Información

Género del cultivo celular BEAS-2B

Género del cultivo celular BEAS-2B


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Reconozco algunos patrones interesantes al analizar la metilación del ADN de las células BEAS-2B. ¿Alguien sabe si el cultivo celular es femenino o masculino? Ya le pregunté al soporte al cliente de Sigma Aldrich sin éxito.

La información en el sitio web oficial solo menciona a "individuos no cancerosos" como organismos fuente.

http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/95102433?lang=de®ion=DE


Lo más probable es que la línea celular sea genéticamente masculina. En el sitio en inglés (EE. UU.), El Descripción La caja tiene varias secciones, de las cuales una es Perfil de ADN. Allí, enumera la amelogenina comoX, Y. Este gen se encuentra en los cromosomas X e Y (AMELX y AMELY, respectivamente), que tienen distintas diferencias de secuencia detectables por PCR. A menudo se utiliza en Ayudar para determinar el género de muestras desconocidas en el ámbito de la ciencia forense, no es 100% exacto, por lo que también se realizan otras pruebas genéticas (como para SRY).


El potencial oxidativo de nanopartículas de plata y oro con carga diferente en tres tipos de células epiteliales de pulmón humano

Fondo: Se ha demostrado que la funcionalización de nanopartículas (NP) afecta su toxicidad celular. Para estudiar esto, se sintetizaron, caracterizaron y probaron NP de plata (Ag) y oro (Au) funcionalizadas de manera diferente utilizando sistemas de células epiteliales pulmonares.

Métodos: Se recubrieron NP de Ag y Au monodispersas con un intervalo de tamaño de 7 a 10 nm con citrato de sodio o quitosano, lo que dio como resultado cargas superficiales de -50 mV a +70 mV. La citotoxicidad inducida por NP y el estrés oxidativo se determinaron utilizando células A549, células BEAS-2B y células epiteliales pulmonares primarias (células NHBE). Se realizaron mediciones de TEER y tinción de inmunofluorescencia de uniones estrechas para probar las características de crecimiento de las células. La citotoxicidad se midió por medio del CellTiter-Blue® y el ensayo de lactato deshidrogenasa y se midió la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) celulares y libres de células usando el ensayo DCFH-DA.

Resultados: Se mostraron diferentes características de crecimiento en los tres tipos de células utilizados. Las células A549 crecieron en una monocapa confluente, las células BEAS-2B crecieron en una multicapa y las células NHBE no formaron una capa confluente. Las células A549 fueron menos susceptibles a las NP, independientemente de la funcionalización de las NP. La citotoxicidad en las células BEAS-2B aumentó cuando se expusieron a NP de Au con carga positiva alta (+ 65-75 mV). La mayor citotoxicidad se observó en las células NHBE, donde tanto las NP de Ag como las de Au con una carga superior a +40 mV indujeron citotoxicidad. La producción de ROS fue más prominente en las células A549 donde las NP de Au (+ 65-75 mV) indujeron la mayor cantidad de ROS. Además, las mediciones de ROS sin células mostraron un aumento significativo en la producción de ROS con un aumento en el recubrimiento de quitosano.

Conclusiones: La funcionalización con quitosano de las NP, con las altas cargas superficiales resultantes, juega un papel importante en la toxicidad de las NP. Las NP de Au, que se ha demostrado que son inertes y, a menudo, no citotóxicas, pueden volverse tóxicas al recubrirse con ciertas moléculas cargadas. En particular, estos efectos dependen del material del núcleo de la partícula, el tipo de célula utilizada para las pruebas y las características de crecimiento de estos sistemas de modelos de cultivo celular.


