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¿Algo puede causar roturas y enlaces cruzados en el ADN?

¿Algo puede causar roturas y enlaces cruzados en el ADN?


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Una rotura de doble hebra en el ADN es exactamente eso: las hebras de ADN se cortan. Un entrecruzamiento ocurre cuando algo forma un enlace covalente entre dos nucleótidos en el ADN. Sin embargo, ¿es posible que algo forme tanto una reticulación como una rotura de doble hebra (o de una hebra)? Por ejemplo, ¿podría una parte de una molécula causar una ruptura mientras que otra reacciona para formar un entrecruzamiento?

Para los propósitos de esta pregunta, las enzimas o proteínas que hacen esto (si las hay) también cuentan.


El cisplatino forma enlaces cruzados de ADN-proteína (es decir, ADN-proteína-ADN por extensión) in vitro [1] y una revisión [2] dice que el cisplatino conduce a DSB (aunque no puedo acceder a la fuente primaria en este momento). Pero ya sabes, con la excepción de la radiación ionizante, los mutágenos generalmente no causan DSB directamente. Es causado por procesos de reparación o cosas como el estancamiento en las horquillas de replicación debido al mutágeno.

[1] https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1874601/

[2] https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4047912/#!po=11.9919


Radiación ultravioleta puede inducir tanto la reticulación del ADN como la rotura de las cadenas dobles. Aquí hay un documento que informa los determinantes de la secuencia de los enlaces cruzados intracatenarios inducidos por UV:

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11342214

Aquí hay un artículo donde los autores proponen que las roturas de doble hebra inducidas por UV son una consecuencia de la reparación de lesiones oxidativas, más que un resultado primario de la fotoquímica UV.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3488256/


La rotura del ADN subyace tanto al aprendizaje como al daño relacionado con la edad

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El proceso que permite que nuestros cerebros aprendan y generen nuevos recuerdos también conduce a la degeneración a medida que envejecemos, según un nuevo estudio realizado por investigadores del MIT.

El hallazgo, informado en un artículo publicado hoy en la revista Celda, en última instancia, podría ayudar a los investigadores a desarrollar nuevos enfoques para prevenir el deterioro cognitivo en trastornos como la enfermedad de Alzheimer.

Cada vez que aprendemos algo nuevo, nuestras células cerebrales rompen su ADN, creando un daño que las neuronas deben reparar de inmediato, según Li-Huei Tsai, profesor de neurociencia Picower y director del Instituto Picower para el aprendizaje y la memoria del MIT.

Este proceso es fundamental para el aprendizaje y la memoria. “Las células rompen fisiológicamente su ADN para permitir la expresión de ciertos genes importantes”, dice Tsai. "En el caso de las neuronas, necesitan romper su ADN para permitir la expresión de genes de respuesta temprana, que en última instancia allanan el camino para el programa transcripcional que apoya el aprendizaje y la memoria, y muchos otros comportamientos".

Reparación de ADN más lenta

Sin embargo, a medida que envejecemos, la capacidad de nuestras células para reparar este daño en el ADN se debilita, lo que lleva a la degeneración, dice Tsai. “Cuando somos jóvenes, nuestros cerebros crean roturas de ADN a medida que aprendemos cosas nuevas, pero nuestras células están absolutamente al tanto de esto y pueden reparar rápidamente el daño para mantener la funcionalidad del sistema”, dice Tsai. "Pero durante el envejecimiento, y particularmente con algunas condiciones genéticas, la eficiencia del sistema de reparación del ADN se ve comprometida, lo que lleva a la acumulación de daño y, en nuestra opinión, esto podría ser muy perjudicial".

En investigaciones anteriores sobre la enfermedad de Alzheimer en ratones, los investigadores encontraron que incluso en la fase presintomática del trastorno, las neuronas en la región del hipocampo del cerebro contienen una gran cantidad de lesiones en el ADN, conocidas como roturas de doble hebra.

Para determinar cómo y por qué se generan estas roturas de doble hebra, y qué genes se ven afectados por ellas, los investigadores comenzaron a investigar qué sucedería si crearan tal daño en las neuronas. Aplicaron un agente tóxico a las neuronas que se sabe que inducen roturas de doble hebra y luego recolectaron el ARN de las células para secuenciarlo.

Descubrieron que de los 700 genes que mostraban cambios como resultado de este daño, la gran mayoría tenía niveles de expresión reducidos, como se esperaba. Sin embargo, sorprendentemente, 12 genes, conocidos por ser los que responden rápidamente a la estimulación neuronal, como una nueva experiencia sensorial, mostraron un aumento en los niveles de expresión después de las rupturas de la doble hebra.

Para determinar si estas rupturas ocurren naturalmente durante la estimulación neuronal, los investigadores luego trataron las neuronas con una sustancia que hace que las sinapsis se fortalezcan de manera similar a la exposición a una nueva experiencia.

“Efectivamente, descubrimos que el tratamiento aumentó muy rápidamente la expresión de esos genes de respuesta temprana, pero también causó roturas de la doble hebra del ADN”, dice Tsai.

Lo bueno con lo malo

En estudios posteriores, los investigadores pudieron confirmar que una enzima conocida como topoisomerasa IIβ es responsable de las roturas del ADN en respuesta a la estimulación, según el autor principal del artículo, Ram Madabhushi, un postdoctorado en el laboratorio de Tsai.

“Cuando derribamos esta enzima, encontramos que tanto la formación de roturas de doble cadena como la expresión de genes de respuesta temprana se redujeron”, dice Madabhushi.

Finalmente, los investigadores intentaron determinar por qué los genes necesitan un mecanismo tan drástico para permitir su expresión. Mediante análisis computacional, estudiaron las secuencias de ADN cercanas a estos genes y descubrieron que estaban enriquecidas con un motivo o patrón de secuencia para unirse a una proteína llamada CTCF. Se sabe que esta proteína "arquitectónica" crea bucles o dobleces en el ADN.

En los genes de respuesta temprana, las curvas creadas por esta proteína actúan como una barrera que evita que diferentes elementos del ADN interactúen entre sí, un paso crucial en la expresión de los genes.

Las roturas de doble hebra creadas por las células les permiten colapsar esta barrera y permiten que se expresen los genes de respuesta temprana, dice Tsai.

"Sorprendentemente, entonces, aunque la sabiduría convencional dicta que las lesiones del ADN son muy malas, ya que este 'daño' puede ser mutagénico y, a veces, conducir al cáncer, resulta que estas rupturas son parte de la función fisiológica de la célula", dice Tsai.

Investigaciones anteriores han demostrado que la expresión de genes involucrados en el aprendizaje y la memoria se reduce a medida que las personas envejecen. Así que los investigadores ahora planean llevar a cabo más estudios para determinar cómo el sistema de reparación del ADN se altera con la edad y cómo esto compromete la capacidad de las células para hacer frente a la producción y reparación continuas de roturas de doble hebra.

También planean investigar si ciertos químicos podrían mejorar esta capacidad de reparación del ADN.

El artículo representa un avance conceptual importante en nuestra comprensión de la regulación genética, según Bruce Yankner, profesor de genética y neurología en la Escuela de Medicina de Harvard que no participó en la investigación.

“El trabajo vincula elegantemente la formación de rupturas de la cadena de ADN por la enzima topoisomerasa IIβ con el control temporal de la transcripción, proporcionando la evidencia más convincente hasta la fecha de que este es un mecanismo central de control de la transcripción”, dice. "Anticipo que este avance tendrá amplias implicaciones que van desde la biología básica de la transcripción hasta los mecanismos patológicos involucrados en enfermedades como la enfermedad de Alzheimer".


