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2.3: Instrumentos de microscopía - Biología

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Habilidades para desarrollar

  • Identificar y describir las partes de un microscopio de campo claro.
  • Calcule el aumento total para un microscopio compuesto
  • Describir las características distintivas y los usos típicos de varios tipos de microscopios ópticos, microscopios electrónicos y microscopios de sonda de barrido.

Los primeros pioneros de la microscopía abrieron una ventana al mundo invisible de los microorganismos. Pero la microscopía continuó avanzando en los siglos siguientes. En 1830, Joseph Jackson Lister creó un microscopio de luz esencialmente moderno. El siglo XX vio el desarrollo de microscopios que aprovechaban la luz no visible, como la microscopía de fluorescencia, que usa una fuente de luz ultravioleta, y la microscopía electrónica, que usa haces de electrones de longitud de onda corta. Estos avances condujeron a importantes mejoras en la ampliación, la resolución y el contraste. En comparación, los microscopios relativamente rudimentarios de van Leeuwenhoek y sus contemporáneos eran mucho menos poderosos que incluso los microscopios más básicos que se utilizan en la actualidad. En esta sección, examinaremos la amplia gama de tecnología microscópica moderna y aplicaciones comunes para cada tipo de microscopio.

Microscopía de luz

Muchos tipos de microscopios entran en la categoría de microscopios ópticos, que utilizan luz para visualizar imágenes. Ejemplos de microscopios de luz incluyen microscopios de campo claro, microscopios de campo oscuro, microscopios de contraste de fase, microscopios de contraste de interferencia diferencial, microscopios de fluorescencia, microscopios láser de barrido confocal y microscopios de dos fotones. Estos diversos tipos de microscopios ópticos se pueden utilizar para complementarse entre sí en el diagnóstico y la investigación.

Microscopios de campo claro

El microscopio de campo claro, quizás el tipo de microscopio más utilizado, es un microscopio compuesto con dos o más lentes que producen una imagen oscura sobre un fondo brillante. Algunos microscopios de campo claro son monoculares (tienen un solo ocular), aunque la mayoría de los microscopios de campo claro más nuevos son binoculares (tienen dos oculares), como el que se muestra en la Figura ( PageIndex {1} ); en cualquier caso, cada ocular contiene una lente llamada lente ocular. Las lentes oculares suelen ampliar las imágenes 10 veces (10⨯). En el otro extremo del tubo del cuerpo hay un juego de lentes objetivo en un revólver giratorio. El aumento de estas lentes de objetivo varía típicamente de 4⨯ a 100⨯, con el aumento para cada lente designado en la carcasa de metal de la lente. Las lentes oculares y objetivas trabajan juntas para crear una imagen ampliada. El aumento total es el producto del aumento ocular por el aumento del objetivo:

[ text {aumento ocular × aumento objetivo aumento ocular} ; veces; text {aumento objetivo} ]

Por ejemplo, si se selecciona una lente de objetivo de 40⨯ y la lente ocular es de 10⨯, el aumento total sería

(40×)(10×)=400×

Figura ( PageIndex {1} ): Componentes de un microscopio de campo claro típico.

Componentes de un microscopio de campo claro típico.

El artículo que se está viendo se llama muestra. La muestra se coloca en un portaobjetos de vidrio, que luego se sujeta en su lugar en la platina (una plataforma) del microscopio. Una vez que el portaobjetos está asegurado, la muestra en el portaobjetos se coloca sobre la luz usando las perillas de la platina mecánica x-y. Estas perillas mueven la diapositiva en la superficie del escenario, pero no suben ni bajan el escenario. Una vez que la muestra está centrada sobre la luz, la posición del escenario se puede subir o bajar para enfocar la imagen. La perilla de enfoque grueso se usa para movimientos a gran escala con lentes de objetivo de 4⨯ y 10⨯; la perilla de enfoque fino se usa para movimientos a pequeña escala, especialmente con lentes de objetivo de 40⨯ o 100⨯.

Cuando las imágenes se amplían, se vuelven más tenues porque hay menos luz por unidad de área de imagen. Las imágenes muy ampliadas producidas por microscopios, por lo tanto, requieren una iluminación intensa. En un microscopio de campo claro, esta luz es proporcionada por un iluminador, que normalmente es una bombilla de alta intensidad debajo del escenario. La luz del iluminador pasa a través de la lente del condensador (ubicada debajo del escenario), que enfoca todos los rayos de luz en la muestra para maximizar la iluminación. La posición del condensador se puede optimizar usando la perilla de enfoque del condensador adjunta; una vez establecida la distancia óptima, no se debe mover el condensador para ajustar el brillo. Si se necesitan niveles de luz inferiores a los máximos, la cantidad de luz que incide en la muestra se puede ajustar fácilmente abriendo o cerrando un diafragma entre el condensador y la muestra. En algunos casos, el brillo también se puede ajustar usando el reóstato, un regulador de intensidad que controla la intensidad del iluminador.

Un microscopio de campo claro crea una imagen dirigiendo la luz del iluminador hacia la muestra; esta luz es transmitida, absorbida, reflejada o refractada diferencialmente por diferentes estructuras. Los diferentes colores pueden comportarse de manera diferente al interactuar con cromóforos (pigmentos que absorben y reflejan longitudes de onda de luz particulares) en partes de la muestra. A menudo, los cromóforos se agregan artificialmente a la muestra usando tintes, que sirven para aumentar el contraste y la resolución. En general, las estructuras de la muestra aparecerán más oscuras, en diversos grados, que el fondo brillante, creando imágenes de máxima nitidez con aumentos de hasta aproximadamente 1000⨯. Un aumento adicional crearía una imagen más grande, pero sin mayor resolución. Esto nos permite ver objetos tan pequeños como bacterias, que son visibles a unos 400⨯ aproximadamente, pero no objetos más pequeños como virus.

Con aumentos muy altos, la resolución puede verse comprometida cuando la luz atraviesa la pequeña cantidad de aire entre la muestra y la lente. Esto se debe a la gran diferencia entre los índices de refracción del aire y el vidrio; el aire dispersa los rayos de luz antes de que la lente los pueda enfocar. Para resolver este problema, se puede usar una gota de aceite para llenar el espacio entre la muestra y una lente de inmersión en aceite, una lente especial diseñada para usarse con aceites de inmersión. Dado que el aceite tiene un índice de refracción muy similar al del vidrio, aumenta el ángulo máximo en el que la luz que sale de la muestra puede incidir en la lente. Esto aumenta la luz recolectada y, por lo tanto, la resolución de la imagen (Figura ( PageIndex {2} )). Se puede utilizar una variedad de aceites para diferentes tipos de luz.

Figura ( PageIndex {2} ): (a) Las lentes de inmersión en aceite como ésta se utilizan para mejorar la resolución. (b) Debido a que el aceite de inmersión y el vidrio tienen índices de refracción muy similares, existe una cantidad mínima de refracción antes de que la luz llegue a la lente. Sin aceite de inmersión, la luz se dispersa a medida que pasa por el aire por encima de la diapositiva, degradando la resolución de la imagen.

Incluso un microscopio muy potente no puede producir imágenes de alta resolución si no se limpia y mantiene adecuadamente. Dado que las lentes se diseñan y fabrican cuidadosamente para refractar la luz con un alto grado de precisión, incluso una lente ligeramente sucia o rayada refractará la luz de formas no deseadas, degradando la imagen de la muestra. Además, los microscopios son instrumentos bastante delicados y se debe tener mucho cuidado para no dañar piezas y superficies. Entre otras cosas, el cuidado adecuado de un microscopio incluye lo siguiente:

  • limpiar las lentes con papel para lentes
  • no permitir que las lentes entren en contacto con la diapositiva (por ejemplo, cambiando rápidamente el enfoque)
  • proteger la bombilla (si la hay) de roturas
  • no empujar un objetivo en una diapositiva
  • no usar la perilla de enfoque grueso cuando se usan lentes de objetivo de 40⨯ o más
  • utilizando únicamente aceite de inmersión con un objetivo de aceite especializado, normalmente el objetivo de 100⨯
  • aceite de limpieza de lentes de inmersión después de usar el microscopio
  • limpiar cualquier aceite transferido accidentalmente de otras lentes
  • cubriendo el microscopio o colocándolo en un gabinete cuando no esté en uso

Microscopía de campo oscuro

Un microscopio de campo oscuro es un microscopio de campo claro que tiene una modificación pequeña pero significativa en el condensador. Se coloca un pequeño disco opaco (de aproximadamente 1 cm de diámetro) entre el iluminador y la lente del condensador. Esta parada de luz opaca, como se llama al disco, bloquea la mayor parte de la luz del iluminador a medida que pasa a través del condensador en su camino hacia la lente del objetivo, produciendo un cono hueco de luz que se enfoca en la muestra. La única luz que llega al objetivo es la luz que ha sido refractada o reflejada por estructuras en la muestra. La imagen resultante generalmente muestra objetos brillantes sobre un fondo oscuro (Figura ( PageIndex {3} ))

Figura ( PageIndex {3} ): Se utiliza un tope de luz opaco insertado en un microscopio de campo claro para producir una imagen de campo oscuro. El tope de luz bloquea la luz que viaja directamente desde el iluminador a la lente del objetivo, permitiendo que solo la luz reflejada o refractada de la muestra llegue al ojo.

Se utiliza un tope de luz opaco insertado en un microscopio de campo claro para producir una imagen de campo oscuro. El tope de luz bloquea la luz que viaja directamente desde el iluminador a la lente del objetivo, permitiendo que solo la luz reflejada o refractada de la muestra llegue al ojo.

La microscopía de campo oscuro a menudo puede crear imágenes de muestras de alto contraste y alta resolución sin el uso de tintes, lo que es particularmente útil para ver muestras vivas que podrían morir o verse comprometidas por las tinciones. Por ejemplo, espiroquetas delgadas como Treponema pallidum, el agente causante de la sífilis, se puede ver mejor con un microscopio de campo oscuro (Figura ( PageIndex {4} )).

Figura ( PageIndex {4} ): El uso de un microscopio de campo oscuro nos permite ver muestras vivas sin teñir de la espiroqueta Treponema pallidum. Similar a un negativo fotográfico, las espiroquetas aparecen brillantes sobre un fondo oscuro. (crédito: Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades)

El uso de un microscopio de campo oscuro nos permite ver muestras vivas y sin teñir de la espiroqueta. Treponema pallidum. (crédito: Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades / C.W. Hubbard)

Ejercicio ( PageIndex {1} )

Identificar las diferencias clave entre microscopía de campo claro y campo oscuro.

Las infecciones de heridas como la de Cindy pueden ser causadas por muchos tipos diferentes de bacterias, algunas de las cuales pueden propagarse rápidamente con complicaciones graves. Identificar la causa específica es muy importante para seleccionar un medicamento que pueda matar o detener el crecimiento de las bacterias.

Después de llamar a un médico local sobre el caso de Cindy, la enfermera del campamento envía la muestra de la herida al laboratorio médico más cercano. Desafortunadamente, dado que el campamento está en un área remota, el laboratorio más cercano es pequeño y está mal equipado. Un laboratorio más moderno probablemente usaría otros métodos para cultivar, hacer crecer e identificar las bacterias, pero en este caso, el técnico decide hacer un montaje húmedo de la muestra y verla bajo un microscopio de campo claro. En una montura húmeda, se agrega una pequeña gota de agua al portaobjetos y se coloca un cubreobjetos sobre la muestra para mantenerla en su lugar antes de colocarla debajo de la lente del objetivo.

Bajo el microscopio de campo claro, el técnico apenas puede ver las células bacterianas porque son casi transparentes contra el fondo brillante. Para aumentar el contraste, el técnico inserta un tope de luz opaco sobre el iluminador. La imagen de campo oscuro resultante muestra claramente que las células bacterianas son esféricas y están agrupadas en racimos, como las uvas.

  • ¿Por qué es importante identificar la forma y los patrones de crecimiento de las células en una muestra?
  • ¿Qué otros tipos de microscopía podrían usarse de manera efectiva para ver esta muestra?