La senescencia de las células epiteliales induce fibrosis pulmonar a través de la activación de fibroblastos mediada por nanog

La fibrosis pulmonar idiopática (FPI) es una enfermedad pulmonar crónica y progresiva estrechamente relacionada con el envejecimiento. Las características patológicas de la FPI incluyen senescencia de células epiteliales y abundantes focos de fibroblastos pulmonares altamente activados. Sin embargo, queda por dilucidar el mecanismo subyacente entre la senescencia de las células epiteliales y la activación de los fibroblastos pulmonares. En nuestro estudio, demostramos que Nanog, como gen de pluripotencia, juega un papel fundamental en la activación de los fibroblastos pulmonares. En la progresión de la FPI, las células epiteliales senescentes podrían contribuir a la activación de los fibroblastos pulmonares mediante el aumento de la expresión del fenotipo secretor asociado a la senescencia (SASP). Además, encontramos que los fibroblastos pulmonares activados exhibían una activación aberrante de la señalización de Wnt / β-catenina y una expresión elevada de Nanog. Un estudio adicional reveló que la activación de la señalización de Wnt / β-catenina era responsable del fenotipo Nanog inducido por células epiteliales senescentes en fibroblastos pulmonares. Se observó que la β-catenina se unía al promotor de Nanog durante la activación de los fibroblastos pulmonares. La inhibición dirigida de la senescencia de las células epiteliales o Nanog podría suprimir eficazmente la activación de los fibroblastos pulmonares y afectar el desarrollo de la fibrosis pulmonar, lo que indica un potencial para la exploración de nuevas estrategias antifibróticas.

Palabras clave: senescencia de células epiteliales fibrosis pulmonar idiopática (FPI) activación de fibroblastos pulmonares nanog señalización wnt / β-catenina.

Declaracion de conflicto de interes

CONFLICTOS DE INTERÉS: Los autores declaran no tener intereses económicos en competencia.


La exposición a bacterias respiratorias comunes altera la respuesta epitelial de las vías respiratorias a la infección viral posterior

Fondo: La colonización de las vías respiratorias con posibles bacterias patógenas se observa en una serie de enfermedades respiratorias crónicas, como la EPOC o la fibrosis quística. Las infecciones por virus respiratorios son desencadenantes conocidos de exacerbaciones de estas enfermedades. Aquí investigamos si la preexposición a bacterias altera la respuesta de las células epiteliales pulmonares a la posterior infección viral.

Métodos: Se expusieron células epiteliales bronquiales (células BEAS-2B y células epiteliales bronquiales primarias) a Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa o Streptococcus pneumoniae inactivadas por calor y posteriormente se infectaron con virus respiratorio sincitial (VSR), adenovirus humano tipo 2 o influenza B. Niveles de pro -Citocinas inflamatorias, replicación viral y expresión de receptores de reconocimiento de patrones se determinaron en sobrenadantes de cultivo y / o lisados ​​celulares.

Resultados: La exposición de las células BEAS-2B a H. influenzae antes y durante la infección por RSV aumentó sinérgicamente la liberación de IL-6 (aumento por encima del efecto aditivo calculado a las 72 h: 56% ± 3%, media ± SEM) e IL-8 (53 % ± 12%). Este efecto se mantuvo incluso cuando las bacterias se eliminaron antes de la infección viral y no se asoció con una replicación viral mejorada ni se vinculó a una mayor expresión de receptores clave de reconocimiento de patrones. P. aeruginosa aumentó la liberación de citocinas inflamatorias en un grado similar, pero solo si las bacterias también estaban presentes durante la infección viral. S. pneumoniae no mejoró la liberación de citocinas inducida por RSV. Sorprendentemente, la infección por adenovirus redujo significativamente la liberación de IL-6 en las células expuestas a cualquiera de las tres cepas bacterianas probadas en una media de más del 50%. La infección con influenza B, por otro lado, no afectó la producción de citocinas en las células BEAS-2B expuestas a las diferentes cepas bacterianas.

Conclusión: La preexposición de las células epiteliales a las bacterias altera la respuesta a la infección viral posterior dependiendo de los tipos de patógenos implicados. Estos hallazgos destacan la complejidad de las interacciones del microbioma en las vías respiratorias, lo que posiblemente contribuya a la susceptibilidad a las exacerbaciones y al curso natural de las enfermedades de las vías respiratorias.

Palabras clave: Coinfección bacteriano-viral Inflamación Infección polimicrobiana.