Capítulo 14 mutación y reparación del ADN

Ejemplo de cáncer de colon:
- múltiples mutaciones necesarias en genes clave (supresores de tumores y pro octona para todos los cánceres)
- el punto clave es que las mutaciones se originan en una célula y luego se transmiten a las células hijas, pero solo en ese linaje. (por lo que no todas las células se ven afectadas)

ejemplo:
- Los efectos de una deleción de tres nucleótidos se pueden ver en la fibrosis quística.
-Las mutaciones responsables de la fibrosis quística están en el gen que codifica el regulador de conductancia transmembrana de la fibrosis quística
-El mal funcionamiento de CFTR causa desequilibrios iónicos que resultan en secreciones anormales de los muchos tipos de células en las que se expresa el gen CFTR.

SUPRESIÓN: falta una región del cromosoma.
-Una deleción puede resultar de un error en la replicación o de la unión de roturas en un cromosoma que ocurren en cualquier lado de la región eliminada. Aunque una deleción puede eliminar un gen que es esencial para la supervivencia, la deleción puede persistir en la población porque los cromosomas generalmente ocurren en pares homólogos. Si un miembro de un par homólogo tiene una deleción de un gen esencial pero el gen está presente en el otro miembro del par, esa copia del gen suele ser suficiente para la supervivencia y la reproducción. En estos casos, la deleción puede transmitirse de generación en generación y persistir sin causar daño, siempre que el cromosoma esté presente junto con un cromosoma normal.
-Algunas deleciones disminuyen la posibilidad de supervivencia o reproducción de un organismo incluso cuando el cromosoma homólogo es normal. En general, cuanto mayor sea la eliminación, menor será la posibilidad de supervivencia.

-Por lo general, no es el número total de copias de cada gen lo que importa, sino más bien el número de copias de cada gen en relación con otros genes.

- Algunos tipos de daño afectan la estructura de la doble hélice del ADN. Estos incluyen roturas en la columna vertebral de azúcar-fosfato, uno de los principales efectos mutagénicos de los rayos X. Las roturas pueden ocurrir en una sola hebra del ADN o en ambas. La luz ultravioleta puede causar enlaces cruzados entre bases de pirimidina adyacentes, especialmente timina, lo que resulta en la formación de dímeros de timina. La unión covalente entre timinas adyacentes en una hebra de ADN hace que la doble hélice se pellizque, tanto el surco principal como el surco menor se ensanchen y el emparejamiento de bases T-A se debilite.

- otro tipo de daño estructural es la pérdida de una base de uno de los azúcares desoxirribosa, lo que resulta en un espacio en una hebra donde no hay base presente. La pérdida espontánea de una base de purina es uno de los tipos más comunes de daño del ADN, que ocurre a una tasa de aproximadamente 13.000 purinas perdidas por célula humana por día. La mayoría de estas mutaciones resultan de la interacción entre el ADN y los subproductos metabólicos normales. La tasa aumenta con la edad y también puede aumentar por la exposición a agentes oxidantes como lejía doméstica o peróxido de hidrógeno.

-Otros tipos de daño afectan a las propias bases. Las bases que están dañadas químicamente tienden a emparejarse incorrectamente. Algunas bases se dañan espontáneamente cuando la reacción con una molécula de agua reemplaza un grupo amino (-NH2) con un átomo de oxígeno (= O), lo que interfiere con la capacidad de la base para formar enlaces de hidrógeno con un complemento. Algunas moléculas de origen natural imitan bases y pueden incorporarse al ADN y provocar sustituciones de nucleótidos. La cafeína imita una base de purina, por ejemplo (aunque para ser mutagénica, la cantidad de cafeína necesaria es mucho más de lo que cualquier persona normal podría consumir).

-Los productos químicos que son altamente reactivos tienden a ser mutagénicos, a menudo porque agregan grupos laterales voluminosos a las bases que dificultan el emparejamiento de bases adecuado

-Un tipo de ligasa sella las roturas de una sola hebra en el ADN y un tipo diferente sella las roturas de doble hebra. Las roturas bicatenarias a menudo resultan en reordenamientos cromosómicos porque es menos probable que se reparen que las roturas monocatenarias. Además de su importancia en la replicación y reparación del ADN, las ligasas son una herramienta importante en la investigación en biología molecular porque permiten unir moléculas de ADN de diferentes fuentes para producir ADN recombinante.
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- ADN ligasa se encarga de las roturas en la columna vertebral del ADN
- requiere un grupo de 5'PO y 3'OH para hacer una unión de phostiered con el fin de reparar esa rotura.

-Alrededor del 99% de las bases mal apareadas se corrigen inmediatamente mediante la función de corrección de pruebas de la ADN polimerasa, en la que el nucleótido mal apareado se elimina inmediatamente después de la incorporación y se reemplaza por el nucleótido correcto.
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- la corrección de pruebas es la función de la ADN polimerasa.
- cuando se coloca un nucleótido incorrecto, la polimerasa tiene una función de edición de 3 'a 5'. da un paso atrás. (la replicación ocurre de 5 'a 3')

-reparación de errores de emparejamiento postreplicación Corrección de una base de emparejamiento incorrecto en una hebra de ADN escindiendo una de las cadenas principales de la hebra, degradando la secuencia con el apareamiento erróneo y resintetizando a partir de la hebra de ADN intacta.
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- MutS (enzima) reconoce las bases no emparejadas
- MutL identifica la hebra que lleva la base incorrecta
- MutH rompe la columna vertebral para que otra enzima que viene a continuación (exonucleasa) pueda eliminar los nucleótidos sucesivos, incluida la base no emparejada.
- La ADN polimerasa luego llena el espacio y una ligasa se une a la columna vertebral.

- reparación de escisión de base: corrige bases anormales o dañadas
En el primer paso de la reparación por escisión de la base, una base anormal o dañada se escinde del azúcar en la columna vertebral del ADN. Luego, el azúcar sin base se elimina de la columna vertebral, dejando un espacio de un nucleótido. Finalmente, una polimerasa de reparación inserta el nucleótido correcto en el espacio.
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- una enzima (glicosilato) viene específicamente y elimina la base mientras deja la columna vertebral intacta.
- la brecha que se ha creado es luego reparada por otras enzimas

- reparación por escisión de nucleótidos: mecanismo que se utiliza para reparar los tramos cortos de ADN que contienen bases dañadas o mal emparejadas.
-tiene un mecanismo de acción similar para la reparación de desajustes pero utiliza diferentes enzimas
-En lugar de degradar una cadena de ADN nucleótido por nucleótido hasta que se elimine el desajuste, la reparación por escisión de nucleótidos elimina una sección entera dañada de una cadena de una vez. La reparación por escisión de nucleótidos también se usa para eliminar nucleótidos con grupos laterales voluminosos, así como dímeros de timina resultantes de la luz ultravioleta.
-La importancia de la reparación por escisión queda ilustrada por la enfermedad del xeroderma pigmentoso (XP), en la que la reparación por escisión de nucleótidos es defectuosa. Las personas con XP son sumamente sensibles a la radiación ultravioleta de la luz solar. Debido al defecto en la reparación por escisión de nucleótidos, el daño al ADN resultante de la luz ultravioleta no se corrige, lo que lleva a la acumulación de mutaciones en las células de la piel. El resultado son altas tasas de cáncer de piel. Las personas con XP deben minimizar su exposición a la luz solar y, en casos extremos, mantenerse alejadas del sol por completo.
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-se ha dañado más de una base (por ejemplo: se podría agregar un grupo voluminoso)
- una enzima escinde la columna vertebral del ADN en los sitios que flanquean el daño.
- el daño luego se elimina
- luego se repara la brecha.