Microscopios de contraste de fase

Los microscopios de contraste de fase utilizan la refracción y la interferencia causadas por las estructuras de una muestra para crear imágenes de alto contraste y alta resolución sin tinción. Es el tipo de microscopio más antiguo y simple que crea una imagen alterando las longitudes de onda de los rayos de luz que atraviesan la muestra. Para crear trayectos de longitud de onda alterados, se utiliza un tope anular en el condensador. El tope anular produce un cono de luz hueco que se enfoca en la muestra antes de alcanzar la lente del objetivo. El objetivo contiene una placa de fase que contiene un anillo de fase. Como resultado, la luz que viaja directamente desde el iluminador pasa a través del anillo de fase mientras que la luz refractada o reflejada por la muestra pasa a través de la placa. Esto hace que las ondas que viajan a través del anillo estén desfasadas aproximadamente la mitad de una longitud de onda con respecto a las que atraviesan la placa. Debido a que las ondas tienen picos y valles, pueden sumarse (si están en fase juntas) o cancelarse entre sí (si están fuera de fase). Cuando las longitudes de onda están desfasadas, los valles de onda cancelarán los picos de onda, lo que se denomina interferencia destructiva. Las estructuras que refractan la luz luego aparecen oscuras sobre un fondo brillante de solo luz no refractada. De manera más general, las estructuras que difieren en características como el índice de refracción diferirán en los niveles de oscuridad (Figura ( PageIndex {5} )).

Figura ( PageIndex {5} ): Este diagrama de un microscopio de contraste de fase ilustra las diferencias de fase entre la luz que pasa a través del objeto y el fondo. Estas diferencias se producen al pasar los rayos a través de diferentes partes de una placa de fase. Los rayos de luz se superponen en el plano de la imagen, produciendo contraste debido a su interferencia.

Este diagrama de un microscopio de contraste de fase ilustra las diferencias de fase entre la luz que pasa a través del objeto y el fondo. Los rayos de luz se superponen en el plano de la imagen, produciendo contraste debido a su interferencia.

Debido a que aumenta el contraste sin requerir tinciones, la microscopía de contraste de fase se usa a menudo para observar muestras vivas. Ciertas estructuras, como los orgánulos en las células eucariotas y las endosporas en las células procariotas, se visualizan especialmente bien con microscopía de contraste de fase (Figura ( PageIndex {6} )).

Figura ( PageIndex {6} ): Esta figura compara una imagen de campo claro (izquierda) con una imagen de contraste de fase (derecha) de las mismas células epiteliales escamosas simples sin teñir. Las celdas están en el centro y en la parte inferior derecha de cada fotografía (el elemento irregular encima de las celdas son restos acelulares). Observe que las celdas sin teñir en la imagen de campo claro son casi invisibles contra el fondo, mientras que las celdas en la imagen de contraste de fase parecen brillar contra el fondo, revelando muchos más detalles.

Esta figura compara una imagen de campo claro (izquierda) con una imagen de contraste de fase (derecha) de las mismas células epiteliales escamosas simples sin teñir. Observe que las celdas sin teñir en la imagen de campo claro son casi invisibles contra el fondo, mientras que las celdas en la imagen de contraste de fase parecen brillar contra el fondo, revelando muchos más detalles. (crédito: "Claramente kéfir" / Wikimedia Commons)

Microscopios de contraste de interferencia diferencial

Los microscopios de contraste de interferencia diferencial (DIC) (también conocidos como óptica Nomarski) son similares a los microscopios de contraste de fase en que utilizan patrones de interferencia para mejorar el contraste entre diferentes características de una muestra. En un microscopio DIC, se crean dos haces de luz en los que difiere la dirección del movimiento de las ondas (polarización). Una vez que los haces pasan a través de la muestra o del espacio libre de muestras, se recombinan y los efectos de las muestras provocan diferencias en los patrones de interferencia generados por la combinación de los haces. Esto da como resultado imágenes de alto contraste de organismos vivos con apariencia tridimensional. Estos microscopios son especialmente útiles para distinguir estructuras dentro de muestras vivas sin teñir. (Figura ( PageIndex {7} )).

Figura ( PageIndex {7} ): Una imagen DIC de Fonsecaea pedrosoi cultivada en agar Leonian modificado. Este hongo causa cromoblastomicosis, una infección crónica de la piel común en climas tropicales y subtropicales.

Una imagen DIC de Fonsecaea pedrosoi cultivado en agar Leonian modificado. Este hongo causa cromoblastomicosis, una infección crónica de la piel común en climas tropicales y subtropicales.

Ejercicio ( PageIndex {2} )

¿Cuáles son algunas de las ventajas de la microscopía de contraste de fase y DIC?

Microscopios de fluorescencia

Un microscopio de fluorescencia utiliza cromóforos fluorescentes llamados fluorocromos, que son capaces de absorber energía de una fuente de luz y luego emitir esta energía como luz visible. Los fluorocromos incluyen sustancias naturalmente fluorescentes (como las clorofilas), así como tintes fluorescentes que se agregan a la muestra para crear contraste. Los tintes como el rojo Texas y FITC son ejemplos de fluorocromos. Otros ejemplos incluyen los colorantes de ácido nucleico 4 ', 6'-diamidino-2-fenilindol (DAPI) y naranja de acridina.

El microscopio transmite una luz de excitación, generalmente una forma de EMR con una longitud de onda corta, como luz ultravioleta o azul, hacia la muestra; los cromóforos absorben la luz de excitación y emiten luz visible con longitudes de onda más largas. Luego, la luz de excitación se filtra (en parte porque la luz ultravioleta es dañina para los ojos) de modo que solo la luz visible pasa a través del lente ocular. Esto produce una imagen de la muestra en colores brillantes sobre un fondo oscuro.

Los microscopios de fluorescencia son especialmente útiles en microbiología clínica. Se pueden usar para identificar patógenos, para encontrar especies particulares dentro de un entorno o para encontrar la ubicación de moléculas y estructuras particulares dentro de una célula. También se han desarrollado enfoques para distinguir las células vivas de las muertas utilizando microscopía de fluorescencia basándose en si absorben fluorocromos particulares. A veces, se utilizan varios fluorocromos en la misma muestra para mostrar diferentes estructuras o características.

Una de las aplicaciones más importantes de la microscopía de fluorescencia es una técnica llamada inmunofluorescencia, que se usa para identificar ciertos microbios que causan enfermedades al observar si los anticuerpos se unen a ellos. (Los anticuerpos son moléculas de proteína producidas por el sistema inmunológico que se adhieren a patógenos específicos para matarlos o inhibirlos). Hay dos enfoques para esta técnica: ensayo de inmunofluorescencia directa (DFA) y ensayo de inmunofluorescencia indirecta (IFA). En DFA, los anticuerpos específicos (p. Ej., Aquellos que se dirigen al virus de la rabia) se tiñen con un fluorocromo. Si la muestra contiene el patógeno objetivo, se pueden observar los anticuerpos que se unen al patógeno bajo el microscopio fluorescente. Esto se denomina tinción de anticuerpo primario porque los anticuerpos teñidos se adhieren directamente al patógeno.

En IFA, los anticuerpos secundarios se tiñen con un fluorocromo en lugar de anticuerpos primarios. Los anticuerpos secundarios no se unen directamente al patógeno, pero se unen a los anticuerpos primarios. Cuando los anticuerpos primarios no teñidos se unen al patógeno, se puede observar que los anticuerpos secundarios fluorescentes se unen a los anticuerpos primarios. Por tanto, los anticuerpos secundarios se unen indirectamente al patógeno.Dado que múltiples anticuerpos secundarios a menudo se pueden unir a un anticuerpo primario, IFA aumenta la cantidad de anticuerpos fluorescentes adheridos a la muestra, lo que facilita la visualización de las características de la muestra (Figura ( PageIndex {8} )).

Figura ( PageIndex {8} ): (a) Se usa una tinción inmunofluorescente directa para visualizar Neisseria gonorrhoeae, la bacteria que causa la gonorrea. (b) Se utiliza una tinción inmunofluorescente indirecta para visualizar las larvas de Schistosoma mansoni, un gusano parásito que causa la esquistosomiasis, una enfermedad intestinal común en los trópicos. (c) En inmunofluorescencia directa, la tinción es absorbida por un anticuerpo primario, que se une al antígeno. En la inmunofluorescencia indirecta, la tinción es absorbida por un anticuerpo secundario, que se une a un anticuerpo primario, que, a su vez, se une al antígeno. (crédito a: modificación del trabajo de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades; crédito b: modificación del trabajo de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades)

(a) Se utiliza una tinción inmunofluorescente directa para visualizar Neisseria gonorrhoeae, la bacteria que causa la gonorrea. (b) Se utiliza una tinción inmunofluorescente indirecta para visualizar las larvas de Schistosoma mansoni, un gusano parásito que causa esquistosomiasis, una enfermedad intestinal común en los trópicos. (crédito a: modificación del trabajo de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades; crédito b: modificación del trabajo de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades / Dr. Sulzer)

Ejercicio ( PageIndex {3} )

¿Por qué deben usarse fluorocromos para examinar una muestra bajo un microscopio de fluorescencia?

Microscopios confocales

Mientras que otras formas de microscopía óptica crean una imagen que se enfoca al máximo a una sola distancia del observador (la profundidad o plano z), un microscopio confocal usa un láser para escanear múltiples planos z sucesivamente. Esto produce numerosas imágenes bidimensionales de alta resolución a varias profundidades, que una computadora puede construir en una imagen tridimensional. Al igual que con los microscopios de fluorescencia, las tinciones fluorescentes se utilizan generalmente para aumentar el contraste y la resolución. La claridad de la imagen se ve reforzada por una apertura estrecha que elimina cualquier luz que no provenga del plano z. Por lo tanto, los microscopios confocales son muy útiles para examinar muestras gruesas, como biopelículas, que pueden examinarse vivas y sin fijar (Figura ( PageIndex {9} )).

Figura ( PageIndex {9} ): La microscopía confocal se puede utilizar para visualizar estructuras como esta biopelícula de cianobacterias que habita en el techo. (crédito: modificación del trabajo de la Sociedad Americana de Microbiología).

La microscopía confocal se puede utilizar para visualizar estructuras como esta biopelícula de cianobacterias que habita en el techo. (crédito: Sociedad Estadounidense de Microbiología)

Microscopios de dos fotones

Si bien los microscopios fluorescentes y confocales originales permitieron una mejor visualización de las características únicas en las muestras, aún existían problemas que impedían una visualización óptima. La sensibilidad efectiva de la microscopía de fluorescencia al ver muestras gruesas generalmente estaba limitada por un destello fuera de foco, lo que resultó en una resolución deficiente. Esta limitación se redujo en gran medida en el microscopio confocal mediante el uso de un orificio confocal para rechazar la fluorescencia de fondo desenfocada con secciones ópticas delgadas (<1 μm) y sin borrosidad. Sin embargo, incluso los microscopios confocales carecían de la resolución necesaria para ver muestras de tejido grueso. Estos problemas se resolvieron con el desarrollo del microscopio de dos fotones, que utiliza una técnica de escaneo, fluorocromos y luz de longitud de onda larga (como la infrarroja) para visualizar las muestras. La baja energía asociada con la luz de longitud de onda larga significa que dos fotones deben impactar en un lugar al mismo tiempo para excitar el fluorocromo. La baja energía de la luz de excitación es menos dañina para las células y la longitud de onda larga de la luz de excitación penetra más fácilmente en muestras gruesas. Esto hace que el microscopio de dos fotones sea útil para examinar células vivas dentro de tejidos intactos: cortes de cerebro, embriones, órganos completos e incluso animales completos.

Actualmente, el uso de microscopios de dos fotones está limitado a laboratorios clínicos y de investigación avanzados debido a los altos costos de los instrumentos. Un solo microscopio de dos fotones cuesta típicamente entre $ 300 000 y $ 500 000, y los láseres utilizados para excitar los tintes utilizados en las muestras también son muy caros. Sin embargo, a medida que mejora la tecnología, los microscopios de dos fotones pueden estar más disponibles en entornos clínicos.

Ejercicio ( PageIndex {4} )

¿Qué tipos de muestras se examinan mejor con microscopía confocal o de dos fotones?

Microscopio de electrones

La resolución teórica máxima de las imágenes creadas por microscopios ópticos está limitada en última instancia por las longitudes de onda de la luz visible. La mayoría de los microscopios ópticos solo pueden aumentar 1000⨯, y algunos pueden aumentar hasta 1500⨯, pero esto no comienza a acercarse al poder de aumento de un microscopio electrónico (EM), que utiliza haces de electrones de longitud de onda corta en lugar de luz para aumentar el aumento. y resolución.