Evaluación de la citotoxicidad y genotoxicidad in vitro de nanopartículas de aleación de cobre y zinc en células epiteliales pulmonares humanas

En el presente estudio, se investigó el efecto citotóxico y genotóxico in vitro de las nanopartículas de aleación de cobre y zinc (Cu-Zn ANP) sobre las células epiteliales del pulmón humano (BEAS-2B). Se utilizaron la prueba XTT y el ensayo clonogénico para determinar los efectos citotóxicos. El modo de muerte celular y las formaciones de especies reactivas de oxígeno intracelular se analizaron utilizando ensayos M30, M65 y ROS Elisa. Los efectos genotóxicos se evaluaron utilizando ensayos de focos de micronúcleos, cometas y γ-H2AX. Los ANP de Cu-Zn se caracterizaron mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM), dispersión dinámica de luz (DLS) y mediciones de potencial zeta. La caracterización de los ANP de Cu-Zn mostró un tamaño medio de 200 nm y un potencial zeta de -22 mV. Los análisis de TEM revelaron además la localización intracelular de los ANP de Cu-Zn en el citoplasma en 24 h. El análisis de los recuentos de focos de micronúcleos, cometas y γ-H2AX mostró que la exposición a los ANP de Cu-Zn indujo significativamente daño cromosómico, así como daño al ADN monocatenario y bicatenario en las células BEAS-2B. Nuestros resultados indicaron además que la exposición a Cu-Zn ANP indujo significativamente la formación de ROS intracelulares. La evaluación de las relaciones M30: M65 sugirió que la muerte celular se debió predominantemente a necrosis.

Palabras clave: Células BEAS-2B Nanopartículas de aleación de cobre-zinc Citotoxicidad Genotoxicidad Nanotoxicología.


Modelado del epitelio respiratorio in vitro

Puede usarse una variedad de tipos de células para modelar el sistema respiratorio humano, incluidas las líneas de células respiratorias inmortalizadas (por ejemplo, células BEAS-2B y 16HBE14o-) y células primarias de animales o donantes humanos. Aunque el uso de líneas celulares inmortalizadas y células primarias de animales es común, los datos generados usando estos modelos no son directamente aplicables al sistema humano. 5 Es posible el cultivo sumergido de células epiteliales bronquiales humanas primarias; sin embargo, las células de este sistema no logran diferenciarse mucociliar. Para recapitular el fenotipo mucociliar pseudoestratificado observado in vivo, se deben cultivar células epiteliales bronquiales humanas primarias (HBEC) en la interfaz aire-líquido (ALI Figura 1). 6

La característica definitoria del cultivo de ALI es que la superficie basal de las células está en contacto con el medio de cultivo líquido, mientras que la superficie apical está expuesta al aire. Un enfoque común es sembrar células en la membrana permeable de un inserto de cultivo celular, que inicialmente se suministra con medio de cultivo a los compartimentos apical y basal (Figura 1A). Una vez que se alcanza la confluencia, las células se someten a & lsquoair-lift & rsquo, donde el medio se suministra solo a la cámara basal (Figura 1B). Esta configuración imita las condiciones que se encuentran en las vías respiratorias humanas e impulsa la diferenciación hacia un fenotipo mucociliar.

Figura 1. Esquema de cultivo de interfaz aire-líquido

Esquema de cultivo sumergido (A) y de interfaz aire-líquido (B) de células epiteliales bronquiales humanas primarias cultivadas utilizando insertos de cultivo poroso.


Disponibilidad de datos y materiales

El conjunto de datos de secuenciación de ARNm generado para este estudio se puede encontrar en la base de datos de Sequence Read Archive (SRA) (https://trace.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/) con el identificador SRP181756. Los conjuntos de datos GEO analizados para este estudio se pueden obtener de la base de datos GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi) con el identificador correspondiente como se muestra en el archivo adicional 1: Tabla S1. El conjunto de datos TCGA LUAD analizado para este estudio se puede obtener de UCSC Xena (https://xenabrowser.net/datapages/).


Estudios de caso relacionados

Clayton, J. A. (2016). Estudiar ambos sexos: un principio rector de la biomedicina. FASEB J., 30, 519–524.

Docherty, J. R., Stanford, S. C., Panattieri, R. A., Alexander, S. P., Cirino, G., George, C. H.,. Y Sobey, C. G. (2019). Sexo: un cambio en nuestras pautas para los autores para garantizar que esta ya no sea una variable experimental ignorada. Revista británica de farmacología, 176(21). https://doi.org/10.1111/bph.14761

Fausto-Sterling, A. (2005). Lo básico del sexo, parte 1: sexo y género. Signos: Revista de mujeres en la cultura y la sociedad, 30 (2), 1491-1527.