Introducción

El ADN celular está constantemente alterado por factores endógenos y exógenos, lo que da como resultado decenas de miles de lesiones en una célula humana todos los días (Lindahl, 1993). Este daño se puede clasificar en dos tipos según el tamaño: ADN no voluminoso y ADN voluminoso. Las lesiones de ADN no voluminosas incluyen desajustes de bases, sitios abásicos y pequeñas modificaciones de bases, que en general se reparan mediante reparación de desajustes (MMR), reparación de escisión de bases (BER), reparación de incisión de nucleótidos (NIR), reparación de reversión directa (DRR), y síntesis de ADN por translesión (TLS) (Gros et al., 2004 Fortini y Dogliotti, 2007 Sharma et al., 2013 Yi y He, 2013 Ignatov et al., 2017). Las lesiones voluminosas del ADN incluyen, entre otros tipos de daños: roturas de doble hebra, enlaces cruzados de ADN-proteína (DPC) y enlaces cruzados de ADN intra e intercatenario. La complejidad estructural de ciertas lesiones voluminosas de ADN requiere el uso de varias vías de reparación de ADN que actúan de manera coordinada, incluida la recombinación homóloga (HR), la unión de extremos de ADN no homólogo (NHEJ), la reparación por escisión de nucleótidos (NER), TLS y BER Sistema de señalización de la anemia de Fanconi (FA) y maquinaria proteolítica compleja (Ishchenko et al., 2006 Ho y Sch & # x00E4rer, 2010 Duxin et al., 2014 Tretyakova et al., 2015 Martin et al., 2017). Las lesiones de ADN no voluminosas causan perturbaciones del ADN limitadas y locales, mientras que las voluminosas inducen distorsiones significativas en la estructura general de la hélice del ADN (Ide et al., 2011). Los enlaces cruzados de ADN-proteína (DPC) se forman cuando una proteína se une covalentemente al ADN (Tretyakova et al., 2015). Son difíciles de reparar debido a su carácter súper voluminoso en comparación con las lesiones voluminosas del ADN que distorsionan la hélice, como los dímeros de pirimidina inducidos por rayos UV. Estos aductos súper voluminosos se pueden generar mediante la exposición de las células a agentes de reticulación endógenos y exógenos (Stingele et al., 2017 Zhang et al., 2020). La presencia de proteína unida covalentemente al ADN interfiere fuertemente con la replicación, transcripción, reparación y remodelación de la cromatina del ADN (Kuo et al., 2007 Klages-Mundt y Li, 2017 Yudkina et al., 2018 Ji et al., 2019). Las DPC se pueden clasificar en cinco tipos, según la naturaleza del enlace covalente en el complejo ADN-proteína y la presencia de roturas de la cadena de ADN (Ide et al., 2015, 2018 Nakano et al., 2017). El tipo 1, el tipo más común de DPC, se forma cuando las proteínas se unen covalentemente a una base nitrogenada en el ADN no alterado. Los enlaces cruzados de tipo 2-4 ocurren cuando las enzimas que cortan el ADN quedan atrapadas en un intermedio covalente con una hebra de ADN (Ide et al., 2015, 2018 Nakano et al., 2017). El tipo 2 se forma cuando las glicosilasas de ADN bifuncionales y las enzimas de reparación que contienen actividad de & # x03B2-liasa como la ADN polimerasa & # x03B2 y Parp1 se unen irreversiblemente a un sitio apurínico / apirimidínico (AP) escindido (Ide et al., 2015, 2018 Nakano et al., 2017). El tipo 3 se genera durante la escisión abortiva de la hebra de ADN por la topoisomerasa 1 (Top1) y la formación de un enlace tirosinil y fosfodiéster covalente entre la proteína y la fracción fosfato de ADN 3 & # x2032-terminal de SSB (Ide et al., 2015, 2018 Nakano et al. al., 2017). La acción abortiva de la topoisomerasa 2 (Top2) genera DPC de tipo 4, en la que la tirosina está ligada a los fosfatos 5 & # x2032-terminales de roturas de doble hebra (DSB) (Ide et al., 2015, 2018 Nakano et al., 2017 ). Recientemente, surgió un nuevo tipo de DPC después del descubrimiento de HMCES, una proteína de unión a 5-hidroximetilcitosina (5hmC) que puede reconocer sitios abásicos en el ADN monocatenario (ssDNA) y formar un entrecruzamiento covalente ssDNA-HMCES para prevenir la síntesis de translesiones propensa a errores. más allá de la lesión (Mohni et al., 2019). Debido a las diferencias de estructura y composición entre estos cinco grupos, cada tipo de DPC se procesa mediante un mecanismo de reparación distinto. Parece difícil eliminar el DPC de tipo 1 muy voluminoso en las vías de reparación de la escisión de ADN lineal canónica porque la presencia de una molécula de proteína bloquea el acceso al ADN. Sin embargo, estudios recientes han revelado que la reparación por escisión de nucleótidos (NER) y la recombinación homóloga (HR) pueden eliminar ciertos tipos de DPC de una manera dependiente de nucleasas (Zhang et al., 2020). Sin embargo, todavía no está claro si estas vías de reparación podrían hacer frente a otros tipos de DPC. Stingele y col. (2017) han propuesto que cada componente de DPC: ADN, proteína y el enlace covalente entre ellos podría procesarse mediante tres mecanismos de reparación diferentes. Un artículo reciente de K & # x00FChbacher y Duxin (2020) proporciona una revisión completa sobre la formación y reparación de DPC. En esta revisión, resumimos el conocimiento actual sobre los mecanismos de reparación implicados en la eliminación de las DHC inducidas por diversos agentes genotóxicos. El entrecruzamiento covalente al ADN ocurre con mayor frecuencia con proteínas de unión al ADN, como las histonas, los factores de transcripción y las enzimas que metabolizan el ADN, incluidos los factores de reparación y las topoisomerasas (Klages-Mundt y Li, 2017). En el núcleo celular, las histonas se ensamblan en un octámero que forma el núcleo del nucleosoma con 147 pb de ADN envuelto y fuertemente unido a él (Luger et al., 1997, 2012). Esta estructura básica de la cromatina convierte a las histonas en objetivos primarios de los agentes de entrecruzamiento del ADN, lo que conduce a la formación de entrecruzamientos de ADN-histonas (DHC) (Solomon y Varshavsky, 1985). Actualmente, los mecanismos de reparación que contrarrestan las DHC generadas por varios factores solo comenzaron a desmoronarse.

Vínculos cruzados de ADN-histonas (DHC)

El ADN nucleosómico se empaqueta en unidades compactas denominadas cromosomas, en las que las partículas del nucleosoma del núcleo están conectadas por tramos de ADN enlazador de hasta 80 pb de longitud. Una partícula de núcleo de nucleosoma (NCP) se compone de dos copias de cada una de las histonas H2A, H2B, H3 y H4. El peso molecular de las histonas individuales varía de 11 a 22 KDa, mientras que el peso molecular del octámero de histonas en NCP es 210 KDa (Eickbush y Moudrianakis, 1978 Luger et al., 1997). La estabilidad del nucleosoma se basa en varias interacciones proteína-proteína y numerosos enlaces electrostáticos y de hidrógeno no covalentes entre las histonas y el dúplex de ADN (Luger et al., 1997, 2012 Davey et al., 2002 Rohs et al., 2009 ). La estructura primaria de la cromatina se puede representar como una organización de cuentas en una cadena de nucleosomas individuales, que se pueden plegar aún más en estructuras compactas secundarias y terciarias, con la ayuda de variantes de histonas presentes en ciertos nucleosomas y modificaciones postraduccionales ( PTM) situadas en colas de histonas desordenadas (Woodcock y Dimitrov, 2001 Luger et al., 2012). El plegamiento de la cromatina en estructuras primarias, secundarias y terciarias es crucial para regular la accesibilidad del ADN a la maquinaria compleja de múltiples proteínas involucradas en la replicación, transcripción y reparación del ADN. Las interacciones no covalentes entre el ADN y las histonas permiten que la dinámica de la cromatina cambie entre las conformaciones abiertas y cerradas. Las DHC deterioran la flexibilidad de la cromatina, lo que posteriormente puede afectar las interacciones a larga distancia en la cromatina que alterarían indirectamente la replicación, transcripción y reparación del ADN dentro de un dominio de asociación topológica (TAD) (Hinz et al., 2010 Todd y Lippard, 2010 Tretyakova et al. , 2015 Hauer y Gasser, 2017 Nakano et al., 2017). Las DHC pertenecen al tipo 1, una forma no enzimática de DPC, en la que una proteína se une covalentemente a un ADN no interrumpido (Ide et al., 2011). Recientemente se han publicado varios estudios completos que describen los mecanismos de formación de las DHC (Ming et al., 2017 Shang et al., 2019 Yang y Greenberg, 2019), sin embargo, no se sabe si existen mecanismos de reparación específicos para la eliminación de las DHC. . En esta revisión, nos centramos principalmente en las vías de reparación de las DHC y describimos brevemente su formación.