Los electrones, como la radiación electromagnética, pueden comportarse como ondas, pero con longitudes de onda de 0,005 nm, pueden producir una resolución mucho mejor que la luz visible. Un EM puede producir una imagen nítida que se amplía hasta 100.000⨯. Por lo tanto, los ME pueden resolver estructuras subcelulares, así como algunas estructuras moleculares (por ejemplo, hebras simples de ADN); sin embargo, la microscopía electrónica no se puede utilizar en materia viva debido a los métodos necesarios para preparar las muestras.

Hay dos tipos básicos de EM: el microscopio electrónico de transmisión (TEM) y el microscopio electrónico de barrido (SEM) (Figura ( PageIndex {10} )). El TEM es algo análogo al microscopio de luz de campo claro en términos de su funcionamiento. Sin embargo, utiliza un haz de electrones desde arriba de la muestra que se enfoca usando una lente magnética (en lugar de una lente de vidrio) y se proyecta a través de la muestra en un detector. Los electrones atraviesan la muestra y luego el detector captura la imagen (Figura ( PageIndex {11} )).

Figura ( PageIndex {10} ): (a) Un microscopio electrónico de transmisión (TEM). (b) Un microscopio electrónico de barrido (SEM). (crédito a: modificación del trabajo de “Deshi” / Wikimedia Commons; crédito b: modificación del trabajo de “ZEISS Microscopy” / Flickr)

Figura ( PageIndex {11} ): Los microscopios electrónicos usan imanes para enfocar haces de electrones de manera similar a como los microscopios ópticos usan lentes para enfocar la luz.

Para que los electrones pasen a través de la muestra en un TEM, la muestra debe ser extremadamente delgada (20–100 nm de espesor). La imagen se produce debido a la opacidad variable en varias partes de la muestra. Esta opacidad se puede mejorar teñiendo la muestra con materiales como metales pesados, que son densos en electrones. TEM requiere que la viga y la muestra estén al vacío y que la muestra sea muy delgada y deshidratada. Los pasos específicos necesarios para preparar una muestra para la observación bajo un ME se analizan en detalle en la siguiente sección.

Los SEM forman imágenes de superficies de muestras, generalmente a partir de electrones que son desprendidos de las muestras por un haz de electrones. Esto puede crear imágenes muy detalladas con una apariencia tridimensional que se muestran en un monitor (Figura ( PageIndex {12} )). Por lo general, las muestras se secan y se preparan con fijadores que reducen los artefactos, como el encogimiento, que se pueden producir mediante el secado, antes de ser recubiertos por pulverización catódica con una fina capa de metal como el oro. Mientras que la microscopía electrónica de transmisión requiere secciones muy delgadas y permite ver estructuras internas como orgánulos y el interior de las membranas, la microscopía electrónica de barrido se puede utilizar para ver las superficies de objetos más grandes (como un grano de polen) así como las superficies de muestras muy pequeñas (Figura ( PageIndex {13} )). Algunos ME pueden ampliar una imagen hasta 2,000,000⨯.1

Figura ( PageIndex {12} ): Estas ilustraciones esquemáticas comparan los componentes de los microscopios electrónicos de transmisión y los microscopios electrónicos de barrido.

Figura ( PageIndex {13} ): (a) Esta imagen TEM de células en una biopelícula muestra estructuras internas bien definidas de las células debido a los diferentes niveles de opacidad en la muestra. (b) Esta imagen SEM de color mejorado de la bacteria Staphylococcus aureus ilustra la capacidad de la microscopía electrónica de barrido para generar imágenes tridimensionales de la estructura de la superficie de las células. (crédito a: modificación del trabajo de la Sociedad Americana de Microbiología; crédito b: modificación del trabajo de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades)

Ejercicio ( PageIndex {5} )

  1. ¿Cuáles son algunas de las ventajas y desventajas de la microscopía electrónica, en comparación con la microscopía óptica, para examinar muestras microbiológicas?
  2. ¿Qué tipos de muestras se examinan mejor con TEM? SEM?

Uso de microscopía para estudiar biopelículas

Una biopelícula es una comunidad compleja de una o más especies de microorganismos, que típicamente se forma como una capa viscosa adherida a una superficie debido a la producción de una sustancia extrapolimérica (EPS) que se adhiere a una superficie o en la interfaz entre superficies (p. Ej., Entre el aire y agua). En la naturaleza, las biopelículas son abundantes y con frecuencia ocupan nichos complejos dentro de los ecosistemas (Figura ( PageIndex {14} )). En medicina, las biopelículas pueden cubrir dispositivos médicos y existir dentro del cuerpo. Debido a que poseen características únicas, como una mayor resistencia contra el sistema inmunológico y los medicamentos antimicrobianos, las biopelículas son de particular interés para los microbiólogos y los médicos por igual.

Debido a que las biopelículas son gruesas, no se pueden observar muy bien con microscopía óptica; cortar una biopelícula para crear una muestra más delgada podría matar o perturbar a la comunidad microbiana. La microscopía confocal proporciona imágenes más claras de las biopelículas porque puede enfocarse en un plano z a la vez y producir una imagen tridimensional de una muestra gruesa. Los tintes fluorescentes pueden ser útiles para identificar células dentro de la matriz. Además, se pueden utilizar técnicas como la inmunofluorescencia y la hibridación in situ por fluorescencia (FISH), en las que se utilizan sondas fluorescentes para unirse al ADN.

La microscopía electrónica se puede utilizar para observar biopelículas, pero solo después de deshidratar la muestra, lo que produce artefactos indeseables y distorsiona la muestra. Además de estos enfoques, es posible seguir las corrientes de agua a través de las formas (como conos y hongos) de las biopelículas, utilizando un video del movimiento de perlas recubiertas de fluorescencia (Figura ( PageIndex {15} )).

Figura ( PageIndex {14} ): Una biopelícula se forma cuando las bacterias planctónicas (que flotan libremente) de una o más especies se adhieren a una superficie, producen limo y forman una colonia. (crédito: Biblioteca Pública de Ciencias).

Figura ( PageIndex {15} ): En esta imagen, múltiples especies de bacterias crecen en una biopelícula sobre acero inoxidable (teñida con DAPI para miscroscopía de epifluorescencia). (crédito: Ricardo Murga, Rodney Donlan).

Microscopía de sonda de barrido

Un microscopio de sonda de barrido no utiliza luz ni electrones, sino sondas muy afiladas que se pasan sobre la superficie de la muestra e interactúan con ella directamente. Esto produce información que se puede ensamblar en imágenes con aumentos de hasta 100.000.000⨯. Estos grandes aumentos se pueden utilizar para observar átomos individuales en superficies. Hasta la fecha, estas técnicas se han utilizado principalmente para la investigación más que para el diagnóstico.

Hay dos tipos de microscopio de sonda de barrido: el microscopio de efecto túnel (STM) y el microscopio de fuerza atómica (AFM). Un STM utiliza una sonda que se pasa justo por encima de la muestra, ya que una polarización de voltaje constante crea el potencial de una corriente eléctrica entre la sonda y la muestra. Esta corriente se produce a través de un túnel cuántico de electrones entre la sonda y la muestra, y la intensidad de la corriente depende de la distancia entre la sonda y la muestra. La sonda se mueve horizontalmente sobre la superficie y se mide la intensidad de la corriente. La microscopía de túnel de barrido puede mapear eficazmente la estructura de las superficies a una resolución a la que se pueden detectar átomos individuales.

De manera similar a un STM, los AFM tienen una sonda delgada que se pasa justo por encima de la muestra. Sin embargo, en lugar de medir variaciones en la corriente a una altura constante por encima de la muestra, un AFM establece una corriente constante y mide variaciones en la altura de la punta de la sonda a medida que pasa sobre la muestra. A medida que la punta de la sonda pasa sobre la muestra, las fuerzas entre los átomos (fuerzas de van der Waals, fuerzas capilares, enlaces químicos, fuerzas electrostáticas y otras) hacen que se mueva hacia arriba y hacia abajo. La deflexión de la punta de la sonda se determina y mide usando la ley de elasticidad de Hooke, y esta información se usa para construir imágenes de la superficie de la muestra con resolución a nivel atómico (Figura ( PageIndex {16} )).

Figura ( PageIndex {16} ): Los STM y AFM nos permiten ver imágenes a nivel atómico. (a) Esta imagen STM de una superficie de oro puro muestra átomos individuales de oro dispuestos en columnas. (b) Esta imagen de AFM muestra moléculas largas en forma de hebras de nanocelulosa, una sustancia creada en laboratorio derivada de fibras vegetales. (crédito a: modificación del trabajo de “Erwinrossen” / Wikimedia Commons).

Ejercicio ( PageIndex {6} )

  1. ¿Cuál tiene mayor aumento, un microscopio óptico o un microscopio de sonda de barrido?
  2. Mencione una ventaja y una limitación de la microscopía de sonda de barrido.

Figura ( PageIndex {17} ): (crédito "Brightfield": modificación del trabajo de la Sociedad Americana de Microbiología; crédito "Darkfield": modificación del trabajo de la Sociedad Americana de Microbiología; crédito "Contraste de fase": modificación del trabajo de la Sociedad Americana de Microbiología; crédito "DIC": modificación del trabajo de la Sociedad Americana de Microbiología; crédito “Fluorescencia”: modificación del trabajo de la Sociedad Americana de Microbiología; crédito “Confocal”: modificación del trabajo de la Sociedad Americana de Microbiología; crédito “Dos fotones”: modificación del trabajo de Alberto Diaspro, Paolo Bianchini, Giuseppe Vicidomini, Mario Faretta, Paola Ramoino, Cesare Usai).

Figura ( PageIndex {18} ): (crédito "TEM": modificación del trabajo de la Sociedad Americana de Microbiología; crédito "SEM": modificación del trabajo de la Sociedad Americana de Microbiología)

Figura ( PageIndex {19} ): Técnicas de microscopía para microscopios de sonda de barrido.

Conceptos clave y resumen

  • Numerosos tipos de microscopios utilizan diversas tecnologías para generar micrografías. La mayoría son útiles para un tipo particular de muestra o aplicación.
  • La microscopía óptica utiliza lentes para enfocar la luz en una muestra y producir una imagen. Los microscopios de luz comúnmente utilizados incluyen microscopios de campo claro, campo oscuro, contraste de fase, contraste de interferencia diferencial, fluorescencia, confocal y de dos fotones.
  • La microscopía electrónica enfoca los electrones en la muestra usando imanes, produciendo un aumento mucho mayor que la microscopía óptica. El microscopio electrónico de transmisión (TEM) y el microscopio electrónico de barrido (SEM) son dos formas comunes.
  • La microscopía de sonda de barrido produce imágenes de mayor aumento al medir la retroalimentación de sondas afiladas que interactúan con la muestra. Los microscopios de sonda incluyen el microscopio de efecto túnel (STM) y el microscopio de fuerza atómica (AFM).