Mauvais-Jarvis, F., Arnold, A. P. y Reue, K. (2017). Una guía para el diseño de estudios preclínicos sobre diferencias sexuales en el metabolismo. Metabolismo celular, 25 (6), 1216-1230.

Moerman, C., Deurenberg, R. y Haafkens, J. (2009). Localización de evidencia específica de sexo en preguntas clínicas en MEDLINE: un filtro de búsqueda para usar en OvidSP. Metodología de investigación médica de medicina central de BioMed, 9 (25).

Messing, K., Padre, L., St-Pierre, J., Vaillancourt, C. y Mergler, D. (2014). Primeros pasos para integrar consideraciones de género y sexo en la investigación biomédica experimental básica. Revista de la Federación de Sociedades Americanas de Biología Experimental, 28, 4-13.

Oertelt-Prigione, S., Parol, R., Krohn, S., Preissner, R. y Regitz-Zagrosek, V. (2010). El análisis de la investigación sobre sexo y género revela un aumento común de publicaciones y marcadas diferencias entre disciplinas. Medicina central de BioMed, 8, 70-80.

Pardue, M. y Wizemann, T. (Eds.) (2001). Explorando las contribuciones biológicas a la salud humana: ¿Importa el sexo? Washington D.C .: Prensa de la Academia Nacional.

Penaloza, C., Estevez, B., Orlanski, S., Sikorska, M., Walker, R., Smith, C., Smith, B., Lockshin, R. y Zakeri, Z. (2009). El sexo de la célula dicta su respuesta: expresión genética diferencial y sensibilidad al estrés que induce la muerte celular en células masculinas y femeninas. Revista de la Federación de Sociedades Americanas de Biología Experimental, 23 (6), 1869-1879.

Planchard, D., Loriot, Y., Aoubar, A., Commo, F. y Soria, J. (2009). Cáncer de pulmón en mujeres: expresión diferencial de biomarcadores en hombres y mujeres. Seminarios en Oncología, 36 (6), 553-565.

Rich-Edwards, J. W., Kaiser, U. B., Chen, G. L., Manson, J. E. y Goldstein, J. M. (2018). Diseño de investigación sobre diferencias de sexo y género para estudios básicos, clínicos y de población: elementos esenciales para los investigadores. Revisiones endocrinas, 39 (4), 424-439.

Ritz, S. Antle, D., Côté, J., Deroy, K., Fraleigh, N., Shah, K., McCormack, C. y Bradbury, N. (2014). ¿Conoce el sexo de sus células? Revista estadounidense de fisiología - Fisiología celular, 306, C3-C18.

Tannenbaum, C., Schwarz, J., Clayton, J., de Vries, G. y Sullivan, C. (2016). Evaluar el sexo como variable biológica en la investigación preclínica: el diablo en los detalles. Biología de las diferencias sexuales, 7 (1), 1.

Taylor, K., Vallejo-Giraldo, C., Schaible, N., Zakeri, R. y Miller, V. (2011). Reporte del sexo como variable en estudios cardiovasculares usando células cultivadas. Biología de las diferencias sexuales, 2 (11), 1-7.

Veilleux, A. y Tchernof, A. (2012). Diferencias por sexo en la distribución de la grasa corporal. En Symonds, M. (Ed.), Biología del tejido adiposo (págs. 123-166). Nueva York: Springer Science and Business Media.

Wizemann, T. (Ed.) (2012). Informes de investigaciones científicas por sexo: resumen de un taller. Washington, D.C .: National Academies Press.

Yoon, D., Mansukhani, N., Stubbs, V., Helenowski, I, Woodruff, T. y Kibbe, M. (2014). El sesgo sexual existe en la ciencia básica y la investigación quirúrgica traslacional. Cirugía, 156 (3), 508-516.