Formación de DHC

Un complejo covalente soluble en agua de ADN e histonas (H2A y H2B) se identificó por primera vez en un ensayo de reticulación UV (Smith, 1966 Sperling y Sperling, 1978). Con este hallazgo, se hizo evidente que la irradiación UV puede inducir DHC además de los conocidos dímeros de pirimidina. Luego se descubrió que los aldehídos exógenos y endógenos también podrían formar DHC en las células (Lam et al., 1985 Kuykendall y Bogdanffy, 1992). Más del 10% de los residuos de aminoácidos en las histonas son lisinas, mientras que los aldehídos reaccionan preferentemente con los grupos & # x03B5-amino de las cadenas laterales de la lisina con la formación de una base de Schiff, que además reacciona con los grupos amino exocíclicos de guanina, adenina, y bases de ADN de citosina, creando enlaces metileno. Muchos agentes de reticulación, como cromato, iones metálicos y cisplatino (cis-diaminedicloroplatino-II), también inducen DHC en las células (Zhitkovich y Costa, 1992). Los compuestos de platino no solo causan enlaces cruzados ADN-ADN, sino que también unen covalentemente complejos ADN-proteína. En el caso de las histonas (Figura 1A), estos compuestos entrecruzan los grupos amino & # x03B5 de las lisinas y los átomos de N 7 de las guanosinas (Tretyakova et al., 2015 Ming et al., 2017). También se observaron enlaces cruzados entre ADN y residuos de metionina en una estructura de rayos X de nucleosomas tratados con compuestos de platino (Wu et al., 2008). La exposición del nucleosoma purificado a agentes alquilantes bifuncionales (p. Ej., Mostazas de nitrógeno) también reticula histonas con guanosinas en el ADN (Shang et al., 2019); sin embargo, estos tipos de reticulación en las células son mucho menos abundantes que el cruzamiento de ADN. -enlaces con cisteínas e histidinas de proteínas no histonas (Loeber et al., 2009).

Figura 1. Mecanismos de formación de enlaces cruzados de histona-ADN. (A) Mecanismos de reacción de los agentes de reticulación del ADN. (B) Reticulación directa de histonas con bases de ADN modificadas. (C) Un sitio básico mediaba la reticulación de histonas con el ADN. NCP-NH2: norte-amina terminal (lisina) de histonas en el núcleo del nucleosoma.

Las histonas también pueden reaccionar directamente con la 5-formilcitosina, una base de ADN modificado de origen natural, y la 8-oxoguanina, un importante producto de daño oxidativo del ADN. Los grupos amino de lisina reaccionan con 5-formilcitosina (Figura 1B), con la formación de una base de Schiff reversible (Li et al., 2017 Raiber et al., 2018). La reacción de las cadenas laterales de lisina con 8-oxoguanosina produjo un aducto de espiroiminodihidantoína (Sp) reticulado de proteína estable (Xu et al., 2008).

Finalmente, la mayoría de las DHC son producidas por una reacción entre las histonas lisinas y una forma de aldehído de la 2 & # x2032-desoxirribosa en los sitios apurínicos / apirimidínicos (AP) (Figura 1C) que se forman directamente tras el daño o se generan durante la escisión del daño. bases en la vía de reparación de la escisión de bases (Solomon y Varshavsky, 1985 Sczepanski et al., 2010). La base de Schiff resultante a menudo sufre ruptura de cadena y eliminación de DF, seguida de una inversión de un entrecruzamiento de histona-ADN. Dado que la histona surge inalterada de la reacción, todo el proceso a veces se denomina escisión de la hebra catalizada por histona en los sitios AP (Ren et al., 2019). Cabe señalar que las histonas PTM y el estado de la cromatina podrían tener un impacto significativo en la formación de DHC en sitios abásicos y con bases de ADN (Sczepanski et al., 2010 Bowman y Poirier, 2015).

Mecanismos de reparación de DHC

Aunque las DPC, especialmente las DHC, a menudo ocurren en las células y presentan una amenaza constante para la estabilidad del genoma, se presume que, a excepción de las tirosil-ADN fosfodiesterasas, no existe una vía especializada de reparación del ADN dedicada a hacer frente a estos grandes desafíos. En cambio, la célula emplea varios mecanismos distintos de reparación del ADN y degradación de proteínas para apuntar al ADN reticulado y los componentes de proteína / histona en un DPC / DHC determinado. La proteína unida covalentemente podría detectarse y degradarse a un péptido pequeño por la maquinaria proteolítica celular, como las proteasas especializadas SPRTN / Wss1, Ddi1 y GCNA1, o por el proteasoma, un complejo de proteasa de múltiples subunidades dependiente de ATP, mientras que el ADN dañado El componente se detecta y repara en las vías NER, BER, HR, NHEJ y FA.

Proteólisis dependiente del proteasoma de histonas reticuladas al ADN

La proteólisis mediada por proteasomas es la vía principal para la degradación de proteínas dañadas en una célula. Un proteasoma 26S consta de una partícula de núcleo 20S cilíndrica y una o dos partículas reguladoras 19S (Ciechanover, 1998 Lecker et al., 2006). Aunque el núcleo 20S puede unirse a diferentes partículas reguladoras, solo la partícula 19S confiere la capacidad de degradar proteínas ubiquitiladas (Coux et al., 1996 Adams, 2004 Stadtmueller y Hill, 2011). Considerando el papel vital del proteasoma en la degradación de la proteína dañada, la participación del proteasoma y ubiquitina en la proteólisis de DHC o DPC sigue siendo un tema de debate. Inhibición del proteasoma en Xenopus los extractos de huevo no estabilizaron las DPC (Nakano et al., 2007 Duxin et al., 2014). Sin embargo, muchos estudios sobre la reparación de DPC en células de mamíferos sugieren la participación del proteasoma (Adams, 2004 Baker et al., 2007 Zecevic et al., 2010 Larsen et al., 2019). La participación del proteasoma en la eliminación de DHC surgió por primera vez en la investigación de Quievryn y Zhitkovich (2000), quienes descubrieron que los inhibidores del proteasoma previenen la eliminación de DHC y sensibilizan a las células humanas a niveles más bajos de formaldehído. Un estudio en Xenopus Los extractos de huevo encontraron que las DPC son ubiquitiladas por la ubiquitina ligasa TRAIP E3 y posteriormente son degradadas por el proteasoma (Duxin et al., 2014 Larsen et al., 2019). Sin embargo, un estudio anterior demostró claramente que las DPC no están marcadas con cadenas de poliubiquitina, pero, sin embargo, están sujetas a degradación proteasomal por un mecanismo que no se comprende bien (Nakano et al., 2009). El proteasoma 26S puede degradar histonas no ubiquitiladas purificadas (Kisselev et al., 2006), lo que aumenta la posibilidad de degradación proteasomal de histonas dañadas no ubiquitiladas en las células. Un par de estudios han demostrado que durante el estrés de replicación inducido por agentes genotóxicos, las histonas son hiperacetiladas y luego degradadas específicamente de manera independiente de la ubiquitina por un complejo de proteasoma 20S con activador de proteasoma PA200, una partícula reguladora distinta (Qian et al., 2013 Mandemaker et al., 2018). Aunque estos estudios han demostrado que la degradación independiente de ubiquitina de histonas acetiladas alivia el estrés de replicación, no se puede excluir la función adicional del proteasoma PA200-20S en la reparación de DHC. Además, se detectó PA200 en motas nucleares y se ha propuesto su papel en la reparación del ADN (Ustrell et al., 2002). Por lo tanto, una comprensión más detallada del papel del proteasoma en la reparación de la DHC requiere una mayor investigación.

