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7.7.2: Inhibidores antivirales de la síntesis de ADN - Biología

7.7.2: Inhibidores antivirales de la síntesis de ADN - Biología



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La inhibición de la síntesis de ADN durante la replicación viral es otro enfoque clave en la lucha contra las infecciones virales.

Objetivos de aprendizaje

  • Revisar el mecanismo de acción de los inhibidores de la síntesis de ADN antivíricos y reconocer los tipos de estos inhibidores.

Puntos clave

  • Los fármacos como el aciclovir son análogos de nucleósidos que carecen de un grupo 3 'libre que se necesita para la adición del siguiente nucleótido. Cuando se agregan a una cadena de ADN en crecimiento, detienen su síntesis.
  • Otro fármaco, el foscarnet, imita a los pirofosfatos e inactiva la actividad de la ADN polimerasa viral.
  • Puede desarrollarse resistencia contra ambos grupos de fármacos.

Términos clave

  • Retinitis por CMV: Inflamación de la retina del ojo causada por CMV. Puede provocar ceguera.

La inhibición de la síntesis de ADN durante la replicación viral es otro enfoque para combatir las infecciones virales.

La estrategia más común utilizada para este enfoque es utilizar moléculas que imiten la estructura de un nucleósido. La similitud es lo suficientemente buena como para asegurar su incorporación en la cadena de ADN recién sintetizada. Sin embargo, el análogo de nucleósido carece del extremo 3 'libre necesario para la adición del siguiente nucleótido. Esto evita la incorporación del siguiente nucleótido y termina el alargamiento de la cadena de ADN.

Uno de los medicamentos antivirales más utilizados que funciona con el mecanismo descrito es el aciclovir (aciclovir), un análogo de la guanosina. Se utiliza para tratar las infecciones por el virus del herpes simple (tipo 1 y tipo 2), así como la varicela y el herpes zóster. Fue diseñado a base de nucleósidos aislados de una esponja caribeña. Después de la administración, la molécula se activa por fosforilación tanto por las quinasas virales como por las de la célula huésped y el nucleótido resultante se incorpora al ADN recién sintetizado, lo que resulta en la terminación prematura de la cadena. El fármaco tiene una citotoxicidad muy baja y tiene poca resistencia.

Otros fármacos que también son análogos de nucleósidos y tienen el mismo modo de acción son el ganciclovir (un análogo sintético de 2′-desoxi-guanosina) y la vidarabina (un análogo de adenosina). Sin embargo, ambos fármacos son más tóxicos y tienen efectos secundarios más graves que el aciclovir.

Otro tipo de fármaco que es un inhibidor de la síntesis de ADN es el foscarnet. Imita al pirofosfato e inactiva la actividad de la ADN polimerasa. Este inhibidor es activo contra las ADN polimerasas virales en dosis mucho más bajas que las necesarias para inhibir las polimerasas humanas. Este fármaco se utiliza en casos de resistencia a los productos químicos análogos de nucleósidos de aciclovir y ganciclovir. También se usa para tratar la infección por citomegalovirus (CMV) y específicamente la retinitis por CMV.

Otro fármaco antiviral que se dirige a la síntesis de ADN es la hidroxicarbamida, comúnmente conocida como hidroxiurea. La hidroxicarbamida se puede utilizar como fármaco antirretroviral contra el VIH / SIDA. Se cree que el mecanismo de la hidroxicarbamida se basa en la reducción de la producción de desoxirribonucleótidos; por lo tanto, inhibe la síntesis de ADN. Se cree que la hidroxicarbamida inhibe la enzima ribonucleótido reductasa.