Discusión

En este estudio, la radiación CLDR de 125 I semillas condujo a una inhibición del crecimiento celular A549 y H1299 más notable que la radiación de rayos γ 60 Co HDR, lo cual es consistente con los resultados de otras investigaciones [21] sin embargo, la diferencia no fue significativa en 2 Gy para los dos tratamientos de radiación. También vimos claramente que la radiosensibilidad era A549 & gtH1299 & gtBEAS-2B, lo que está de acuerdo con los resultados informados por Masahiko Nishizaki et al. [22]. Nuestros resultados también sugirieron que las células BEAS-2B son resistentes a la irradiación en relación con las células A549 y H1299.

Es bien sabido que cada fase del ciclo celular contiene puntos de control que permiten detener la progresión del ciclo celular para activar los mecanismos de reparación o activar la cascada apoptótica celular y la muerte celular después del daño del ADN inducido por IR u otros factores [23, 24]. En nuestro estudio, significativo G1 La detención de las células A549 fue inducida más por la radiación CLDR de semillas de 125 I que por la radiación de rayos γ de 60 Co HDR a 4, 6 y 8 Gy, lo que es consistente con otros estudios que evaluaron células de cáncer de páncreas y próstata [25, 26]. Sin embargo, debemos señalar que también hubo algunas diferencias. Por ejemplo, Junjie Wang informó que la radiación CLDR de 125 I semillas condujo a G a largo plazo2/ M detención de células A549 a 4 Gy con una tasa de dosis inicial de 2,77 cGy / h [21], que contrasta con la significativa G1 paro con una tasa de dosis inicial de 18,32 cGy / h observado en nuestro estudio. La diferencia en la tasa de dosis inicial y una variedad de otros factores, como el estado de las células, pueden explicar, al menos en parte, esta diferencia. Se desconocen los mecanismos específicos que subyacen a este fenómeno. Sin embargo, hubo G2/ M detención en células H1299 y BEAS-2B que reciben el mismo tratamiento. Geyer y sus compañeros de trabajo han informado que G1 arresto en celdas A549 y G2/ M detención en células H1299 bajo las mismas condiciones de irradiación y sin G1 Se observó detención en células tratadas con IR que carecen de p53 [27]. Estos resultados son similares a los resultados del presente estudio. Aunque hubo una significativa G2/ M detención de células BEAS-2B normales, la extensión de G2La detención de / M causada por las dos fuentes de radiación fue similar, lo que concuerda con la capacidad de formación de colonias observada en el presente estudio.

La apoptosis, también conocida como muerte celular programada, es el principal mecanismo de muerte celular inducida por IR. Para mantener la integridad genómica, se activan múltiples vías de señalización de reparación del ADN y controles de puntos de control del ciclo celular en respuesta al daño inducido por la radiación, pero si estos procesos de reparación fallan o se acumula un daño irreparable hasta cierto punto, se induce la apoptosis celular o la muerte celular [10]. . Según nuestras observaciones, la radiación CLDR de 125 I semillas condujo a un porcentaje más alto de células apoptóticas A549 y H1299 que la radiación de rayos γ de 60 Co HDR, mientras que la proporción apoptótica de las células BEAS-2B inducida por las dos fuentes de radiación en 2, 4 , 6 y 8 Gy fue similar a la de las células de control, lo que coincidió con otros estudios [19]. En nuestro estudio, la diferencia en los resultados obtenidos con la radiación CLDR de semillas de 125 I y la radiación HDR de rayos gamma de 60 Co puede parecer sorprendente. En el caso de los rayos X o γ, la tasa de dosis es uno de los principales factores que determinan las consecuencias biológicas de una dosis absorbida dada, ya que a medida que se reduce la tasa de dosis y se prolonga el tiempo de exposición, el efecto biológico de la dosis administrada generalmente se reduce [28] . Sin embargo, cuando la tasa de dosis se reduce a menos de 1 Gy / h, la disminución de la tasa de dosis podría resultar en una mayor destrucción de células. Este efecto se ha denominado efecto de tasa de dosis inversa e hiperradiosensibilidad a dosis bajas (HRS) [29 ].