El proteasoma 20S es una partícula hueca en forma de barril compuesta por 28 subunidades no idénticas dispuestas en cuatro anillos apilados. Los sitios activos están secuestrados dentro de una cavidad interna separada de los complejos reguladores 19S y PA200 por un canal cerrado. Este canal 13 & # x00C5 es demasiado estrecho para que entre una proteína plegada (L & # x00F6we et al., 1995 Groll et al., 1997). Para la degradación completa de una proteína de ADN reticulado, el propio nucleótido de ADN reticulado tendría que entrar en la cámara proteolítica, tirando de una hebra de ADN hacia adentro. Sin embargo, el componente de ADN de un DPC puede ser demasiado voluminoso para ingresar al canal. Por lo tanto, el proteasoma puede eliminar solo una parte de una proteína entrecruzada, convirtiendo el DHC en un entrecruzamiento más pequeño de ADN-péptido. Alternativamente, las proteasas tradicionales, en las que un sitio activo está ubicado en una hendidura en la superficie de la enzima, podrían estar involucradas en la escisión de la mayor parte de la cadena polipeptídica no reticulada, que luego puede ser degradada por cualquiera de estas proteasas y por el proteasoma.


Agradecimientos

Agradecemos a S. Polo y P. Huertas por sus consejos, ya K. Dry por la ayuda experta con el texto y las figuras. El S.P.J. El laboratorio cuenta con el apoyo de subvenciones de Cancer Research UK, la Comisión Europea (proyectos GENICA y DNA Repair), el Wellcome Trust y el Consejo de Investigación en Biotecnología y Ciencias Biológicas. El laboratorio J.B. cuenta con el apoyo de subvenciones de la Sociedad Danesa del Cáncer, la Fundación Nacional de Investigación Danesa y la Comisión Europea (proyectos GENICA, Active p53, TRIREME y DNA Repair).

Contribuciones de autor S.P.J. y J.B. concibieron y escribieron todos los aspectos de este artículo.


Artículo de revisión

  • División de Biología de Radiación Molecular, Departamento de Oncología Radioterápica, UT Southwestern Medical Center, Dallas, TX, Estados Unidos

Las helicasas de ADN RecQ son una familia de proteínas conservadas que se encuentran en bacterias, hongos, plantas y animales. Estas helicasas desempeñan papeles importantes en múltiples funciones celulares, incluida la replicación, transcripción, reparación del ADN y mantenimiento de los telómeros del ADN. Humans have five RecQ helicases: RECQL1, Bloom syndrome protein (BLM), Werner syndrome helicase (WRN), RECQL4, and RECQL5. Defects in BLM and WRN cause autosomal disorders: Bloom syndrome (BS) and Werner syndrome (WS), respectively. Mutations in RECQL4 are associated with three genetic disorders, Rothmund–Thomson syndrome (RTS), Baller–Gerold syndrome (BGS), and RAPADILINO syndrome. Although no genetic disorders have been reported due to loss of RECQL1 or RECQL5, dysfunction of either gene is associated with tumorigenesis. Multiple genetically independent pathways have evolved that mediate the repair of DNA double-strand break (DSB), and RecQ helicases play pivotal roles in each of them. The importance of DSB repair is supported by the observations that defective DSB repair can cause chromosomal aberrations, genomic instability, senescence, or cell death, which ultimately can lead to premature aging, neurodegeneration, or tumorigenesis. In this review, we will introduce the human RecQ helicase family, describe in detail their roles in DSB repair, and provide relevance between the dysfunction of RecQ helicases and human diseases.


Advances in Radiation Biology

M.N. Cornforth , J.S. Bedford , in Advances in Radiation Biology , 1993

Publisher Summary

This chapter discusses the early development of ionizing radiation damage in chromosomes. Ionizing radiations are among the most potent of clastogens , apart from being mutagenic and oncogenic. Gross structural changes—such as translocations, inversions, and deletions—appear to constitute the principal genetic alterations that underlie the malignant transformation of cells, whereas dominantly acting point mutations involving single base changes in oncogenes appear to be of minor importance by comparison. Ionizing radiation is extremely inefficient in producing point mutations involving single base changes in mammalian cells. Ionizing radiations produce a wide spectrum of lesions, many of which are known to be produced in numbers exceeding aberration yields. In addition to permanent heritable changes in surviving germ cells leading to harmful effects in future generations, ionizing radiations can lead to cell reproductive death. This cell-killing process also appears to result largely from the production of certain kinds of gross chromosomal aberrations. There have been successful attempts to sequence stretches of DNA that span break points of spontaneous chromosomal exchange-type aberrations and large intragenic deletions within endogenous genes.


The right way to repair DNA

Salk scientists discover that CYREN microprotein helps cells choose best path to repair genes and avoid cancer. Left: Chromosomes (red) with telomeres (green) that are undisturbed remain pristine and separate. Right: when CYREN is absent, chromosomes that have been disturbed to artificially trigger NHEJ show fusions that are characteristic of repair after DNA is copied. Credit: Salk Institute

Is it better to do a task quickly and make mistakes, or to do it slowly but perfectly? When it comes to deciding how to fix breaks in DNA, cells face the same choice between two major repair pathways. The decision matters, because the wrong choice could cause even more DNA damage and lead to cancer.

Salk Institute scientists found that a tiny protein called CYREN helps cells choose the right pathway at the right time, clarifying a longstanding mystery about DNA repair and offering researchers a powerful tool that could guide better treatments for cancer. The work appears in Naturaleza on September 20, 2017.

"Elucidating DNA repair pathways is critical to understanding how they can sometimes be toxic," says Jan Karlseder, a professor in Salk's Molecular and Cell Biology Laboratory and the senior author of the new paper. "Our discovery of CYREN's function not only adds to our body of knowledge, it gives us a new tool with which to potentially fight cancer."

Double-strand breaks, the most serious injuries that happen to DNA, can be repaired by one of two pathways: a fast but error-prone process known as NHEJ (non-homologous end joining) and a slower, error-free pathway known as HR (homologous recombination). The faster pathway efficiently rejoins broken strands, but in the case of multiple breaks it can join the wrong two ends together, making things much worse for a cell. The slower pathway is error-free because it relies on having an undamaged DNA sequence to guide the repair, but this means it can only operate after a cell has copied its genetic information in order to divide. Given that, the fast pathway operates exclusively before DNA is copied, though its machinery is so efficient and prolific that scientists have wondered why it doesn't outcompete the slower, more-exact pathway after copying, too. Scientists have long suspected that something must be holding the faster option back in those cases.

That something, the new work reveals, is a microprotein called CYREN, which inhibits the faster pathway when a DNA copy is available for the slower pathway to use. CYREN was discovered by another Salk scientist, Alan Saghatelian, as part of a 2015 effort to identify small proteins called "short ORF-encoded peptides" or SEPs, which are increasingly being found to have critical biological roles.

The right way to repair DNA. This cartoon illustrates the suppressive effect of CYREN on the normally faster NHEJ DNA-repair pathway, allowing the slower HR pathway a chance to get ahead. Credit: Salk Institute

"We found a lot of these peptides in our earlier study but we didn't really know if any of them were important until the Karlseder lab got involved," says Saghatelian, a professor in the Clayton Foundation Laboratories for Peptide Biology and one of the paper's coauthors. "Thanks to this impressive new work, we now know there are some really important molecules among the hundreds we're discovering."

Saghatelian's research had suggested that CYREN was interacting with the master switch of the faster pathway, a protein called Ku. To determine the exact nature of the interaction, Karlseder's team worked with a region of the genome where repair is normally suppressed to prevent dangerous fusions: the ends of chromosomes, called telomeres. Researchers can artificially disturb telomeres to activate the fast pathway, making it a model system to test CYREN's effects.