Glosario

microscopio de fuerza atómica
un microscopio de sonda de barrido que utiliza una sonda delgada que se pasa justo por encima de la muestra para medir las fuerzas entre los átomos y la sonda
binocular
tener dos oculares
microscopio de campo claro
un microscopio óptico compuesto con dos lentes; produce una imagen oscura sobre un fondo brillante
perilla de enfoque grueso
una perilla en un microscopio que produce movimientos relativamente grandes para ajustar el enfoque
cromóforos
pigmentos que absorben y reflejan longitudes de onda de luz particulares (dándoles un color)
lentes condensadores
una lente en un microscopio que enfoca la luz de la fuente de luz sobre la muestra
microscopio confocal
un microscopio láser de barrido que utiliza tintes fluorescentes y láseres de excitación para crear imágenes tridimensionales
microscopio de campo oscuro
un microscopio óptico compuesto que produce una imagen brillante sobre un fondo oscuro; típicamente un microscopio de campo claro modificado
diafragma
un componente de un microscopio; típicamente consiste en un disco debajo del escenario con agujeros de varios tamaños; se puede ajustar para permitir que más o menos luz de la fuente de luz llegue a la muestra
microscopio de contraste de interferencia diferencial
un microscopio que usa luz polarizada para aumentar el contraste
microscopio electrónico
un tipo de microscopio que utiliza haces de electrones de longitud de onda corta en lugar de luz para aumentar el aumento y la resolución
perilla de enfoque fino
una perilla en un microscopio que produce movimientos relativamente pequeños para ajustar el enfoque
microscopio de fluorescencia
un microscopio que utiliza fluorocromos naturales o tintes fluorescentes para aumentar el contraste
fluorocromos
cromóforos que emiten fluorescencia (absorben y luego emiten luz)
iluminador
la fuente de luz en un microscopio
inmunofluorescencia
una técnica que utiliza un microscopio de fluorescencia y fluorocromos específicos de anticuerpos para determinar la presencia de patógenos específicos en una muestra
monóculo
tener un solo ocular
lentes objetivas
en un microscopio óptico, las lentes más cercanas a la muestra, generalmente ubicadas en los extremos de las torretas
lentes oculares
en un microscopio, la lente más cercana al ojo (también llamada ocular)
lente de inmersión en aceite
una lente de objetivo especial en un microscopio diseñada para usarse con aceite de inmersión para mejorar la resolución
microscopio de contraste de fase
un microscopio óptico que utiliza un tope anular y una placa anular para aumentar el contraste
reóstato
un interruptor de atenuación que controla la intensidad del iluminador en un microscopio óptico
microscopio electrónico de barrido (SEM)
un tipo de microscopio electrónico que hace rebotar electrones en la muestra, formando una imagen de la superficie
microscopio de sonda de barrido
un microscopio que utiliza una sonda que viaja a través de la superficie de una muestra a una distancia constante mientras se mide la corriente, que es sensible al tamaño del espacio
microscopio de efecto túnel
un microscopio que utiliza una sonda que se pasa justo por encima de la muestra, ya que una polarización de voltaje constante crea el potencial de una corriente eléctrica entre la sonda y la muestra
escenario
la plataforma de un microscopio en la que se colocan los portaobjetos
aumento total
en un microscopio óptico es un valor calculado multiplicando el aumento del ocular por el aumento de las lentes del objetivo
microscopio electrónico de transmisión (TEM)
un tipo de microscopio electrónico que utiliza un haz de electrones, enfocado con imanes, que atraviesa una muestra delgada
microscopio de dos fotones
un microscopio que utiliza luz infrarroja o de longitud de onda larga para producir fluorescencia de fluorocromos en la muestra
perillas de escenario mecánicas x-y
Perillas de un microscopio que se utilizan para ajustar la posición de la muestra en la superficie del escenario, generalmente para centrarla directamente sobre la luz.

Contribuyente

  • Nina Parker, (Universidad de Shenandoah), Mark Schneegurt (Universidad Estatal de Wichita), Anh-Hue Thi Tu (Universidad Estatal del Suroeste de Georgia), Philip Lister (Colegio Comunitario Central de Nuevo México) y Brian M.Forster (Universidad de Saint Joseph) con muchos autores colaboradores. Contenido original a través de Openstax (CC BY 4.0; acceso gratuito en https://openstax.org/books/microbiology/pages/1-introduction)


Microscopía de fluorescencia, Aplicaciones

Principios de la microscopía de fluorescencia

La microscopía de fluorescencia es una técnica mediante la cual las sustancias fluorescentes se examinan en un microscopio. Tiene una serie de ventajas sobre otras formas de microscopía, ofreciendo una alta sensibilidad y especificidad.

En microscopía de fluorescencia, la muestra se ilumina (excita) con luz de una longitud de onda relativamente corta, generalmente azul o ultravioleta (UV). La muestra se examina a través de un filtro de barrera que absorbe la luz de onda corta utilizada para la iluminación y transmite la fluorescencia, que por lo tanto se ve como brillante sobre un fondo oscuro (Figura 1). Debido a que la fluorescencia se observa como luminosidad sobre un fondo oscuro, los componentes fluorescentes de la muestra pueden verse incluso en cantidades extremadamente pequeñas. Hay varios modos diferentes de microscopía de fluorescencia, de los cuales el más importante es la microscopía de fluorescencia confocal.

Figura 1 . Microfotografías de fluorescencia de una sección del tallo de una planta, cortada longitudinalmente (imagen principal) y transversalmente (recuadro, a mayor aumento). El tejido se tiñó con un fluorocromo, azul de anilina, para mostrar el tejido conductor del azúcar (floema). El azul de anilina tiñe regiones especializadas de las paredes celulares. La fluorescencia intensa es más obvia en las paredes transversales (extremas) de las células alargadas. Las paredes de los extremos tienen poros para que haya continuidad de una célula a otra, formando un tubo continuo en el que los azúcares pueden moverse hacia abajo de la planta desde las hojas. En el recuadro se muestra una vista frontal de una de las paredes de los extremos. Hay un anillo de fluorescencia alrededor de cada poro. También hay tinción fluorescente, en mucho menor grado, en las paredes longitudinales. Esto rodea los poros que permiten el transporte de azúcar entre los tubos adyacentes. Tinciones de azul anilina 1 → 3β–Glucanos. Aquí se tiñe la callosa, un glucano que se deposita para ocluir los poros en caso de que los tubos se dañen, como cuando se corta tejido. Esto presumiblemente bloquea la parte cortada de los tubos, minimizando la pérdida de azúcares de los extremos cortados de los tubos, y también puede minimizar la entrada de microorganismos que serían atraídos por las fugas de azúcares. Los tubos que se muestran en la imagen principal tienen un diámetro de 70 μm. Tamaño de campo de la imagen principal aproximadamente 500 × 1000 μm (0,5 × 1 mm), de inserción aproximadamente 100 × 100 μm.

Imágenes cortesía del profesor AE Ashford, Universidad de Nueva Gales del Sur.

En la mayoría de los microscopios de fluorescencia modernos, se emplea la epi-iluminación. Esto significa que la luz utilizada para la excitación se refleja en la muestra a través del objetivo, que actúa como condensador. Los objetos opacos o muy gruesos se pueden examinar con epi-iluminación, incluso la piel de personas vivas.

La posición de la microscopía de fluorescencia en relación con otras técnicas se resume en la Tabla 1. La microscopía de absorción convencional, de luz transmitida, es apropiada para objetos coloreados de tamaño resoluble y, instrumentalmente, es la forma más simple de microscopía. Los objetos transparentes e incoloros solo pueden estudiarse mediante técnicas de retardo (polarización, contraste de fase, interferencia). Estas técnicas dependen de la conversión del retardo de fase en cambios de intensidad que se pueden ver a simple vista. Una excepción es la iluminación de fondo oscuro, que puede revelar objetos transparentes incoloros por reflexión o refracción en interfaces de diferentes índices de refracción. Por lo demás, la microscopía de campo oscuro es adecuada principalmente para material particulado y (como la microscopía de fluorescencia) puede revelar las posiciones de partículas demasiado pequeñas para ser resueltas. La microscopía de fluorescencia está estrechamente relacionada con la microscopía de transmisión (absorción) en su campo de aplicación, pero posee ventajas particulares: gran sensibilidad para la detección y cuantificación de pequeñas cantidades de sustancias fluorescentes o pequeñas partículas, y la posibilidad de aplicación a objetos opacos. Dado que la fluorescencia involucra dos bandas de longitud de onda (excitación y emisión), la especificidad óptica puede incrementarse sustancialmente mediante una selección cuidadosa de combinaciones de filtros para favorecer la excitación y emisión de algún fluoróforo en particular, y los desarrollos modernos también permiten la resolución temporal de la vida útil de la fluorescencia.

Tabla 1 . Aplicabilidad de la microscopía de fluorescencia, en comparación con otras técnicas.

Tipo de microscopía
MuestraFluorescenciaAbsorción (transmisión)Retraso (DIC, Pol, etc.)Reflexión (incluido fondo oscuro)
De coloresApropiadoApropiadoInadecuadoApropiado
TransparenteImposibleImposibleApropiadoImposible
OpacoApropiadoImposibleApropiadoApropiado
DinámicaApropiadoImposibleImposibleImposible
Partículas por debajo del límite de resoluciónApropiadoImposibleInadecuadoApropiado

La microscopía de absorción es el tipo convencional de luz transmitida. La microscopía de retardo incluye contraste de interferencia (DIC), contraste de fase y polarización de Nomarski. La microscopía de reflexión incluye fondo oscuro.

La microscopía de fluorescencia, debido a su complejidad, presenta más dificultad de lo habitual en la interpretación de la imagen. Los factores que pueden afectar la apariencia de la imagen en un microscopio de fluorescencia están relacionados con la muestra, el sistema óptico del microscopio (en particular la combinación de filtros) y las características ópticas y neurológicas del propio observador. En particular, el uso de un filtro de barrera de banda estrecha puede inducir a error, ya que hace que todo parezca su color específico, mientras que un filtro de banda ancha o de paso largo (longitud de onda) permite la diferenciación de diferentes colores. Incluso la fotografía, aparentemente objetiva, puede inducir a error si no se interpreta correctamente.

Los textos definitivos actuales sobre microscopía de fluorescencia son los de Rost (ver Lecturas adicionales). También existen varias obras introductorias, como la de Abramowicz, y una vasta literatura especializada. Los principales textos sobre microscopía de fluorescencia confocal son los de Pawley y Wilson.


Los microscopios de computadora USB, también llamados microscopios de computadora o conectados a una computadora, se conectan a un puerto USB de una computadora o televisión. En lugar de mirar con un ocular, el espectador examina la muestra a través del monitor de la computadora o la pantalla del televisor, como una cámara web con una lente. La mayoría de estos microscopios son portátiles y pueden guardar imágenes como archivos o videos. Sin embargo, la mayoría tiene solo un aumento de bajo nivel y la iluminación adecuada puede ser un problema.

Los microscopios de bolsillo son portátiles, duraderos y útiles para el trabajo de campo. Los tamaños varían y algunos son del tamaño de un bolígrafo de tinta. La mayoría usa luz natural o funciona con baterías, con un aumento de 25x a 100x. Los microscopios portátiles también pueden ser digitales.


Historia de los microscopios

1590: Dos fabricantes de anteojos holandeses y un equipo de padre e hijo, Hans y Zacharias Janssen, crea el primer microscopio.

1667: Robert Hookees famoso "Micrografía" se publica, que describe los diversos estudios de Hooke utilizando el microscopio.

1675: Ingresar Anton van Leeuwenhoek, quien usó un microscopio con una lente para observar insectos y otras muestras. Leeuwenhoek fue el primero en observar bacterias. Siglo XVIII: a medida que la tecnología mejoraba, la microscopía se hizo más popular entre los científicos. Parte de esto se debió al descubrimiento de que la combinación de dos tipos de vidrio reducía el efecto cromático.

1830: Joseph Jackson Lister descubre que el uso de lentes débiles juntos a varias distancias proporciona un aumento nítido.

1878: Una teoría matemática que relaciona la resolución con la longitud de onda de la luz es inventada por Ernst Abbe.

1903: Richard Zsigmondy inventila el ultramicroscopio, que permite la observación de muestras por debajo de la longitud de onda de la luz.

1932: Los materiales biológicos transparentes se estudian por primera vez utilizando Frits XernikeInvención del microscopio de contraste de fases.

1938: Solo seis años después de la invención del microscopio de contraste de fase, llega el microscopio electrónico, desarrollado por Ernst Ruska, quien se dio cuenta de que el uso de electrones en microscopía mejoraba la resolución.

1981: Imágenes de muestras en 3-D posibles con la invención del microscopio de túnel de barrido por Gerd Binnig y Heinrich Rohrer.

Origen: El origen de la palabra microscopio según el Diccionario Etimológico Online es el siguiente: 1656, del Mod.L. microscopium, lit. "un instrumento para ver lo pequeño", del griego. micro- (q.v.) + -skopion. "medios de visualización", de skopein "mirar". Microscópicos "de tamaño diminuto" se atestiguan desde la década de 1760.

Historia del microscopio compuesto

Así como los griegos tenían un sistema de calefacción radiante en pleno funcionamiento que funcionaba dos mil años antes de los que recién ahora se están introduciendo en los EE. UU., Los orígenes del microscopio óptico compuesto parecen remontarse, no a Holanda, Inglaterra o Francia, sino a China, que ¡Quizás sea apropiado dado el predominio actual de China en el suministro de microscopios de luz compuestos!

El microscopio de agua

Según un antiguo texto chino, los chinos vieron especímenes ampliados a través de una lente al final de un tubo, el cual se llenó con diferentes niveles de agua según el grado de aumento que deseaban lograr. Ingenioso, eficaz y repetible en el hogar, hoy. Que esto ocurriera hace unos 4.000 años en la dinastía Chow-Foo y más de 3.500 años antes de que naciera el "padre de la microscopía moderna" es bastante notable.

