo, por especie utilizando un número notablemente pequeño de pruebas clave. Los esquemas de identificación que utilizan características como la morfología de colonias y células, la reacción de Gram y otras características de tinción, los requisitos nutricionales y físicos para el crecimiento, las características metabólicas y los factores de patogenicidad se han desarrollado y mejorado durante muchas décadas hasta el punto en que incluso los laboratorios pequeños pueden identificar los aislamientos. a nivel de especie utilizando procedimientos de prueba tradicionales bastante simples.

Muchas de estas pruebas, especialmente las relacionadas con las características metabólicas, se han empaquetado en kits fáciles de usar e incluso en sistemas automatizados, equipados con bases de datos internas, con las que se pueden comparar los aislamientos para obtener una identificación precisa. En la mayoría de los casos, estos kits y sistemas proporcionan un resultado en el mismo día laborable o al día siguiente, y logran ahorros muy importantes en materiales y tiempo del técnico, reemplazando en gran medida la necesidad de realizar pruebas manuales en aislamientos individuales.

Las características utilizadas en los esquemas tradicionales de identificación microbiana son todos aspectos observables de la estructura y función del organismo. En otras palabras, son características fenotípicas y son productos de la expresión génica. Al observar directamente el genoma microbiano en sí, es posible identificar una especie utilizando sus características genotípicas. Por ejemplo, muchas especies bacterianas pueden identificarse secuenciando secciones específicas de ADN ribosómico (el gen de ARNr 16S se usa con mayor frecuencia) después de la amplificación por PCR y luego comparando los resultados con las secuencias almacenadas en una base de datos relacionada.

El sistema disponible comercialmente basado en esta tecnología es una valiosa herramienta complementaria a otras tecnologías de identificación de rutina. Sin embargo, la identificación basada en el gen ARNr 16S no es infalible. De hecho, como el tramo de secuencia analizado es una sección reducida del genoma completo y la variabilidad de este marcador es baja, muchas especies diferentes comparten la misma secuencia 16. Por ejemplo, algunos Bacilo las especies que pueden diferenciarse fácilmente por otros medios comparten exactamente las mismas secuencias de ARNr 16S. Además, la precisión del sistema depende de la calidad de la base de datos con la que se compara la secuencia.

Mecanografía

Hay varias razones por las que puede ser necesario caracterizar un aislado microbiano más allá del nivel de especie y determinar su subespecie, cepa o incluso subcepa. Por ejemplo:

  • Relacionar casos individuales con un brote de enfermedad infecciosa.
  • Establecer una asociación entre un brote de intoxicación alimentaria y un vehículo alimentario específico.
  • Estudiar variaciones en la patogenicidad, virulencia y resistencia a los antibióticos de cepas individuales dentro de una especie.
  • Para rastrear la fuente de contaminantes dentro de un proceso de fabricación.
  • Estudiar la ecología microbiana de comunidades complejas, como las biopelículas.
  • Caracterizar microorganismos con importantes aplicaciones industriales.

La tipificación no es en absoluto nueva y ha sido posible tipificar algunos aislamientos sobre la base de pruebas serológicas durante décadas. El ejemplo obvio es el esquema de Kauffmann-White para Salmonella. Solo hay dos especies de Salmonella, pero alrededor de 2.500 serovares, todos tipificables por la reacción entre anticuerpos y antígenos específicos en la pared celular y los flagelos. La tipificación de fagos también se ha utilizado durante muchos años para tipificar ciertos patógenos bacterianos. Otros sistemas de tipificación tradicionales incluyen biotipado (basado en características bioquímicas detalladas), tipificación de bacteriocina y tipificación de proteínas.

Todas estas son técnicas de tipificación fenotípica que se basan en características expresadas y algunas se han desarrollado en sistemas sofisticados con una variedad de aplicaciones. Por ejemplo, rápido, semiautomático Salmonela Se han desarrollado sistemas de serotipificación y la tipificación de las proteínas celulares extraídas se puede llevar a cabo utilizando técnicas de espectrometría de masas como MALDI-TOF (Ionización por desorción láser asistida por matriz - Tiempo de vuelo). El análisis de ésteres metílicos de ácidos grasos celulares (FAME) mediante cromatografía de gases también se ha utilizado para tipificar bacterias con éxito. Algunas de estas técnicas se han desarrollado en sistemas de mecanografía comerciales que incluyen bases de datos de perfiles y software para ayudar con la mecanografía precisa.