"Telomeres offer a great research tool because they really need to repress repair, but there are ways to activate the repair machinery so that you can study it in a very controlled way," says Nausica Arnoult, a Salk research associate and first author of the paper. The Salk team did so, and found that with CYREN present, no repairs occurred after the cell copies its DNA, suggesting that it does flip off the master switch, Ku. Without CYREN around, Ku's fast pathway was active both before DNA was copied and after.

Because the telomere experiments did not tell the team much about the competition between the fast and slow pathways, Arnoult next used molecular tools to compare repair in living cells with and without CYREN. She combined the DNA scissors known as CRISPR with genes for fluorescent proteins that would be triggered by repair so that she could cut DNA in specific ways and see from the ensuing color which pathway had made the repair. She also analyzed all the protein interactions that took place.

These experiments revealed that CYREN directly attaches to Ku to inhibit the fast pathway both depending on timing (before or after DNA copying) and the type of DNA break (smooth versus jagged, for example). Its activity can even tune the ratio of fast to slow repairs.

"Our study shows that CYREN is an important regulator of DNA-repair-pathway choice," says Karlseder, who holds the Donald and Darlene Shiley Chair at Salk. "The work also points to the exciting possibility of potentially introducing DNA damage in cancer cells and using CYREN to prevent them from making repairs."


West Point biochemist warns about threat of bioweapons

In this episode of Intelligence Matters, host Michael Morell speaks with Dr. Ken Wickiser, a biochemist and associate dean of research at U.S. Military Academy West Point, about his piece "Engineered Pathogens and Unnatural Biological Weapons: The Future Threat of Synthetic Biology." Wickiser describes the growing influence of synthetic biology and what can happen if it gets in the wrong hands.

Reflejos

¿Qué es la biología sintética? "Synthetic biology is the process of engineering natural genetic systems. In terms of engineering: taking what nature has provided us and optimizing it, co-opting it, repurposing it, making it more efficient, and making it more cost effective. In large part for good purposes, to make new and novel biomaterials, to make new and novel pharmaceuticals. To make existing pharmaceuticals cheaper, more abundant, more available for the population."

Nefarious use of synthetic biology: "What we're concerned about is the production of either small molecules or gene products that could be used in a way that is a negative influence on someone's health. Whatever you can consider in your mind, is probably capable of being produced in the synthetic biology."

Next generation needs to learn about synthetic biology: "Whether we're talking about budding scientists or people who are interested in ethics or people who are interested in economics. We need people to understand the benefits of synthetic biology and the potential threats. That way we can develop common sense policies that will allow the science to progress, will allow us to benefit from the development of the science, but at the same time will assure our safety."

"Intelligence Matters": Ken Wickiser transcript

Producer: Paulina Smolinksi

"Intelligence Matters" Podcast With Michael Morell

DR. KEN WICKISER INTELLIGENCE MATTERS TRANSCRIPT

MICHAEL MORELL: This discussion will be part of a series of episodes that we're doing between now and the inauguration on the key national security issues facing the United States. I'll let our listeners know this one is going to be a bit scary. You and your colleagues wrote a paper published in August that caught my attention. It was published by the Combating Terrorism Center at West Point, which is one of the best-known counterterrorism think tanks in the world. Your piece was titled "Engineered Pathogens and Unnatural Biological Weapons: The Future Threat of Synthetic Biology" which is what I really want to dig into today with you. But before we do that, I wanted to give you an opportunity to mention the other authors of the piece because there were quite a few.

DR. KEN WICKISER: Absolutely. Thank you for allowing me that opportunity. This was a team effort. One of the great things about West Point is that we have a really great combination of both active duty military and the government civilian faculty and staff here in our effort to help develop the next generation of army leaders. My colleagues on this particular paper include Colonel John Burpo, who has a Ph.D. from MIT in bioengineering, Lieutenant Colonel Michael Washington, who has a Ph.D. in microbiology from the Uniformed Services University of Health Sciences, Dr. Kevin O'Donovan, who is a Title 10 government civilian and the deputy director of the Life Science Program here at West Point, his Ph.D. is in neuroscience from Johns Hopkins University. We also have a returning active military officer, Lieutenant Colonel, who is now getting his Ph.D. at at Boston University. We have a group of people who are not only subject matter experts, but they are people who have operational experience. They have operational experience in the military, or in both government and in the civilian academic labs across the United States. We took a holistic view of this in the context of what do our cadets really need to know about this technology? The point here was not to be scared, but to be prepared and understand from a holistic standpoint what synthetic biology is, where it could go, and what we need to be concerned about.

MICHAEL MORELL: What is synthetic biology?

DR. KEN WICKISER: That's a great question, because it depends on who you ask. In the broadest interpretation, synthetic biology is the process of engineering natural genetic systems. In terms of engineering: taking what nature has provided us and optimizing it, co-opting it, repurposing it, making it more efficient, and making it more cost effective. In large part for good purposes, to make new and novel biomaterials, to make new and novel pharmaceuticals. To make existing pharmaceuticals cheaper, more abundant, more available for the population. Synthetic biology has been around for a long time, but it's really increased in its prevalence and its significance since the genomic age. Its prevalence increased since we really understood the nature of DNA and have been able to catalogue the structure of DNA and how genomes in particular are organized: the controlling components, the parts that make proteins, the parts that serve as stoplights or speed bumps along the way.

MICHAEL MORELL: Can you explain the concept of modularity and why that's important to synthetic biology?

DR. KEN WICKISER: I think most people understand if you take a look at an electronic circuit, there's parts that go into the electronic circuit and you have a resistor here that gets set aside, a capacitor over there. You can construct very complicated machinery with some very simplistic parts. If you take that viewpoint of how perhaps a genome is organized, you have this long strand of DNA and embedded within that DNA are the instructions for certain proteins. Some proteins are going to be turned on all the time. Some proteins are going to be turned on only some of the time. Sometimes there's an age or development aspect to it. In terms of modularity, what we're focused on is being able to lift that one segment of DNA out of one particular organism and place it in a completely different novel context, in a completely different organism, and yet have it work. Perhaps not in the way that nature intended, but in the way that you, as the bioengineer, intends for it to function. That's really what we talk about when we use the term modularity is that drag and drop, cut and paste, lift and shift, mentality when you think about engineering DNA and engineering genomes.

MICHAEL MORELL: Can you talk about the good uses that synthetic biology can do for mankind? Your piece was about a potentially bad use. I'd love for you to talk about that from the 50,000 foot level.

DR. KEN WICKISER: Synthetic biology is a tool just like a hammer. You can use it for good or you can use it for nefarious purpose. We are typically in academia focused on the good. That's the whole point of going through a PhD program, learning about how to better mankind in terms of novel materials, novel pharmaceuticals, and understanding the basic machinery of biology so that we can take care of ourselves just that much better.

MICHAEL MORELL: We can cure diseases that we've never been able to cure before.

DR. KEN WICKISER: Absolutely. We're certainly on the cusp of that. If you take a look at it from the other vantage point, if you understand biology, if you understand this network of small molecules and genes and environmental influences, then you can disrupt that. Not only for good, but perhaps for bad. What we're trying to do here is just to call attention to this tool and to bring this to the attention of developing leaders, saying 'look, you have to take this into account when developing plans for security and for operations.' We have to understand what might happen out there if technology falls into the into the wrong hands, the hands of someone who is trying to do harm to others. In our case, we're concerned about Americans. We're concerned about the American military in particular. We in no way, shape, or form want to disparage or undermine the support that synthetic biology has in the community. We value it. We use it every day in our labs here at West Point. It's used across the world, in labs, in industry, academia, government labs, all the way down even to high school labs. But I do think that we need to understand that the bar has been lowered in terms of being able to produce something that other people haven't thought of. If that something happens to be perhaps negative in nature. We need to be prepared for that.

MICHAEL MORELL: What is the risk here? What is the threat?

DR. KEN WICKISER: What we're concerned about is the production of either small molecules or gene products that could be used in a way that is a negative influence on someone's health. Whatever you can consider in your mind, is probably capable of being produced out there in the synthetic biology.