Que estos antiguos chinos alcanzaran niveles de aumento de 150 veces el estándar actual, o 100 moou, es impresionante. Es como si hubieran desarrollado un automóvil urbano que lograra Mach II. Si construyeron un automóvil de este tipo, nunca se ha encontrado ninguna referencia a él. Del mismo modo, no hay más referencias conocidas a un dispositivo de microscopio compuesto de este tipo hasta que volvamos a los griegos.

Nada menos que una persona Aristóteles describe el funcionamiento de un microscopio con cierto detalle. Los griegos ciertamente hicieron un buen uso de las lentes curvas, que son un componente esencial de cualquier microscopio estéreo o compuesto. Los niños de la antigua Grecia probablemente compartían la sensación de triunfo de todos los niños estadounidenses al usar una lente curva o lupa para encender un fuego. Los griegos, sin embargo, también lo usaban para procedimientos quirúrgicos, no en hormigas como suelen hacer los niños pequeños, sino en personas, para cauterizar heridas y lesiones causadas por la lepra, etc.

Los antiguos egipcios y romanos también usaban varias lentes curvas, aunque no se ha encontrado ninguna referencia a un microscopio compuesto. Sin embargo, los griegos nos dieron la palabra "microscopio". Viene de dos palabras griegas, "uikpos", pequeño y "okottew", vista. Sin embargo, aunque los antiguos chinos, griegos y romanos aplicaron su infinita sabiduría al tema, no se conoce ninguna referencia ni al uso de luz artificial ni a múltiples lentes. En otras palabras, podemos dar gran crédito a los Antiguos por su previsión y logros, pero tenemos que buscar en otra parte para descubrir tanto el primer microscopio óptico como el compuesto.

Increíblemente, las próximas referencias históricas que tengan algo que ver con los microscopios, o más exactamente, la óptica son 1.200 años después de que Roma fuera saqueada e, incluso entonces, las referencias son solo al uso de lentes en la invención de las gafas. Dicho de otra manera, algunas de las personas más inteligentes que el planeta haya producido, jugado y trabajado con lentes individuales durante varios miles de años sin ir más lejos.

Gafas

Luego, en unos pocos años en Toscana, Italia, dos hombres afirmaron haber inventado gafas de forma independiente. ¿La evidencia? ¡Sus lápidas! Uno, Salvano d'Aramento degli Amati murió en 1284 en Florencia y afirmó haber mantenido el proceso en secreto. El otro, Allessandro della Spina murió en 1317 y afirmó haber revelado su proceso. Pisa y Florencia están a un corto galope de distancia. ¿Coincidencia? Tú decides.

En cualquier caso, un monje local, Girodina da Rivalta pronunció un sermón en 1306 en el que respaldó con entusiasmo los anteojos como un invento formidable y, de paso, indicó que habían estado en uso durante unos 20 años. Finalmente, en 1289, otro local de la Familia Popozo Lamentó que "estoy tan debilitado por la edad que sin los anteojos conocidos como anteojos, ya no podría leer ni escribir".

Telescopios

Aproximadamente al mismo tiempo, parece que se estaban utilizando lentes en los primeros telescopios. En el siglo XIII, el inglés, Roger Bacon los analiza en profundidad. Tanto las gafas como los microscopios son relevantes para los microscopios porque trazan el uso cada vez más sofisticado de lentes, el componente óptico esencial de cualquier microscopio.

Luego, apenas 200-300 años después, encontramos una plétora de referencias y evidencia sólida tanto de telescopios como de microscopios. Había llegado el Renacimiento y con él un abundante florecimiento de las artes y las ciencias. Más importante aún, con la invención de la imprenta, las ideas y los desarrollos se pudieron difundir fácil y rápidamente. Como resultado, Thomas Digges'trabajo en el telescopio en Inglaterra a mediados del siglo XVI y Hans LippersheyEl trabajo que incluyó la solicitud de una patente de telescopio se transmitió a otros, incluido nada menos que un genio Galileo.

Galileo inmediatamente comenzó a trabajar con lentes. En poco tiempo, desarrolló un telescopio mejorado con un dispositivo de enfoque y pasó a conquistar las estrellas. Dicho esto, también debemos rendir homenaje a Sir Isaac Newton quien aproximadamente al mismo tiempo en el Reino Unido, inventó el telescopio reflector.

Microscopios compuestos

Pero, ¿qué pasa con los microscopios? Bueno, lo mismo Hans Lippershey y su hijo, Zaccharias Hanssen estaba experimentando con una variedad de lentes. A finales de la década de 1590, utilizaron varias lentes en un tubo y se sorprendieron al ver que el objeto al final del tubo se magnificó significativamente más allá de la capacidad de una lupa. Acababan de inventar el microscopio compuesto. Es decir, habían descubierto que una imagen ampliada con una sola lente puede ampliarse aún más con una segunda o más lentes.

Luego, a mediados del siglo XVII, un inglés, Robert Hooke y un holandés, Anthony Van Leeuwenhoek llevó el microscopio a nuevos niveles. Hooke era un genio enfermizo al que le encantaba experimentar. Lo hizo en una amplia gama de campos de estudio científicos y con un éxito prolífico. Inventó la articulación universal, el diafragma iris (otro componente clave de muchos microscopios de luz modernos), un respirador, un escape de ancla y un resorte de equilibrio para relojes.

También elaboró ​​la teoría correcta de la combustión e ideó una ecuación que describe la elasticidad que todavía se utiliza hoy en día ("Ley de Hooke") e inventó o mejoró instrumentos meteorológicos como el barómetro, el anemómetro, el higrómetro, etc. Micrografía, sus estudios con un microscopio, publicados en 1665. La micrografía se convirtió de la noche a la mañana en una sensación no solo por lo que describió sino por los soberbios dibujos que hizo.

Describió un mundo nuevo junto con dibujos exquisitos de los pelos punzantes de una ortiga, una pulga y, lo más famoso de todo, la estructura de panal o "células" de un corcho. Fue Hooke quien acuñó el término "células" al describir el tejido vivo. Curiosamente, si bien Hooke usó un microscopio compuesto, descubrió que le fatigaba mucho y debilitaba su vista. Para su Micrographia, prefirió usar un microscopio simple de lente única hecho de oro y cuero e iluminado por una vela. ¿Quizás el primer microscopio óptico?

Antonie van Leeuwenhoek - el padre del microscopio

Sin embargo, fue Leeuwenhoek quien vivió al mismo tiempo que Hooke y se basó en el trabajo de Hooke para llevar el diseño del microscopio a nuevos niveles de sofisticación. Como cortinaje, usó un microscopio simple para examinar la tela. Como científico, comenzó a experimentar con nuevas formas de pulir lentes para mejorar la calidad óptica. En total, molió unas 550 lentes, algunas de las cuales tenían un poder de aumento lineal de 500 y un poder de resolución de una millonésima de pulgada, un logro asombroso.

Leeuwenhoek detalló estos logros en casi 200 cartas a la Royal Society en Londres, donde nada menos que una persona que Robert Hooke los validó. El resultado de todo este trabajo fue un microscopio de mano simple, de lente única. La muestra se montó en la parte superior del puntero, encima del cual había una lente convexa unida a un soporte de metal. A continuación, se observó la muestra a través de un orificio en el otro lado del microscopio y se enfocó con un tornillo.

Quizás su experimento más famoso se produjo en 1674 cuando vio un poco de agua del lago:

"Ahora vi muy claramente que se trataba de pequeñas anguilas, o gusanos, acostados todos acurrucados y retorciéndose como si vieran, con ela simple vista, una tarrina llena de anguilas y agua, con las anguilas retorciéndose entre sí y toda el agua parecía estar viva con estos múltiples animálculos.

Esta fue para mí, entre todas las maravillas que he descubierto en la naturaleza, la más maravillosa de todas y debo decir, por mi parte, que no ha llegado a mis ojos una vista más agradable que la que han visto estos miles de seres vivientes. todos vivos en una pequeña gota de agua, moviéndose entre sí, cada criatura tiene su propio movimiento ".

Había descubierto bacterias. Se había ganado su título de Padre del Microscopio. Curiosamente, pasó hasta 1839, casi doscientos años después, antes de que las células fueran finalmente reconocidas como las unidades básicas de la vida.

Siglos XVIII / XIX

El siguiente gran paso en la historia del microscopio ocurrió otros 100 años después con la invención de la lente acromática por Charles Hall, en la década de 1730. Descubrió que al usar una segunda lente de diferente forma y propiedades de refracción, podía realinear los colores con un impacto mínimo en la ampliación de la primera lente.

Luego, en 1830, Joseph Lister resolvió el problema de la aberración esférica (la luz se dobla en diferentes ángulos dependiendo de dónde golpea la lente) colocando lentes a distancias precisas entre sí. Combinados, estos dos descubrimientos contribuyeron a una marcada mejora en la calidad de la imagen. Anteriormente, debido a la mala calidad del vidrio y la lente imperfecta, los microscopistas no veían más que imágenes distorsionadas, algo así como las primeras radios eran extremadamente crujientes.

Cabe recordar que hasta ahora, cada nuevo paso ha sido en la calidad o aplicación de las lentillas. Luego, en 1863, uno de los varios nuevos fabricantes de microscopios, el Ernst Leitz empresa, abordó un problema mecánico con la introducción de la primera torreta giratoria con no menos de cinco objetivos.

Esta mejora fue seguida rápidamente en 1866 cuando Carl Zeiss reclutado Ernst Abbe como su director de investigación en Zeiss Optical Works. Abbe estableció el marco de lo que se convertiría en el enfoque moderno de desarrollo de la óptica computacional. Dejó clara la diferencia entre aumento y resolución y criticó la práctica de usar oculares con un aumento demasiado alto como "aumento vacío". En 1869, su trabajo produjo un nuevo dispositivo de iluminación patentado: el condensador Abbe.

Condensador Abbe: El trabajo de Abbe sobre una teoría ondulatoria de imágenes microscópicas (la condición sinusoidal de Abbe) hizo posible el desarrollo de una nueva gama de diecisiete objetivos microscópicos; tres de ellos fueron los primeros objetivos de inmersión y todos fueron diseñados en base a modelos matemáticos. Como señaló Abbe, sus creaciones se "basaron en un estudio preciso de los materiales utilizados, los diseños en cuestión se especifican mediante cálculo hasta el último detalle - cada curvatura, cada grosor, cada apertura de una lente - por lo que cualquier enfoque de prueba y error es excluido ".

A partir de aquí, los microscopios se diseñaron basándose en las sólidas leyes de la física en lugar del ensayo y error que había caracterizado a los pioneros. Al mismo tiempo, varias empresas establecieron plantas de fabricación especializadas centradas en la fabricación de microscopios de precisión. La investigación y el desarrollo siguieron dando frutos.

En 1880 se empezaron a utilizar los primeros microtomos que permitieron preparar muestras significativamente más delgadas para mejorar la muestra. En 1893, otro empleado de Zeiss, August Kohler, descubrió un sistema de iluminación incomparable que todavía se conoce como iluminación Kohler. Al usar diafragmas dobles, el sistema proporciona los beneficios triples de una muestra uniformemente iluminada, una imagen brillante y un deslumbramiento mínimo. En otras palabras, Kohler logró una imagen casi perfecta.

El mercado masivo de microscopios había llegado al mismo tiempo que la ingeniería de precisión y no es de extrañar que se obtuvieran una gran cantidad de resultados asombrosos: en 1879, Walter Flemming descubrió la mitosis celular y los cromosomas, un logro reconocido como uno de los 100 científicos más importantes. logros de todos los tiempos.

Siglo 20

A la vuelta de los siglos XIX y XX Luis Pasteur inventó la pasteurización mientras Robert Koch descubrió sus famosos o infames postulados: el bacilo del ántrax, el bacilo de la tuberculosis y el vibrio del cólera.

UV y fase: Para 1900, se alcanzó el límite teórico de resolución para microscopios de luz visible (2000 angstroms). En 1904, Zeiss superó esta limitación con la introducción del primer microscopio UV comercial con una resolución dos veces mayor que la de un microscopio de luz visible. En 1930 Fritz Zernike descubrió que podía ver células sin teñir usando el ángulo de fase de los rayos. Despreciado por Zeiss, su innovación de contraste de fase no se introdujo hasta 1941, aunque ganó un Premio Nobel por su trabajo en 1953.