En nuestro estudio, los resultados obtenidos usando un ensayo de supervivencia clonogénica, análisis del ciclo celular y análisis de apoptosis celular usando FCM sugirieron que las diferencias entre el grupo de tratamiento de radiación probado y el grupo de control en blanco no eran significativas en 2Gy, por lo tanto, nos enfocamos en el potencial molecular mecanismos subyacentes al efecto antiproliferativo más distinto de la radiación CLDR de semillas de 125 I en comparación con la radiación de rayos γ de 60 Co HDR a 4 y 8 Gy.

La apoptosis ocurre más comúnmente a través de la vía intrínseca dependiente de mitocondrias, que es un proceso complejo que involucra una serie de proteínas relacionadas con la apoptosis, incluidas caspasa-3, PARP, Bax y Bcl-2 et al. [11]. La función de la proteína Bcl-2, también conocida como proteína pro-supervivencia Bcl-2, es inhibir la apoptosis y prolongar la supervivencia celular. La sobreexpresión de la proteína Bcl-2 se asocia con una mala respuesta al tratamiento del cáncer de pulmón [30]. Bax, una proteína proapoptótica de la familia Bcl-2, juega un papel clave en la mediación de la respuesta apoptótica [12]. La proporción de Bcl-2 a Bax se considera comúnmente un determinante en el inicio de la apoptosis [31]. La proteína caspasa-3 es la proteína ejecutora más importante. La función de PARP es la reparación rutinaria del daño del ADN y PARP es el sustrato principal de la caspasa-3. Por lo tanto, la activación de las proteínas caspasa-3 y PARP se consideraba comúnmente el sello bioquímico de la apoptosis [30, 32]. En nuestro estudio, el desequilibrio entre la proteína Bcl-2 y la proteína BAX y los niveles más altos de las proteínas caspasa-3 escindida y PARP escindida podrían haber promovido en parte el aumento de la apoptosis observada en las células A549 y H1299 después de la irradiación con semillas de 125 I en comparación con Rayos γ de 60 Co. Para que una célula sobreviva al daño letal del ADN, los DSB causados ​​por la exposición a la irradiación deben detectarse rápidamente y deben iniciarse los mecanismos de reparación del ADN. Algunos investigadores han demostrado que una mayor destrucción de células se debe a la activación ineficaz o una activación menor del gen con mutación de ataxia telangiectasia (ATM) del sensor de daño del ADN en células irradiadas con radiación de tasa de dosis baja (LDR) en comparación con la tasa de dosis alta (HDR) radiación incluso cuando el ADN ya ha sido dañado. Además, es posible que las vías de reparación asociadas a la ATM no se activen después de la irradiación con radiación LDR [33, 28]. Se sabe que la IR causa G2/ M o G1 detener e inducir la apoptosis en células irradiadas [19]. Sin embargo, en el presente estudio, los dos tratamientos de radiación indujeron una leve disminución en la fracción de supervivencia y una G significativa2/ M detención pero no logró inducir una apoptosis significativa en las células BEAS-2B.


4. Discusión

Las enfermedades infecciosas incluyen las causadas por bacterias, parásitos, hongos y virus. Las infecciones por virus se consideran las más desafiantes debido a las altas tasas de mutación del virus que dan como resultado nuevas cepas que pueden escapar de la inmunidad y / o son resistentes a los agentes antivirales, y los efectos secundarios adversos asociados con la administración prolongada de agentes antivirales. Todos estos resultan en una reducción en la efectividad de las terapias antivirales. Se ha informado anteriormente que la encapsulación de agentes antivirales en NPs supera los inconvenientes de la terapia convencional (Lembo et al., 2018). Sin embargo, al examinar la literatura, no pudimos identificar estudios que investigaran el efecto de la infección por virus en la captación cuantitativa de NP. Informamos en 2018 (Abo-zeid et al., 2018b) un aumento significativo del doble de la captación de NP en una línea de células hepáticas infectadas por el VHC en comparación con el registrado con células no infectadas.