Inhibidores de la transcriptasa inversa

Los inhibidores de la transcriptasa inversa son activos contra el VIH, un retrovirus. Los fármacos inhiben la replicación del virus ARN mediante la inhibición reversible de la transcriptasa inversa viral del VIH, que transcribe inversamente el ARN viral en el ADN para su inserción en la secuencia de ADN del huésped (véase la figura 51.6). Los inhibidores de la transcriptasa inversa nucleos (t) ide (NRTI) son activados por fosforilación en dos pasos a la forma 5'-trifosfato por quinasas celulares. La inhibición de la replicación viral se logra mediante la unión competitiva del fármaco activado al complejo enzima-molde-cebador en lugar de los 5′-desoxinucleósidos trifosfatos naturales. Los fármacos carecen del grupo 3'-hidroxilo en el resto de desoxirribosa necesario para la formación normal de un enlace fosfodiéster con el siguiente nucleótido, por lo que terminan el alargamiento adicional de la cadena de ADN.

Los inhibidores nucleósidos de la transcriptasa inversa son análogos de los precursores de las purinas y pirimidinas naturales implicadas en la transcripción del ADN iniciada por el virus. La zidovudina es un análogo de la timidina, la emtricitabina y la lamivudina son análogos de la citidina y el abacavir es un análogo de la desoxiguanosina. Tenofovir disoproxil es un profármaco convertido en tenofovir, un análogo nucleotídico de la adenosina que solo requiere difosforilación para su activación, pero por lo demás comparte el mecanismo de acción de los análogos nucleósidos.


Sabiduría etnomedicinal

Ananya Das Mahapatra,. Debprasad Chattopadhyay, en Nueva mirada a Phytomedicine, 2019

3.7 Mecanismo de acción de los agentes antivirales de origen vegetal

Inhibición viral por autofagia

La pentagaloilglucosa que se encuentra en muchas hierbas medicinales tradicionales exhibe varias bioactividades que incluyen efectos antiinflamatorios, anticancerosos, antioxidantes y antivirales. Se ha demostrado que es eficaz contra el HSV-1 mediante la inducción de autofagosomas que engloban al virión HSV-1 (Pei et al., 2011). Ácido triterpeno glicirrícico, el principal compuesto aislado de Glycyrrhiza glabra, también ha sido eficaz contra el VHS al promover la autofagia (Laconi et al., 2014).

Inhibición de la replicación del virus.

Se ha informado que un extracto de arándano rojo conocido como Oximacro y sus proantocianidinas constituyentes purificadas pueden inhibir la replicación de HSV-1 y HSV-2. in vitro y prevenir la adsorción del virus dirigiéndose a la glicoproteína gD y gB de la envoltura viral (Terlizzi et al., 2016). El extracto de diclorometano de Angelica archangelica L. fruit es un posible antiviral contra el HSV-1 al inhibir la replicación viral (Rajtar et al., 2017). La Fig. 3.1 describe diversos mecanismos de acción mediante los cuales se informa que los compuestos naturales son efectivos contra diferentes virus. Se ha demostrado que el resveratrol, un componente natural de ciertos alimentos, como las uvas, limita la formación de lesiones por HSV-1 al inhibir la replicación viral (Docherty et al., 2005). Triterpenos pentacíclicos aislados de corteza de abedul (Betula especies) de Eurasia y América del Norte puede inhibir el HSV-1, especialmente los aislados clínicos de HSV sensibles al aciclovir y resistentes al aciclovir (Heidary Navid et al., 2014). Polisacárido sulfatado de Caesalpinia ferrea puede inhibir la replicación del poliovirus junto con la adsorción del virus, los pasos posteriores a la penetración y la síntesis de proteínas virales (Lopes et al., 2013). Oxiresveratrol, purificado de una planta medicinal tradicional tailandesa Artocarpus lakoocha, se ha demostrado que posee efectos terapéuticos en ratones infectados con HSV-1, al inhibir la fase temprana y tardía de la replicación del ADN viral. Si bien se informó que los efectos anti-VHS de los isoflavonoides derivados de la soja se debían a la inhibición de la replicación del ADN viral (Argenta et al., 2018).

Inhibición de virus por generación de ROS

Estilbenoides oligoméricos, fitoalexinas polifenólicas de algunas plantas, incluidas Cannabis sativa inhiben el crecimiento viral generando ROS (Chen et al., 2012).