Microscopios electrónicos: En 1931 Max Knoll y Ernst Ruska inventó el primer microscopio electrónico que superó las limitaciones ópticas de la luz. La física dicta que los microscopios ópticos están limitados por la física de la luz a un aumento de 500x o 1000x y una resolución de 0,2 micrómetros.

Knoll y Ruska construyeron un microscopio electrónico de transmisión (TEM), uno que transmite un haz de electrones (en oposición a la luz) a través de la muestra. La interacción posterior del haz de electrones con la muestra se registra y se transforma en una imagen. Luego, en 1942, Ruska mejoró el TEM construyendo el primer microscopio electrónico de barrido (SEM) que transmite un haz de electrones a través de la muestra.

Los principios de Ruska todavía forman la base de los microscopios electrónicos modernos: ¡microscopios que pueden alcanzar niveles de aumento de hasta 2 millones de veces! El segundo gran avance de los microscopios en el siglo XX fue la evolución del mercado de masas. Comenzó en el siglo XIX cuando Leitz afirmó haber exportado 50,000 microscopios a los EE. UU., Esta tendencia se aceleró en el siglo XX. Como resultado, surgió un gran número de fabricantes para ofrecer alternativas a precios más competitivos a empresas europeas establecidas como Zeiss y Leitz.

Porcelana: China se ha convertido en un importante proveedor de microscopios para uso diario y, con la evolución de su capacidad de fabricación óptica, ahora suministra componentes ópticos a algunas de las principales marcas de microscopios. Esta tendencia del mercado ha tenido un efecto beneficioso sobre el precio de los microscopios, permitiendo la difusión de los microscopios más allá del ámbito del científico investigador para el uso comercial e individual diario.

Nuevas fuentes de luz: halógenas, fluorescentes y LED, todas han mejorado o agregado una mayor versatilidad al microscopio óptico, mientras que la llegada de los soportes de brazo ha dado lugar a extensas aplicaciones de inspección comercial que no se pueden realizar con una base de microscopio de pedestal estándar. Sin embargo, la innovación más reciente ha sido la llegada del microscopio digital.

Microscopios digitales: Los microscopios digitales permiten la transmisión de imágenes en vivo a un televisor o pantalla de computadora y han ayudado a revolucionar la microfotografía. Los microscopios digitales simplemente integran una cámara de microscopio digital en el puerto trinocular de un microscopio estándar. Una solución alternativa y más flexible es simplemente colocar una cámara de microscopio digital en un microscopio trinocular.

Dino-Lite: Una de las innovaciones más originales del siglo XXI han sido los microscopios digitales Dino-Lite. Los Dino-Lite son microscopios digitales portátiles, no mucho más grandes que un bolígrafo grueso. Ofrecen capacidad de zoom de baja potencia con un aumento de hasta 500x. Han tenido un impacto marcado en las aplicaciones de inspección industrial.


Aberración

Varias aberraciones influyen en la nitidez o la calidad de la imagen. Las aberraciones cromáticas producen franjas de colores alrededor de las regiones de alto contraste de la imagen, porque las longitudes de onda de luz más largas (como el rojo) se enfocan en un plano ligeramente más alejado de la lente que las longitudes de onda más cortas (como el azul). La aberración esférica produce una imagen en la que el centro del campo de visión está enfocado cuando la periferia puede no estarlo y es una consecuencia del uso de lentes con superficies esféricas (en lugar de no esféricas o asféricas). La distorsión produce imágenes curvas a partir de líneas rectas en el objeto. El tipo y grado de distorsión visible está íntimamente relacionado con la posible aberración esférica en la lupa y suele ser más grave en lentes de alta potencia.


Cómo funciona un microscopio electrónico de barrido

  • Fuente de electrones
  • Columna por la que viajan los electrones con lentes electromagnéticos
  • Detector de electrones
  • Cámara de muestra
  • Computadora y pantalla para ver las imágenes

Los electrones se producen en la parte superior de la columna, se aceleran hacia abajo y pasan a través de una combinación de lentes y aberturas para producir un haz de electrones enfocado que golpea la superficie de la muestra. La muestra se monta en una platina en el área de la cámara y, a menos que el microscopio esté diseñado para operar a vacíos bajos, tanto la columna como la cámara son evacuadas por una combinación de bombas. El nivel de vacío dependerá del diseño del microscopio.

Esquema de un microscopio electrónico de barrido

La posición del haz de electrones en la muestra se controla mediante bobinas de exploración situadas sobre la lente del objetivo. Estas bobinas permiten escanear el haz sobre la superficie de la muestra. Esta trama o barrido del haz, como sugiere el nombre del microscopio, permite recolectar información sobre un área definida de la muestra. Como resultado de la interacción electrón-muestra, se producen varias señales. Estas señales son luego detectadas por detectores apropiados.


OBSERVACIONES DEL MICROSCOPIO ELECTRÓNICO SOBRE LA ORGANIZACIÓN SUBMICROSCÓPICA DE LAS VARILLAS RETINALES

Eduardo De Robertis OBSERVACIONES DEL MICROSCOPIO ELECTRÓNICO SOBRE LA ORGANIZACIÓN SUBMICROSCÓPICA DE LAS VARILLAS RETINALES. J Biophys y Biochem Cytol 25 de mayo de 1956 2 (3): 319–330. doi: https://doi.org/10.1083/jcb.2.3.319

La organización submicroscópica de las varillas retinianas del conejo se ha estudiado con microscopía electrónica de alta resolución en cortes longitudinales y transversales delgados. El segmento de varilla exterior consiste en una pila de sacos aplanados o cisternas, cada uno de ellos limitado por una fina membrana homogénea de aproximadamente 30 A. La membrana de los sacos de varilla está unida a la superficie de la membrana y también está en continuidad con tallos tubulares cortos de aproximadamente 100 a 150 A que aparentemente terminan en relación con el cilio de conexión.

El haz de filamentos que constituyen la conexión entre los segmentos exterior e interior se describe bajo el nombre de cilio de conexión. Este componente fibroso tiene una estructura muy similar a la del cilio. Muestra 9 pares de filamentos periféricos de aproximadamente 160 A de diámetro, un material de matriz y una membrana de superficie. Muy raramente se observan dos filamentos individuales centrales. El cilio conector tiene un cuerpo basal típico en el segmento interno, su extremo distal penetra en el segmento externo, donde establece alguna relación estructural con los sacos de las varillas. Las relaciones y la organización submicroscópica del cilio conector se estudiaron en cortes longitudinales y transversales pasando a diferentes niveles de los segmentos de la barra.

El segmento de varilla interior muestra dos regiones distintas: una distal y una proximal. La región distal, correspondiente al elipsoide de la histología clásica, está compuesta principalmente por mitocondrias empaquetadas longitudinalmente. También contiene el cuerpo basal del cilio, vacuolas del retículo endoplásmico, partículas densas y una matriz intermedia con filamentos muy finos.

En la región proximal del segmento interno faltan las mitocondrias y dentro de la matriz es posible reconocer elementos del complejo de Golgi, vacuolas del retículo endoplásmico, partículas densas y numerosas neuroprotofibrillas de 160 a 200 A de diámetro que se acumulan y forman una haz definido a la salida de la fibra de la varilla.

Se discute la interpretación de las fibras de conexión como una porción de un cilio y del segmento externo como una diferenciación de la parte distal de un cilio primitivo. Se enfatiza la importancia de la continuidad de las membranas superficiales del segmento externo, que conecta el cilio y el segmento interno y se discute su posible papel fisiológico.


Microscopios

Olympus es un fabricante líder de microscopios para la industria y las ciencias de la vida. Con más de 100 años de experiencia en el desarrollo de microscopios, ofrecemos soluciones ópticas innovadoras para muchas aplicaciones. Explore nuestros microscopios para la educación, la capacitación, los laboratorios y la investigación de vanguardia en los campos de las ciencias de la vida, como la patología y la citología. Consulte nuestros últimos sistemas de microscopio de escaneo láser, súper resolución, estéreo, vertical, invertido y de investigación con zoom macro haciendo clic en los enlaces a continuación.


2.3: Instrumentos de microscopía - Biología

Los microscopios son instrumentos diseñados para producir imágenes visuales o fotográficas ampliadas de objetos demasiado pequeños para ser vistos a simple vista. El microscopio debe realizar tres tareas: producir una imagen ampliada de la muestra, separar los detalles de la imagen y hacer que los detalles sean visibles para el ojo humano o la cámara. Este grupo de instrumentos incluye no solo diseños de lentes múltiples (microscopios compuestos) con objetivos y condensadores, sino también instrumentos de lente única muy simples que a menudo son de mano, como una lupa o una lupa.

El microscopio ilustrado en la Figura 1 es un microscopio compuesto simple inventado por el microscopista británico Robert Hooke en algún momento de la década de 1660. Este microscopio bellamente diseñado tiene una lente de objetivo cerca de la muestra y se enfoca girando el cuerpo del microscopio para acercar o alejar el objetivo de la muestra. Se inserta una lente ocular en la parte superior del microscopio y, en muchos casos, hay una "lente de campo" interna dentro del cilindro para aumentar el tamaño del campo de visión. El microscopio de la Figura 1 se ilumina a través de la lámpara de aceite y el depósito esférico lleno de agua, también ilustrado en la Figura 1. La luz de la lámpara se difunde cuando pasa a través del depósito y luego se enfoca sobre la muestra con una lente colocada en el depósito. . Este primer microscopio sufría de aberraciones cromáticas (y esféricas), y todas las imágenes vistas con luz blanca contenían "halos" que eran de color azul o rojo.

Dado que muchos usuarios de microscopios dependen de la observación directa, es importante comprender la relación entre el microscopio y el ojo. Nuestros ojos son capaces de distinguir el color en la parte visible del espectro: de violeta a azul a verde a amarillo a naranja a rojo, el ojo no puede percibir los rayos ultravioleta o infrarrojos. El ojo también es capaz de detectar diferencias de brillo o intensidad que van del negro al blanco y todos los tonos de gris intermedios. Por lo tanto, para que una imagen sea vista por el ojo, la imagen debe presentarse al ojo en colores del espectro visible y / o grados variables de intensidad de luz. Los receptores oculares de la retina que se utilizan para detectar el color son las células cónicas; las células para distinguir los niveles de intensidad, no el color, son las células bastón. Estas células están ubicadas en la retina en la parte posterior del interior del ojo. La parte frontal del ojo (ver Figura 2), incluido el iris, la córnea curva y el cristalino, son respectivamente los mecanismos para admitir la luz y enfocarla en la retina.

Para que una imagen se vea claramente, debe extenderse sobre la retina en un ángulo visual suficiente. A menos que la luz incida sobre filas no adyacentes de células de la retina (en función del aumento y la extensión de la imagen), no podemos distinguir los detalles cercanos como separados (resueltos). Además, debe haber suficiente contraste entre los detalles adyacentes y / o el fondo para hacer visible la imagen resuelta ampliada.

Tutorial interactivo de Java
Acomodación del ojo humano La acomodación del ojo se refiere al acto fisiológico de ajustar los elementos del cristalino para alterar el poder de refracción y enfocar con nitidez los objetos que están más cerca del ojo. Este tutorial explora los cambios en la estructura de la lente a medida que los objetos se reubican con respecto al ojo.

Debido a la capacidad limitada del cristalino del ojo para cambiar su forma, los objetos que se acercan mucho al ojo no pueden tener sus imágenes enfocadas en la retina. La distancia de visualización convencional aceptada es de 10 pulgadas o 25 centímetros.

Hace más de quinientos años, se desarrollaron simples lupas de vidrio. Eran lentes convexas (más gruesas en el centro que en la periferia). La muestra u objeto podría entonces enfocarse mediante el uso de la lupa colocada entre el objeto y el ojo. Estos "microscopios simples" podrían difundir la imagen en la retina mediante un aumento mediante el aumento del ángulo visual en la retina.

El "microscopio simple" o lupa alcanzó su máximo estado de perfección, en el siglo XVII, en la obra de Anton von Leeuwenhoek, quien pudo ver animales unicelulares (a los que llamó "animálculos") e incluso algunas bacterias más grandes con un microscopio simple similar al ilustrado en la Figura 3. La imagen producida por tal lupa, sostenida cerca del ojo del observador, parece como si estuviera en el mismo lado de la lente que el objeto mismo. Esta imagen, vista como si estuviera a diez pulgadas del ojo, se conoce como imagen virtual y no se puede capturar en una película.