MICHAEL MORELL: So we are talking about a bioweapon here, right?

DR. KEN WICKISER: We are talking about bioweapons. Whether you talk about a material or something that happens to be infectious, that's just different levels of threat.

MICHAEL MORELL: Can you talk about the concept of binary weapons and why that's important in the context of what we're talking about here?

DR. KEN WICKISER: If you were able to take two different chemicals, each of them inert, very stable. But then when you mix them, they become robust, explosive, that would be considered a binary weapon. So you need both components in order to have that weapon. So biology could be the same thing. If I have protein X, that happens to be a poison, I could cut that in half in two different segments and have a gene product in one organism, and the gene product in another. I could produce a considerable amount of each one of those subcomponents to the poison and then mix these two together and develop that active poison for nefarious purposes. Likewise, if these two gene products happen to be housed in prokaryotes and bacteria, I could mix these together. Under favorable conditions, they could exchange genetic material and the product could be one single organism that is producing an intact product. So you have both of those halves that can come together and form that particular poison. When we talk about a binary weapon, most people think about it in terms of chemical or mechanical means. But the analogy holds when you talk about biological macromolecules.

MICHAEL MORELL: What I'm thinking is this is the biological equivalent of al-Qaida trying to bring on chemicals to those 10 to 15 aircraft flying from Heathrow. Chemicals that were inert separate, but when you put them on the plane and mix them together, all of a sudden, they became an explosive.

DR. KEN WICKISER: Unfortunately, science goes hand in hand with creativity and curiosity. It really comes down to someone with nefarious purpose, having creativity mixed in with some scientific capability that allows them to produce something that is going to be of significant concern.

MICHAEL MORELL: What's the range of risk here from the least dangerous bioweapon to the most dangerous bioweapon in terms of what synthetic biology could produce?

DR. KEN WICKISER: Part of this is fear. And then part of it is the physical infectivity that a substance might have. Or an organism might have an entity. I use those terms very broadly because it's arguable whether one calls a virus alive. Because it doesn't in and of itself have the machinery required for self replication, it requires the host to hijack and and replicate itself. But ignoring that distinction is something that is going to have that very careful balance in between lethality and infectivity across a particular population. If something was so incredibly deadly that it's going to hamstring itself in terms of being able to pass that on to the next host, then that's going to tend to die out faster than something that has that careful balance. That something is likely a virus. It could be an engineered virus. It can be microbes, living systems, small individual cells that produce toxins.

Whether you think about something that's endemic across humankind, like E. coli, without having that one genetic switch that'll change it into something that's virulent. But you can think about something that is genetically engineered like a virus. Knowing that we use this for good, it can also be used for bad. For example, in 2011 Dutch scientists wanted to create a virus and see what mutations were required in order to make it more aerosolized. They did this and they were frightened that it took so few mutations in order to make something that was very dangerous into something that was incredibly deadly. There was a large public outcry. People came back and said, 'you should not even publish this.' There was a lot of ethical considerations that went into the sharing of those data and the publication of that particular work. They used natural selection in the context of the lab in order to generate those five mutations. Now it's known that the information can be used by people to engineer a particular protein in the context of DNA and have that produced by any DNA synthesis companies. Some of them are American, but many of them are outside the continental United States. It's that information that allows us and empowers someone with nefarious purpose to use synthetic biology for their ends.

MICHAEL MORELL: In the paper, you and your co-authors give some examples of where this has already been done. Can you describe very briefly a couple of those? The first was work done in 2002 by scientists at the State University of New York at Stony Brook on the polio virus.

DR. KEN WICKISER: It's always been a goal for someone to build a genome from scratch. The question is, using state of the art chemical synthesis tools, can you construct something that is functional? That is really where that effort was born. It spawned several other efforts that eventually led up to the idea could you actually create a living cell from scratch?

It goes hand in hand with what do you actually need for a living system. What can you throw away? If you take out of a car every bit that you don't need for it to run. Seat warmers etc. That's what has been a major goal in synthetic biology efforts across the globe, because once you have that minimal structure, that biological scaffold, you can then add in whatever you want and and it's less of a load. For example, if you and I are going on a run. If you add a large backpack onto yourself, it's going to be much more exerting. The same thing happens when you engineer a small microbe. You increase the metabolic load and slow it down. But if you can get rid of all the non essential requirements, then when you actually load it up with that new system, then you will have a biological system that is not going to be loaded down as much of a natural one.

That's been the progression, going from the construct of a virus to the construct of an actual living cell. Another piece that we really wanted to bring up here is, on the good part. We have these amazing contests, international genetically engineered machine contests born out of MIT. You have this incredibly rich international group of young men and women. Primarily it was college students. Recently, they've lowered the bar of entry because so many young high school students are really interested in this work. In 2019 there was three hundred and sixty teams from across the world. About 50 percent of them came from Asia. About 20 percent were from North America. There was about one quarter of the teams that were from the high school level. About 65 percent of them are from Asia, predominantly they're from China. The great thing about synthetic biology is that there are no borders. Then again, that applies to the context of threat, to the context of force protection amongst the American population and the DOD. There might be something here of concern.

MICHAEL MORELL: Then no borders become a bad thing. It's this interesting dichotomy. You just raised an issue that caught my attention. When people used to ask me about this threat, I would say, 'yes, terrorist groups have shown interest, but doing this is very, very difficult.' One of the things that really jumped out to me in your article is that this is getting easier and easier.

Let me read a few sentences. 'The sophistication of high school and undergraduate student research projects has matched that of many highly trained personnel who are working in advanced laboratories less than a decade ago.' The second is 'these synthetic bio tools are lowering the education, training, cost, time and equipment threshold required to modify and employ pathogenic organisms as biologic weapons.'

Talk about the extent to which this is getting easier and obviously why that's important.

DR. KEN WICKISER: Let's take a look at the iGEM organization. I'm a huge fan. I participated in it for many years. They have a biosafety and security committee. They're very much attuned to the potential misuse. Outside of the context of a competition, going into perhaps non-state actors who have ill intent toward the United States, you say 'if high school students can do this across Asia, across Europe, across the United States, then take that threat scenario and apply that to something chemical or nuclear. You're not going to have high school students making the next generation nuclear weapon. But one of the amazing things about science is we're all about sharing information. We're all about publishing, we're all about planting your flag and generating bragging rights about these great advances that we make. But that also provides a great recipe for that next person.

That next person can certainly be a young individual that does not have decades of experience in laboratories. He or she can essentially do garage level science that in the past would have taken a lot of people a long time in sophisticated labs. Going back to our polio example, how long did that take these experts in the Stony Brook lab? How many years was that? How many millions of dollars was spent on that? Whereas when you talk about a young team of students, this is on the thousands of dollars scale.

If they needed ten thousand dollars worth of materials, that's highly attainable for a lot of people. These materials then really comes down to synthetic DNA, DNA that has been produced by chemically synthesizing them in a facility. These facilities are all across the world. They're all across the United States. They're all across Europe, but they're all across Asia as well. Honestly, when I have a gene synthesized or when I have a plasmid, which is a small circular chunk of DNA that has many different genes embedded within it, if I have that synthesized and I want to pay someone three thousand dollars to do that, it will probably be subcontract out to China. That's where the materials are coming from. When you talk about the sharing of materials, there's high levels of access for anybody throughout the world. This is not just something that is available to American students or postdocs or professors in American universities. This is available worldwide.

There are no boundaries when it comes to information. There are no boundaries when it comes to science, and there's certainly no boundaries when it comes to scientific expertise and interest. There is such an enormous level of interest coming out of Asia, particularly China. It's something to consider when thinking about where synthetic biology could go, not only for the good, but potentially for the bad.

MICHAEL MORELL: In your article, you and your co-authors push back on those who say that making bioweapons is much too difficult for a non-professional. You use two metaphors. Can you share those?