Este estudio exploró cuatro modelos diferentes de células infectadas por virus para ampliar nuestro conocimiento sobre el efecto de la infección en la captación de NP. Preparamos NP RBITC PGA marcadas con fluorescencia con una carga de colorante que es suficiente para rastrear la absorción de NP mediante citometría de flujo (Abo-zeid et al., 2018b, Abo-zeid y Garnett, 2020). Estos NP se utilizaron por varias razones: están formulados a partir de PGA, un polímero biodegradable y biocompatible con propiedades citotóxicas muy bajas (Abo-zeid y Garnett, 2020, Zhang et al., 2014, Kallinteri et al., 2005) y RBITC se retiene en las NP durante un período de tiempo prolongado (Meng et al., 2006), lo que nos permite rastrear la absorción de NP en lugar del colorante libre (Abo-zeid et al., 2018b). El colorante RBITC proporciona una buena fluorescencia en el pH ácido del compartimento lisosómico (Garnett y Baldwin, 1986), lo que permite una detección eficaz de los NP absorbidos por las células mediante citometría de flujo (Abo-zeid y Garnett, 2020, Abo-zeid et al., 2018b ).

Confirmamos la infección por RV de las células mediante RT-PCR y elegimos dos niveles de infección (valores de MOI 0,5 y 1) que dieron como resultado células infectadas pero un efecto citopático mínimo para permitir el estudio de la infección por virus en la captación de NP. La infección por virus por RV-A16 y RV-A01 aumentó o disminuyó significativamente (P & # x000a0 & # x0003c & # x000a00.05, P & # x000a0 & # x0003c & # x000a00.01, P & # x000a0 & # x0003c & # x000a00.001) en comparación con células no infectadas, dependiendo de las condiciones experimentales. Para las células HeLa, la infección por RV-A16 y RV-A01 elevó la captación de NP al aumentar el tiempo de incubación, pero en puntos de tiempo más largos (6 & # x000a0h) se observó una captación reducida con la infección por RV-A01. Esto último probablemente se debió a la disminución de la viabilidad celular.

El cuadro con las células Beas-2B fue más complejo, con disminuciones en la captación de NP observadas en tiempos de incubación cortos después de la infección por RV-A01 y RV-A16. Un mayor tiempo de incubación (4 & # x000a0h) se asoció con una marcada disminución de la captación de NP para las células infectadas con RV-A01 pero un aumento en la captación con las células infectadas con RV-A16. Se puede argumentar que la viabilidad reducida de las células HeLa después de la infección o la interferencia viral con el mecanismo de captación de NP debido a los diferentes mecanismos de entrada de los RV de los grupos mayor (RV-A16) y menor (RV-A01) son responsables de estas diferencias (Fuchs y Blaas, 2012). Además, para observar estos cambios en la absorción de NP, se requirieron análisis de citometría de flujo del MFI ya que no se observaron cambios en el porcentaje de células que absorben NP. Sin embargo, está claro que donde hay una mayor absorción de NP, esto sigue siendo relativamente menor en comparación con nuestro estudio anterior (Abo-zeid et al., 2018b): cuando las células Huh7.5 se transfectaron con HCV (J6 / JFH1 quimera), esto resultó en una duplicación de la absorción de NP. J6 / JFH1 es un VHC recombinante generado para maximizar la replicación en las células in vitro. Se desarrolló a partir de una variante del VHC (JFH1) que proporciona los componentes no estructurales y otra cepa (J6) que proporciona los componentes estructurales para formar la quimera del VHC intragenotípica (Lindenbach et al., 2005). Se encontró que la quimera J6 / JFH1 tiene tanto una replicación de ARN eficiente como una producción de partículas de virus que podrían transfectarse a partir de medios de cultivo de células Huh7.5 infectadas en células Huh7.5 vírgenes (Lindenbach et al., 2005).

Las razones detrás de la diferencia en la captación de NP entre las líneas celulares podrían estar relacionadas tanto con las células como con los virus. En primer lugar, considerando los factores relacionados con las células, en este estudio utilizamos células HeLa y Beas-2B, seleccionadas por su facilidad de infección. in vitro y porque se han utilizado ampliamente en estudios anteriores. Durante la infección in vivo, los RV infectan el epitelio de las vías respiratorias. Sin embargo, los cultivos de células endoteliales primarias no se pudieron utilizar en este estudio ya que las células son difíciles de obtener y mantener. in vitro durante períodos prolongados. Por lo tanto, seleccionamos Beas-2B como una alternativa adecuada.