Hacia principios del siglo XVII, gracias al trabajo atribuido a los hermanos Janssen (ver el microscopio en la Figura 4) en los Países Bajos y Galileo en Italia, se desarrolló el microscopio compuesto. En su forma más simple, constaba de dos lentes convexas alineadas en serie: un objeto de vidrio (objetivo) más cercano al objeto o muestra y un ocular (ocular) más cercano al ojo del observador (con medios para ajustar la posición de la muestra y el lentes de microscopio). El microscopio compuesto logra un aumento de dos etapas. El objetivo proyecta una imagen ampliada en el tubo del cuerpo del microscopio y el ocular amplía aún más la imagen proyectada por el objetivo.

Los microscopios compuestos desarrollados durante los siglos XVII y XVIII se vieron obstaculizados por la aberración óptica (tanto cromática como esférica), un defecto que se agrava con el uso de múltiples lentes. Estos microscopios eran en realidad inferiores a los microscopios de lente única de la época debido a estos artefactos. Las imágenes que producían a menudo estaban borrosas y tenían los halos de colores asociados con las aberraciones cromáticas que no solo degradan la calidad de la imagen, sino que también dificultan la resolución. A mediados de la década de 1700, los fabricantes de lentes descubrieron que al combinar dos lentes de vidrio con diferentes dispersiones de color, gran parte de la aberración cromática podría reducirse o eliminarse. Este descubrimiento se utilizó por primera vez en telescopios, que tienen lentes mucho más grandes que los microscopios. No fue hasta principios del siglo XIX que las lentes con corrección cromática se volvieron comunes en los microscopios compuestos.

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Vías de luz de microscopía transmitida Explore las vías básicas de luz a través de un microscopio de luz transmitida.

Los siglos XVIII y XIX fueron testigos de una gran mejora en la calidad mecánica y óptica de los microscopios compuestos. Los avances en las máquinas herramienta permitieron fabricar piezas más sofisticadas y, a mediados del siglo XIX, el latón era la aleación elegida para la producción de microscopios de alta calidad. Varios fabricantes de microscopios británicos y alemanes florecieron durante este período de tiempo. Sus microscopios variaron ampliamente en diseño y calidad de producción, pero los principios generales que definen sus propiedades ópticas se mantuvieron relativamente constantes. El microscopio ilustrado en la Figura 5 fue fabricado por Hugh Powell y Peter Lealand alrededor de 1850. La base del trípode proporcionó un soporte resistente para el microscopio, que muchas personas consideran el más avanzado de su período.

A fines del siglo XIX, existía un alto grado de competencia entre los fabricantes de microscopios y los costos de desarrollo y producción de los microscopios se convirtieron en un factor importante. El latón, el material elegido por los fabricantes de microscopios, es muy caro y fue una tarea larga mecanizar, pulir y lacar cuerpos de microscopios y otras piezas mecanizadas a partir de este metal. Para reducir los gastos, los fabricantes de microscopios comenzaron a pintar la parte exterior del cuerpo y el soporte del microscopio, así como el escenario y otras partes no móviles.

Durante el primer cuarto del siglo XX, muchos fabricantes de microscopios habían comenzado a sustituir el latón por el hierro fundido en los marcos y escenarios de los microscopios. El hierro era mucho más barato y no se podía distinguir del latón cuando se pintaba de negro. También comenzaron a galvanizar muchos de los componentes críticos de latón, como perillas, cilindros de objetivos, boquillas, oculares y conjuntos de platina mecánicos (ilustrados en la Figura 6). Estos microscopios de principios del siglo XX todavía estaban suscritos a un motivo de diseño común. Eran monoculares con un espejo en la subplaca que se usaba con una lámpara externa para iluminar el espécimen. Un microscopio típico de la época es el microscopio de laboratorio Zeiss que se muestra en la Figura 6. Este tipo de microscopio es muy funcional y muchos todavía se utilizan en la actualidad.

Los microscopios modernos superan con creces las especificaciones de diseño de los fabricados antes de mediados del siglo XX. Las formulaciones de vidrio se han mejorado enormemente, lo que permite una mayor corrección de la aberración óptica que nunca, y los recubrimientos de lentes sintéticos antirreflejos son ahora muy avanzados. La tecnología de circuitos integrados ha permitido a los fabricantes producir microscopios "inteligentes" que incorporan microprocesadores en el soporte del microscopio.La fotomicrografía a fines del siglo XX es más fácil que nunca con accesorios auxiliares que monitorean la intensidad de la luz, calculan la exposición en función de la velocidad de la película y realizan automáticamente tareas complicadas como el horquillado, la exposición múltiple y la fotografía a intervalos.

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Ensamblaje de microscopio Descubra cómo se ensamblan varias piezas en un microscopio de última generación con este tutorial.

El microscopio ilustrado en la Figura 7 es un microscopio de investigación Olympus Provis AX70. Este microscopio representa el último diseño de vanguardia que incorpora múltiples iluminadores (episcópicos y diascópicos), analizadores y polarizadores, prismas DIC, accesorios de fluorescencia y capacidades de contraste de fase. El sistema de fotomicrografía es lo último en sofisticación y rendimiento con medición puntual, control automático de exposición y aumento del zoom para un encuadre fácil y flexible. El marco en forma de Y está diseñado para ser fácil de usar al ofrecer la máxima comodidad y facilidad de uso para el operador.

La discusión anterior abordó el concepto básico de lo que es un microscopio y tocó una historia abreviada que comienza en el siglo XVII y progresa a través de los tiempos modernos. Hay una serie de temas adicionales que son de suma importancia para obtener una comprensión completa de los microscopios y la microscopía. Estos temas se discutirán en secciones posteriores de la cartilla.

Prácticamente todo el mundo, en un momento u otro, ha visto el mundo a través de un microscopio óptico. Para la mayoría de las personas, esta experiencia ocurre durante la capacitación en biología en la escuela secundaria o la universidad, aunque algunos empresarios científicos han comprado sus propios microscopios, ya sea individualmente o como parte de un kit de ciencias. La fotografía a través del microscopio, o más comúnmente, la fotomicrografía, ha sido durante mucho tiempo una herramienta útil para los científicos. Durante muchos años, las ciencias biológicas y médicas se han basado en gran medida en la microscopía para resolver problemas relacionados con las características morfológicas generales de las muestras, así como en una herramienta cuantitativa para registrar características y datos ópticos específicos. En este sentido, el microscopio óptico ha demostrado su utilidad en innumerables investigaciones sobre los misterios de la vida.

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Vías de luz de microscopía reflejada Explore las vías básicas de luz a través de un microscopio de luz reflejada (episcópica).

Más recientemente, la microscopía ha disfrutado de un crecimiento explosivo como herramienta en las ciencias físicas y de los materiales, así como en la industria de los semiconductores, debido a la necesidad de observar las características de la superficie de los nuevos materiales de alta tecnología y los circuitos integrados. La microscopía también se está convirtiendo en una herramienta importante para los científicos forenses que examinan constantemente pelos, fibras, ropa, manchas de sangre, balas y otros elementos asociados con delitos. Los avances modernos en las tinciones de fluorocromos y las técnicas de anticuerpos monoclonales han presagiado un crecimiento explosivo en el uso de la microscopía de fluorescencia tanto en el análisis biomédico como en la biología celular.

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Vías de luz de microscopía de fluorescencia Explore las vías de luz reflejada y el filtrado dicroico en microscopía de fluorescencia.

Las diferencias básicas entre microscopía biomédica y de materiales implican cómo el microscopio proyecta luz sobre la muestra. En la microscopía biológica clásica, se preparan muestras muy delgadas y la luz se pasa o transmite a través de la muestra, se enfoca con el objetivo y luego se pasa a los oculares del microscopio. Para observar la superficie de los circuitos integrados (que comprenden el funcionamiento interno de las computadoras modernas), la luz pasa a través del objetivo y luego se refleja desde la superficie de la muestra hacia el objetivo del microscopio. En la nomenclatura científica, la microscopía de luz transmitida y reflejada se conoce como microscopía iluminada diascópica y episcópica, respectivamente. Las microfotografías en nuestras galerías de fotos se derivan de investigaciones científicas microscópicas ópticas transmitidas y reflejadas.

Uno de los problemas más graves de la microscopía es el escaso contraste que se produce cuando la luz pasa a través de muestras muy delgadas o se refleja en superficies con un alto grado de reflectividad. Para evitar esta falta de contraste, los científicos han perfeccionado varios "trucos" ópticos para aumentar el contraste y proporcionar variaciones de color en las muestras. La variedad de técnicas en la bolsa de microscopistas incluyen: luz polarizada, imágenes de contraste de fase, contraste de interferencia diferencial, iluminación de fluorescencia, iluminación de campo oscuro, iluminación de Rheinberg, contraste de modulación de Hoffman y el uso de varios filtros ópticos de gelatina. En la sección Técnicas de microscopía especializadas de este manual se proporciona una discusión detallada de estas técnicas. Las referencias se proporcionan tanto en forma bibliográfica clásica como en enlaces a sitios web en la página de inicio de la cartilla de microscopía. Estos deberían servir para proporcionar más detalles de microscopía y fotomicrografía a los lectores interesados, así como enlaces a material adicional en la World Wide Web.

Mortimer Abramowitz - Olympus America, Inc., Two Corporate Center Drive., Melville, Nueva York, 11747.

Michael W.Davidson - Laboratorio Nacional de Alto Campo Magnético, 1800 East Paul Dirac Dr., Universidad Estatal de Florida, Tallahassee, Florida, 32310.


2.3: Instrumentos de microscopía - Biología

FORMULARIOS REQUERIDOS PARA ESTE LABORATORIO

Los modelos que se encuentran en la mayoría de las escuelas utilizan lentes compuestos y luz para magnificar objetos. Los lentes doblan o refractan la luz, lo que hace que el objeto debajo de ellos parezca más cercano.

Este microscopio permite la visualización binocular (dos ojos) de muestras más grandes. (El microscopio giratorio en la parte superior de esta página es un estereoscopio)

Microscopio electrónico de barrido (SEM)

Este microscopio permite a los científicos ver un universo demasiado pequeño para ser visto con un microscopio óptico. Los SEM no usan ondas de luz, usan electrones (partículas eléctricas cargadas negativamente) para magnificar objetos hasta dos millones de veces.

Microscopio electrónico de transmisión (TEM)

Este microscopio también usa electrones, pero en lugar de escanear la superficie (como con el SEM), los electrones pasan a través de muestras muy delgadas.

El microscopio ha sido uno de los instrumentos clave utilizados por el biólogo durante cientos de años. Se realizaron varias mejoras a los microscopios ópticos durante los primeros dos o tres siglos después de su invención. Desde el cambio de siglo, sin embargo, no ha habido mejoras significativas. Ha habido avances continuos en los métodos de preparación y análisis de muestras. También ha habido modificaciones en el microscopio óptico que permiten nuevos métodos de análisis (contraste de fase, fluorescencia, barrido láser confocal, etc.) y la introducción del microscopio electrónico que puede llevar el análisis microscópico al nivel molecular.

El objetivo principal de un microscopio es ampliar y aumentar la visibilidad de un objeto pequeño. La ampliación de una lente siempre está grabada en ella. Utilizará un microscopio compuesto que tiene un sistema de lentes. El total
El aumento del alcance es un producto de los aumentos de la lente del objetivo y el ocular (o lente ocular). Por ejemplo, utilizando un objetivo de baja potencia (aumento = 3.4X) y un ocular estándar (aumento = 10X), el aumento total es 34X.

La resolución es un atributo importante de un microscopio. El límite de resolución de un sistema óptico es la distancia mínima por la cual dos objetos pueden separarse y aún percibirse como distintos. Dos puntos situados más cerca de este límite se verán como uno. Una mayor resolución permite ver un objeto con mayor nitidez y distinguir los detalles internos.

Una iluminación adecuada te permitirá obtener la mejor resolución posible. La iluminación debe ajustarse para cada objetivo cada vez que se realiza un cambio. Los ajustes que afectarán la iluminación de su microscopio implican cambiar el diafragma del iris. El diafragma de iris se utiliza para hacer coincidir la apertura (apertura) con la del objetivo. No debe usarse para controlar la intensidad de la iluminación. Con algunas muestras transparentes o sin teñir, puede ser necesario cerrar ligeramente el iris para mejorar el contraste. Esto siempre se hace a expensas de la resolución. Demasiada luz a través del diafragma lavará la muestra que está viendo de manera similar a ver un objeto con una luz brillante de fondo.