Genotipado El desarrollo de técnicas para el estudio directo del genoma microbiano, en particular la amplificación por PCR, ha llevado a una explosión relativa de métodos publicados para genotipar microorganismos durante los últimos 25 años. Al mismo tiempo, el valor de la genotipificación ha sido ampliamente reconocido, no solo en microbiología clínica, sino también en el sector farmacéutico. La Administración de Drogas y Alimentos de los EE. UU. (FDA) ha destacado el valor de la genotipificación para fines de investigación, por lo tanto, "Estos métodos son especialmente valiosos para las investigaciones de fallas (por ejemplo, prueba de esterilidad: contaminación del relleno del medio)". Se ha desarrollado una multiplicidad de técnicas para analizar el ADN extraído de células microbianas, a menudo denominadas "huellas dactilares del ADN", para la tipificación y algunos de los métodos más utilizados se describen a continuación.

1. Electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE): una técnica que permite la separación electroforética de un número reducido de fragmentos de restricción de ADN grandes producidos mediante enzimas de restricción para generar una huella genética altamente discriminatoria. Ampliamente utilizado y sigue siendo el método de elección en la tipificación de patógenos bacterianos humanos y la investigación de brotes de enfermedades. El PFGE es relativamente costoso y requiere al menos tres días para obtener un resultado. El grado de discriminación también depende de la elección de las enzimas de restricción.

2. Tipificación de secuencias multilocus (MLST): la secuenciación de fragmentos de ADN de 400-500 pares de bases en siete genes conservados diferentes permite detectar pequeñas variaciones dentro de una especie. Consume mucho tiempo y es costoso, pero puede ser muy discriminatorio si los genes se eligen correctamente.

3. Análisis multilocus de número variable de repeticiones en tándem (MLVA): una técnica relacionada con MLST basada en la amplificación por PCR y la secuenciación de secuencias de ADN repetitivas que muta rápidamente llamadas repeticiones en tándem. El resultado es un patrón MLVA característico de la cepa bacteriana bajo investigación. MLVA es más rápido y más fácil de realizar que MLST, pero existen problemas de reproducibilidad y validación.

4. Ribotipificación: esta técnica se basa en la estabilidad relativa de los genes de ARNr 16S y 23S que codifican el ARN ribosómico. Los genes se cortan utilizando enzimas de restricción y los fragmentos de ADN resultantes se separan por electroforesis. La huella dactilar resultante se visualiza mediante sondas fluorescentes. Ribotyping se ha desarrollado en un sistema automatizado que está disponible comercialmente con bases de datos dedicadas (Riboprinter®). Es rápido (& lt24 horas para resultar), reproducible y funciona para una amplia gama de especies bacterianas, pero es relativamente costoso en términos de equipo.

5. PCR basada en secuencias repetitivas (rep-PCR): los genomas bacterianos y fúngicos contienen numerosas secuencias de ADN repetitivas no codificantes que separan secuencias de copia única más largas y su disposición varía entre las cepas. La técnica rep-PCR se basa en amplificar estas secuencias repetitivas para producir amplicones de longitud variable que pueden separarse mediante electroforesis dando una huella dactilar compuesta por bandas que emiten fluorescencia a diferentes intensidades después de unirse con un tinte intercalante. Rep-PCR también se ha desarrollado en un sistema de tipificación comercial (DiversiLab ™) que proporciona resultados rápidos y utiliza un software dedicado para ayudar a la tipificación. El sistema se usa ampliamente para tipificar patógenos humanos.

6. Microarrays de ADN: un microarray es una colección de sondas de ADN unidas en un patrón ordenado sobre una superficie sólida. Estas sondas pueden usarse para detectar la presencia de secuencias complementarias en aislados bacterianos y, por tanto, pueden detectar genes marcadores en cepas bacterianas específicas. Alere ™ Technologies GmbH ha desarrollado microarrays en un sistema de tipificación comercial para una serie de patógenos bacterianos en la forma de sus plataformas Array Tube y Array Strip.