Las células HeLa y Beas-2B difieren entre sí y de las células Huh7.5 utilizadas anteriormente (Abo-zeid et al., 2018b). La principal vía de captación de NP en las células es la vía endocítica (Foroozandeh y Aziz, 2018). Un estudio anterior (Sayers et al., 2019) informó diferencias en las vías endocíticas entre los tipos de células, incluidas las variaciones en la morfología endolisosómica, la localización, la captación endocítica, el tráfico, el reciclaje, el pH endolisosómico, la capacidad de las NP para escapar del endosoma antes de secuestro lisosómico o exocitosis. Se ha informado que estas diferencias (Sayers et al., 2019) afectan la entrega de ARNm encapsulado en NP lipídicas de 120 & # x000a0nm y, por lo tanto, su eficiencia de expresión. Esperamos que tales diferencias en la vía endocítica entre las células HeLa, Beas-2B y Huh7.5 puedan causar variaciones en la captación de NP.

Los factores relacionados con el virus también serán importantes. En nuestro estudio anterior (Abo-zeid et al., 2018b), las células Huh7.5 se transfectaron con un virus quimera producido genéticamente (quimera JFH1-J6), mientras que en el estudio actual tanto las células HeLa como las células Beas-2B se infectaron con todo un virus activo. Además, la estructura viral, el tamaño y el mecanismo de entrada a las células podrían tener un efecto. Los RV son virus sin envoltura y tienen un genoma de ARN monocatenario de sentido positivo que está protegido por una cápside de proteína icosaédrica construida con 60 copias de cada una de las cuatro proteínas de la cápside viral VP1 y # x02013VP4 (Stobart et al., 2017). Por el contrario, el virus de la hepatitis C (VHC) es un virus de ARN monocatenario de sentido positivo envuelto (envoltura de glicoproteína E1-E2) (Dustin et al., 2016). El tamaño de partícula de los RV es de alrededor de 30 & # x000a0nm (Fuchs y Blaas, 2012) y el tamaño de partícula del VHC es ligeramente mayor, oscilando entre 40 y 80 & # x000a0nm (Calattini et al., 2015, Gastaminza et al., 2010).

Los RV que hemos utilizado aquí tienen diferentes mecanismos de entrada a las células, como se muestra en la Fig.6. RV-A16 pertenece al grupo principal de RV y accede a la célula huésped uniéndose a los receptores ICAM-1, mientras que RV-A01 pertenece al grupo menor y se une al receptor de lipoproteínas de baja densidad (LDLR) en la superficie de la célula huésped. (Fuchs y Blaas, 2012). Estos eventos son seguidos por endocitosis mediada por clatrina, lo que da como resultado el desprendimiento del virión en el endosoma temprano y en el endosoma tardío para RV-A16 y RV-A01, respectivamente. A esto le sigue la liberación del genoma del RV en el citosol para su replicación y producción (Grove y Marsh, 2011). Por el contrario, la entrada del VHC requiere la unión a cuatro receptores: CD81, SR-B1, Claudin-1 y Occludin (Pileri et al., 1998) (Scarselli et al., 2002). Una vez unido a la célula, el VHC se clasifica mediante endocitosis mediada por clatrina y fusión de membranas en el endosoma temprano, seguido de la eliminación del virus y la liberación de material genético en el citosol en la etapa tardía del endosoma (Grove y Marsh, 2011). Por lo tanto, la infección por virus podría afectar la tasa de captación de NP en la vía endocítica, lo que da como resultado una regulación positiva o negativa (o potencialmente no tiene ningún efecto). En consecuencia, se deben realizar esfuerzos en el futuro para estudiar el efecto de la infección por virus en las vías endocíticas para comprender cómo (o si) la infección regula la captación endocítica de NP.


Ver el vídeo: El subcultivo de células en monocapa. Video 2 (Julio 2022).


Comentarios:

  1. Flann

    Le recomiendo que vaya al sitio donde hay muchos artículos sobre el tema que le interesan.

  2. Kazik

    ¡Clase! Respeto a Aftar!

  3. Luiginw

    Esta es una opinión muy valiosa.

  4. Acim

    Puedo recomendarle que visite el sitio, en el que hay muchos artículos sobre este tema.



Escribe un mensaje