DR. KEN WICKISER: Twenty years ago, I would have said, 'yes, they're absolutely right, the bar is way too high.' 10 years ago, I would have said, 'yeah, sure, it's a little bit lower, but that's going to be a tough ask.' But today, it's just really not. If you go back to some of the examples we used in the paper, our home PC example. When I was young, I vividly remember my very first Apple computer. Seeing that at a college. It was almost like a museum where I was looking behind the glass, not allowed to touch it. Today look where we have gone. Along with Moore's Law. This has just exploded in terms of technology where people now have the ability to customize their entire home and have that controlled by a cell phone.

You have Moore's Law that has been allowing us via the increased computational power to do so many amazing things that we just couldn't have dreamed of 20, 30 years ago. Biology and our understanding of biology has followed a similar path. There's been an absolute explosion in our understanding of what a gene is, how to control a gene, how to get these genes from one context and put them into another.

It comes down to being able to design this online. You can do genetic engineering right from your phone. You can purchase DNA on the spot. At the end of the purchasing process, there's a little form to sign that says 'is this a poison, yes or no? Can this impact human health? Yes or no?' It really comes down to you as the purchaser being honest. We have this incredible capability in biology. Yet the controls haven't caught up to that yet, whereas perhaps controls in electronic means have. That's because to the regular nonscientist the capabilities and limitations of electronics are a lot more understandable compared to that of biology.

MICHAEL MORELL: In terms of your concerns about this, it sounds like it's primarily non-state actors, terrorist groups rather than states. Is that fair to say?

DR. KEN WICKISER: That's absolutely fair to say. At the end of the day, both Russia and China have incredibly robust scientific programs. The United States has taken steps after the fall of the Soviet Union to provide scientists from the former Soviet Union opportunities to engage in science for the benefit of mankind by setting up laboratories in countries like Georgia. But our concern here is the lowering of that bar and allowing for the ability for an untrained group of people to develop something that might negatively impact human health.

MICHAEL MORELL: Let me read two more sentences from your article. The first sentence is, 'as molecular engineering techniques of the synthetic biologists become more robust and widespread, the probability of encountering one or more of these threats is approaching certainty.' The second is 'the change to the threat landscape created by these techniques is rivaled only by the development of the atomic bomb.' Those are two pretty significant sentences, so what do we do about this? What's the right policy response? How do we defend ourselves?

DR. KEN WICKISER: I go back to say the iGEM field. They are very much interested in biosecurity and infusing the thought of biosecurity in these young budding scientists. Whether they be Americans or people from foreign countries. But we also have in the United States several organizations dedicated to biosecurity, including the Defense Threat Reduction Agency and their chemical biological defense division. The entire research there is a lead by Dr. Ronald Han, and he has an amazing portfolio. They are very dedicated to addressing this field. There's BARTA. There's DARPA. DARPA has several different programs that are addressing the potential threat of synthetic biology, whether it be a normal genetic engineering or the whole CRISPR effort. That has really exploded the field over the past several years. So we do have organizations, whether they be private, non-profits, or governmental organizations that are addressing this. I think it's probably incumbent upon us to weave this into the educational experience of young people. Whether we're talking about budding scientists or people who are interested in ethics or people who are interested in economics. We need people to understand the benefits of synthetic biology and the potential threats. That way we can develop common sense policies that will allow the science to progress, will allow us to benefit from the development of the science, but at the same time assure our safety.

MICHAEL MORELL: Thank you so much for joining us. Thank you for your service to our country, which continues to this very day. And in educating the young women and young men who will lead the United States Army in the future.


Positions within DNA that lack a DNA base also known as apurinic or apyrimidinic (AP) sites. They can occur spontaneously or through base excision by DNA glycosylases.

Intrastrand and interstrand DNA crosslinks

Chemical crosslinking of DNA can occur between positions on the same DNA strand (intrastrand) or between opposing strands (interstrand).

Poly(ADP-ribose) polymerase 1

(PARP1). A member of a family of enzymes that catalyse the formation of poly(ADP-ribose) chains, thereby regulating various cellular processes, most notably DNA repair.

Any molecule that inhibits an enzyme by mimicking a substrate.

(HORA). A process resulting in the exchange of identical or highly similar DNA sequences between two DNA molecules it is involved in meiosis, DNA repair and DNA replication.

The DNA polymerase required for gap filling during base excision repair and DNA single-strand break repair.

A medical condition that is characterized by a lack of coordination of voluntary muscle movements it is often caused by inherited or acquired cerebellum diseases (cerebellar ataxia).

The absence of neurological reflexes.

Small dilated blood vessels in the outer layer of the skin or in mucosae. Usually a benign condition, which can be associated with serious genetic or acquired diseases.

A neurological motor disorder that is caused by partial brain damage affected individuals experience difficulty with motor planning to carry out motor tasks or movements.

A motor speech disorder characterized by poor articulation of phonemes. It is caused by injuries to the motor component of the motor–speech system of the brain.

A neurological condition in which affected individuals present with a smaller than normal head owing to defective brain development.

A medical condition that is characterized by underdevelopment of the jaw.

A protein complex that degrades unneeded or damaged proteins. Proteins are commonly marked for degradation by modification with polyubiquitin chains.

A post-translational modification, also known as polyADP-ribosylation, by which polymers of ADP-ribose are attached to substrate proteins by poly(ADP-ribose) polymerases (PARPs).

X-ray repair cross-complementing protein 1

(XRCC1). A molecular scaffold protein that orchestrates the repair of DNA single-strand breaks by recruiting and stabilizing multiple other repair factors.

Ataxia telangiectasia mutated

(ATM). A protein kinase best known for its function in signalling the presence of DNA double-strand breaks, thereby activating a highly sophisticated cellular response.

Proteína quinasa dependiente de ADN

(ADN-PK). Heterotrimeric DNA-dependent kinase that comprises KU70, KU80 and the catalytic subunit DNA-PKcs best known for its central function in non-homologous end joining repair of DNA double-strand breaks.

If a replication fork encounters a single-strand break, the replicative helicase runs off the template strand, resulting in the formation of a highly toxic single-ended DNA double-strand break.

Non-homologous end joining

(NHEJ). The repair of DNA double-strand breaks by directly ligating two DNA ends, irrespective of DNA sequence.

A type II DNA topoisomerase that is required for the generation of DNA double-strand breaks during meiosis, which is crucial for genetic recombination.

Synthetic lethality screen

A genetic screening method, which aims to reveal genes that when knocked out cause lethality in combination with a knockout of a gene of interest.

A cellular signalling mechanism that pauses the cell cycle in response to the presence of DNA damage, thereby providing enough time to ensure that repair can occur before the next cell division.

A diverse class of enzymes that are involved in various cellular processes. AAA-ATPases use energy obtained from ATP hydrolysis to generate mechanical forces through conformational changes.

Mutations that cause a partial loss of function for example, by reduced gene expression or decreased protein stability. Hypomorphic mutations mostly display less severe phenotypes than a complete gene loss.

The most common type of liver cancer often caused by hepatitis virus (B or C) and substances such as aflatoxin and ethanol.

Translesion synthesis polymerases

DNA polymerases with the ability to synthesize past DNA lesions due to a flexible active site they often display low fidelity and thus tend to incorporate mutations.

Reparación por escisión de nucleótidos

(NER). A DNA repair pathway that repairs primarily bulky adducts, such as those induced by ultraviolet (UV) light. Repair is achieved by excision of a short stretch of nucleotides that contains the DNA lesion.

A recombination process that allows the replication of damaged DNA strands by using the newly replicated sister strand as a template for DNA synthesis.

A conserved DNA repair pathway that detects and repairs base–base mismatches and insertion–deletion mispairs, which can be generated by mistakes during replication.


Ver el vídeo: Como usar CmapTools desde cero - Tutorial basico en español 2016 (Julio 2022).


Comentarios:

  1. Zulukasa

    En mi opinión, no tienes razón. Estoy seguro. Puedo defender la posición. Escríbeme en PM, nos comunicaremos.

  2. Dhu

    Maravilloso pensamiento muy útil



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