Secuenciación del genoma completo

All of the genotyping methods mentioned above have their limitations and ideally one would sequence the entire genome of a microbial isolate to provide definitive typing. Until quite recently, this would have been very costly and taken years to complete, but the advent of next-generation sequencing (NGS) technology, such as the Ion Torrent™ platform from Life Technologies and the Illumina sequencing system, make whole genome sequencing (WGS) within days a practical option. Now that high-throughput bench-top NGS instruments like Life Technologies' Ion PGM™ and the Illumina NextSeq 500 are available, WGS is within the reach of smaller clinical microbiology and research labs. The costs of NGS are falling and an entire bacterial genome can now be sequenced for about the same price as MLST typing using conventional PCR/Sanger sequencing.

The main problem with WGS at present is the difficulty of interpreting the huge amount of data generated and identifying and extracting the genetic information that is important from a typing point of view. The rapidly evolving discipline of Bioinformatics promises to provide the solution to this problem by developing computer software to analyse sequencing data and building interactive databases where data can be stored and accessed. Some of these databases are available on-line on an open access basis for researchers to use. For example, the PubMLST website hosted by Oxford University’s Department of Zoology holds a growing collection of more than 50 MLST databases for molecular typing and microbial genome diversity.

WGS has already been used to investigate the genetics of human pathogens involved in outbreaks and promises to revolutionise the process in the near future. For example, during the foodborne German E. coli O104:H4 outbreak in 2011, the entire genome of the outbreak strain was sequenced within three days, confirming the findings of other typing methods and adding valuable information about the likely origin of the strain and its relationship with other isolates. The potential benefits of WGS mean that it is almost certain to replace PFGE as the gold standard for pathogen typing in the near future.

Outsourcing of Species Identification and Typing
Even with the development of less expensive sequencing instruments, unless a laboratory has a specific requirement for identification and typing of large numbers of isolates on a regular basis, modern molecular techniques may not be appropriate for smaller routine operations. Capital and operating costs are relatively high unless economies of scale can be achieved and it may be more cost effective to outsource occasional identification and typing needs. Fortunately, a number of commercial laboratories offer these services, especially genotype-based identification and typing, which is still beyond the scope of many routine laboratories. Outsourcing has the benefit of allowing labs to take advantage of the latest identification and typing methods to fully characterize isolates, without the need for capital investment and staff training. For example, Charles River's Accugenix® cGMP-compliant Microbial ID and Strain Typing service offers identification and typing of bacterial and fungal environmental isolates using a combination of techniques, including 16s rDNA sequencing and MALDI-TOF. The service also includes access to the Accugenix Customer Web Portal, which provides a secure data management tool to track and trend specific organisms for monitoring purposes.


How to Identify Bacteria

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In most cases, identifying bacteria is done through a process of elimination to narrow down choices until you get to the right one. Doing it correctly is an incredibly complex process, partially because there are so many types—some scientists estimate the number of species of bacteria could be over a billion! Even with so many to choose between, identifying is especially important in clinical and medical settings. To make matters easier, there are standards for identifying that come from using staining techniques to examine the bacteria's appearance and observing the bacteria's reactions to different conditions.


  • 1. Is it green or does it have green parts?
    • Yes - go to 2
    • No - go to 3
    • Single-celled? go to 6
    • Multicellular? Plantae. Look for cell walls, internal structure. In the compound microscope you might be able to see chloroplasts.
    • Single-celled - go to 4
    • Multicellular (Look for complex or branching structure, appendages) - go to 5
    • Yes - Protista. You should be able to see at least a nucleus and/or contractile vacuole, and a definite shape. Movement should be present, using cilia, flagella, or amoeboid motion. Cilia or flagella may be difficult to see.
    • No - Monera. Should be quite small. May be shaped like short dashes (rods), small dots (cocci), or curved or spiral shaped. The largest them that is commonly found in freshwater is called Spirillum volutans. It is spiral shaped, and can be nearly a millimeter long. Except for Spirillum, it is very difficult to see Monerans except in a compound microscope with special lighting.
    • Yes - Animalia. Movement can be by cilia, flagella, or complex, involving parts that contract. Structure should be complex. Feeding activity may be obvious.
    • No - Fungus. Should be branched, colorless filaments. May have some kind of fruiting body (mushrooms are a fungus, don't forget). Usually attached to some piece of decaying matter - may form a fuzzy coating on or around an object. In water, some bacterial infections of fish and other animals may be mistaken for a fungus.

    Remember, the more you observe the organism, the more sure you can be. Many living things have stages that make them resemble members of another kingdom.


    Ver el vídeo: Métodos fenotípicos de identificación de microorganismos. (Mayo 2022).