BOSQUEJO 1
** Dibuje un microscopio óptico compuesto y etiquete lo siguiente: E yepiece, Objective, Stage,
Ajuste fino, ajuste grueso, diafragma

Vínculo a continuación para examinarse a sí mismo sobre las partes de un microscopio óptico compuesto. Tú haces no debe enviar las respuestas para el cuestionario con su informe de laboratorio.

A continuación se proporciona un enlace alternativo al video de Microcope.


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Figura 1.10
Carcinoma de células alveolares

En los Estados Unidos, el cáncer de pulmón es la principal causa de muerte relacionada con el cáncer entre hombres y mujeres. La popularidad de fumar tabaco a lo largo del siglo XX generalmente se considera responsable de la prevalencia de la enfermedad, ya que los cigarrillos se han relacionado con aproximadamente el 90 por ciento de los casos de cáncer de pulmón en hombres y el 80 por ciento en mujeres. Sin embargo, el carcinoma de células alveolares parece no tener relación con el tabaquismo. También conocido como carcinoma broncoalveolar, el carcinoma de células alveolares parece ser más probable que se desarrolle en individuos cuyos pulmones han sido marcados por otras enfermedades, como esclerodermia, tuberculosis o fibrosis. La progresión de esta variedad de carcinoma puede ser muy lenta y los pacientes con la enfermedad a menudo tienen un mejor pronóstico que las personas con otros tipos de cáncer de pulmón. Vea la imagen microscópica de arriba del carcinoma de células alvolares. Los orgánulos de color púrpura más oscuro que ves en las células individuales son los núcleos de las células alveolares en los pulmones. Los núcleos normales deben tener forma redonda u oblonga. Observe que muchos de los núcleos están deformados (triangulares o cúbicos). Estos núcleos deformados son indicativos de células de carcinoma anormales. Haga clic en el enlace de abajo para ver la misma imagen de arriba con muchas de las células cancerosas en un círculo verde.

I) Bacterias

Observe la siguiente imagen que ilustra los tres tipos diferentes de bacterias. Utilice los enlaces que se proporcionan a continuación para ver diapositivas microscópicas de cada una de las tres formas de bacterias.

BOSQUEJO 2
** Identifique las diferentes formas de bacterias en su boceto como: Baccilus, Cocci, Spirillum

Bacilo (En forma de varilla)

Cocci (Forma esférica)

SpirillumEn forma de espiral)

II) Tejido adiposo

La imagen de la derecha es una vista microscópica 100X de una sección transversal de tejido adiposo. Las grandes estructuras blancas son las células adiposas (grasas). Las estructuras más pequeñas de color rojo oscuro son los núcleos de las células individuales.

BOSQUEJO 3
**Dibuja solo algunas de las celdas de la imagen de la derecha. Los objetos de color rojo oscuro que puedes ver son los núcleos de las células.

Video de una vista microscópica 100X de una gota de agua de un estanque. Haga clic en la flecha para ver el video.

La variedad de organismos que ve aquí sería típica de la mayoría de los estanques de agua dulce. Los pequeños organismos esféricos que se ven flotando son bacterias. Los organismos verdes grandes y pequeños que se mueven rápidamente y que se mueven rápidamente son paramecio que se alimentan de bacterias. Los organismos con forma de sombrero son vorticella nuevamente alimentándose de bacterias. Las masas de color marrón verdoso más oscuro son colonias de bacterias y algas. Los organismos rectangulares verdes son algas verdes. Las hebras largas y delgadas esparcidas por toda la muestra son algas verdeazuladas.

Puede encontrar un enlace alternativo a continuación:

Algunas películas interesantes con microscopía óptica

Haga clic en los enlaces a continuación para ver un oso de agua moviéndose bajo un poder microscópico de 250X

Oso de agua 1

Oso de agua 2

Una ameba envuelve un alimento en un proceso llamado fagocitosis con un aumento de 400x

Los pseudópodos, o pies falsos, se extienden y retraen a medida que esta ameba se mueve a través del campo del microscopio con un aumento de 100x.

Una mirada cercana y personal al funcionamiento interno de un paramecio con un aumento de 400x

Un grupo de paramecios nadadores (los organismos más pequeños), que se parecen más a un grupo de autos chocadores cuando chocan y rebotan entre sí.

Usar el microscopio para ver las diferencias entre células normales y células cancerosas

1) ¿Cuál es la función del diafragma?
2) Describe la ventaja de tener un microscopio de máxima resolución.
3) Calcule el aumento del sistema de lentes de lo siguiente:
a) Ocular-10X Objetivo-10X
b) Ocular-10X Objetivo-43X
c) Ocular-10X Objetivo-1X
d) Ocular-10X Objetivo-2X
4) ¿Cuál es el atributo más importante de un microscopio?

Haga clic aquí para obtener una versión en MS WORD de las preguntas

Haga clic aquí para obtener una versión en PDF de las preguntas

** Vaya al siguiente sitio para enlazar a un microscopio óptico virtual. En el sitio del microscopio virtual, deberá realizar el tutorial para aprender a usar el microscopio. Haga clic en el enlace PARA EMPEZAR en la parte superior izquierda. Después de aprender a usar el microscopio y ver las muestras, responda las preguntas que se dan a continuación sobre Microscopía de luz virtual.


MICROSCOPIO DE LUZ VIRTUAL

A) Realice el tutorial (Introducción) para que aprenda a utilizar el microscopio.
B)
Hay cuatro diapositivas para ver. Elija ver el portaobjetos de frotis de mejilla. Puede ver los demás si lo desea; sin embargo, las preguntas se referirán solo a frotis de mejilla.
C) Utilizará las potencias de los objetivos de 10X, 40X y 100X
D) Utilice las barras deslizantes de enfoque e iluminación para ver mejor las células de las mejillas.
MI) Responder a la Preguntas sobre microscopía de luz virtual proporcionado a continuación.

Puede utilizar el enlace de la página a continuación para acceder a una imagen etiquetada del microscopio

1) ¿Cuántas células individuales puedes contar con los siguientes poderes objetivos de aumento?
a) 10 veces
B) 40X
C) 100X
2)
Si el ocular tiene una potencia de 10X, ¿cuál es el aumento total cuando observa las células con una potencia objetiva de 40X?
3)
¿A qué potencia eres capaz de discernir el núcleo de las células? (El núcleo es el orgánulo grande y oscuro ubicado cerca del centro de la célula)
4)
Describe qué sucede si hay demasiada iluminación.

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Encuentre a continuación los enlaces a otros sitios virtuales de microscopía óptica

Durante el último medio siglo se han desarrollado dos tipos de microscopios electrónicos: el microscopio electrónico de transmisión (TEM) y el microscopio electrónico de transmisión (SEM). Estos instrumentos contienen lentes magnéticos que enfocan un haz de electrones sobre la muestra. Los electrones utilizados de esta manera generan una longitud de onda que puede ser 100.000 veces más corta que la de la luz visible. Como resultado, los microscopios electrónicos tienen poderes de resolución hasta 400 veces superiores a los de los microscopios ópticos y 200 000 veces superiores a los del ojo humano.

El TEM bombardea una muestra delgada con electrones. Dependiendo de su composición, los componentes de la muestra transmiten, absorben o desvían los electrones. La imagen producida en una placa fotográfica es una traducción visual de esta interacción de electrones con la muestra. El microscopio electrónico de transmisión dio a los científicos su primera mirada al mundo de los virus, invisible al microscopio óptico, y hoy nos permite ver moléculas y átomos.

El SEM es bastante diferente del TEM. Está diseñado para generar imágenes tridimensionales de detalles de la superficie. Este microscopio mueve un haz de electrones hacia adelante y hacia atrás sobre la superficie de una muestra recubierta de metal provocando la emisión de electrones secundarios de la muestra. Los electrones secundarios producen las impresionantes imágenes características de la microscopía electrónica de barrido.

Video de cómo funciona un microscopio electrónico. Haga clic en la flecha para ver el video.

Puede encontrar un enlace alternativo a continuación:


Figura 1.16
Micrografía electrónica de transmisión
del virus de la poliomielitis

Figura 1.17
Micrografía electrónica de transmisión
del virus del Ébola

Video de numerosas vistas microscópicas electrónicas de barrido de células del cuerpo humano. Haga clic en la flecha para ver el video.

Puede encontrar un enlace alternativo a continuación:

Para observar (resolver) objetos de menos de 0,2 m se requiere la utilización de microscopía electrónica (EM). En lugar de usar luz visible, los microscopios electrónicos enfocan un haz de electrones en una sección muy delgada de material biológico que se ha preservado químicamente (fijo) e incrustado en plástico. Los electrones tienen una longitud de onda mucho más corta que los fotones de luz visible utilizados en LM. Dado que el poder de resolución está inversamente relacionado con la longitud de onda, los microscopios electrónicos modernos pueden resolver objetos de aproximadamente 0,2 m. Es este tremendo aumento en la resolución lo que ha permitido a los biólogos discernir los detalles precisos de la estructura celular. Aunque es una herramienta poderosa, solo las células conservadas químicamente se pueden observar con EM. La observación rutinaria de células vivas mediante microscopios electrónicos es un objetivo aún por alcanzar.

El tipo de microscopía electrónica descrito anteriormente se conoce generalmente como microscopía electrónica de transmisión (TEM). En TEM, el haz de electrones pasa directamente a través de la muestra, excepto cuando los electrones son desviados por átomos de metales pesados ​​(plomo y / o uranio) que se han utilizado para "teñir" la muestra, los electrones transmitidos se enfocan en una película fotográfica donde se visualiza la imagen y grabado.

Una variación de este enfoque es la microscopía electrónica de barrido (SEM). En SEM, el haz de electrones escanea la superficie de una muestra que ha sido recubierta con una fina capa de oro. El haz de electrones excita los átomos de la muestra provocando que expulsen electrones que se recogen y se convierten en una imagen que se muestra en un monitor. La imagen que se produce tiene una gran profundidad de campo y, por tanto, parece ser tridimensional. SEM se utiliza para revelar los detalles de la superficie de varios tipos de células.

**Vaya al siguiente sitio para experimentar con un microscopio electrónico de barrido virtual. Responda las preguntas sobre microscopía electrónica virtual que se dan a continuación.
MICROSCOPIO ELECTRÓNICO VIRTUAL

A) Hay tres especímenes para ver que se muestran en el lado izquierdo.
B) Puede utilizar el botón AUMENTAR de la máquina para acercar la muestra.
C) Responda las preguntas sobre sus experiencias en este sitio a continuación.

1) ¿Cuántas células madre puedes contar?
2) ¿Cuáles de las células son más grandes, las células madre o las células T?
3) ¿Qué celda es la más grande?
4) Describe la forma del glóbulo rojo.
5) ¿Qué crees que son las hebras rosadas alrededor de las fibras nerviosas?
6) ¿El microscopio electrónico permite un mayor grado de aumento que el microscopio óptico? ¿Por qué?

Haga clic aquí para obtener una versión en MS WORD de las preguntas

Haga clic aquí para obtener una versión en PDF de las preguntas

Un enlace a otro microscopio electrónico virtual

Algo interesante sobre las medidas

Vea la Vía Láctea a 10 millones de años luz de la Tierra.Luego, muévase a través del espacio hacia la Tierra en sucesivos órdenes de magnitud hasta llegar a un alto roble en las afueras de los edificios del Laboratorio Nacional de Alto Campo Magnético en Tallahassee, Florida. Después de eso, comience a pasar del tamaño real de una hoja a un mundo microscópico que revela las paredes celulares de las hojas, el núcleo celular, la cromatina, el ADN y, finalmente, al universo subatómico de electrones y protones.

Película de medidas

Pruebe esta gran animación interactiva de medidas. Deslice el control deslizante en la parte inferior de la interacción para ver elementos más pequeños o más grandes.

¿Qué tamaño tienen las bacterias y los virus?

Use este sitio para ver el tamaño relativo de cosas como amebas, células de la piel, cromosomas, bacterias, etc. Use la barra deslizante en la parte inferior de la página para acercar objetos más pequeños.

Escala


Ver el vídeo: Lab Exercise 2: Microscopes and Cell Shapes (Agosto 2022).


Figura 1.18
Micrografía electrónica de barrido de
VIH cultivado en linfocitos cultivados


Figura 1.19
Micrografía electrónica de barrido de
Treponema pallidum
(El agente causante de la sífilis)