Cambio en la expresión génica del virus

El n-docosanol, un alcohol behenílico (alcohol graso saturado de 22 carbonos) de varias plantas, utilizado tradicionalmente como emoliente, emulsionante y espesante en cosméticos y suplemento nutricional, inhibe el herpes labial y la expresión génica temprana inmediata del HSV (Treister y Woo, 2010).

Inhibición de la entrada viral.

Los galactanos sulfatados de las algas rojas Gymnogongrus griffithsiae y Cryptonemia crenulata se informa que inhibe la entrada de HSV-1 y VIH-2 (Talarico et al., 2004). Mentha suaveolens El aceite esencial y su componente principal, el óxido de piperitenona, ejercen una actividad anti-VHS al inhibir la adsorción viral (Civitelli et al., 2014). Además, el óxido de piperitenona de Mentha longifolia podría interferir con algunas vías celulares sensibles a redox de la célula huésped explotadas para la replicación viral y, por lo tanto, inhibe el crecimiento y la proliferación viral. Mientras que el efecto virucida del aceite de menta, el aceite esencial de Mentha piperita contra el VHS se puede atribuir a la interacción del aceite de menta con la adsorción viral en la superficie de la célula huésped, lo que evita que el virión entre en la célula huésped para establecer la infección (Schuhmacher et al., 2003).

Interferencia con la liberación de virus

Planta medicinal tailandesa Dunbariabella prain interferir con la liberación de HSV (Akanitapichat et al., 2006).


Biología molecular de la infección por el virus de la hepatitis B

El virus de la hepatitis B humana (VHB) es el prototipo de una familia de pequeños virus de ADN que infectan productivamente a los hepatocitos, la célula principal del hígado, y se replican por transcripción inversa de un ARN viral terminalmente redundante, el pregenoma. Tras la infección, el ADN del virión circular, parcialmente bicatenario, se convierte en el núcleo en un ADN circular cerrado covalentemente (cccDNA) que se ensambla en un minicromosoma, la plantilla para la síntesis del ARNm viral. La infección de los hepatocitos no es citopática. La infección del hígado puede ser transitoria (& lt6 meses) o crónica y de por vida, dependiendo de la capacidad de la respuesta inmune del huésped para eliminar la infección. Las infecciones crónicas pueden causar daño hepático inmunomediado que progresa a cirrosis y carcinoma hepatocelular (CHC). Los mecanismos de carcinogénesis no están claros. Las terapias antivirales con inhibidores análogos de nucleósidos de la síntesis de ADN viral retrasan las secuelas, pero no pueden curar las infecciones por VHB debido a la persistencia del ADNcc en los hepatocitos.

Palabras clave: Replicación de la patogenia del virus de la hepatitis B.

Copyright © 2015 Elsevier Inc. Todos los derechos reservados.

Cifras

Figura 1. Estructura del genoma, genes y ARNm ...

Figura 1. Estructura del genoma, genes y ARNm del virus de la hepatitis B

El genoma de ADN circular relajado ...

11 repeticiones directas de bases que tienen un papel importante en la síntesis de ADN viral. La síntesis de cadena negativa exhibe una redundancia terminal corta creada durante la transcripción inversa del ARN pregenómico (Figura 2).


Las hebras de ácido nucleico crecen en la dirección 5 & # x02032 & # x02192 3 & # x02032

Toda la síntesis de ARN y ADN, tanto celular como viral, procede en la misma dirección química: desde el extremo 5 & # x02032 (fosfato) hasta el extremo 3 & # x02032 (hidroxilo) (ver Figura 4-13). Las cadenas de ácidos nucleicos se ensamblan a partir de 5 & # x02032 trifosfatos de ribonucleósidos o desoxirribonucleósidos. El crecimiento de las hebras es energéticamente desfavorable, pero está impulsado por la energía disponible en los trifosfatos. El fosfato & # x003b1 del nucleótido entrante se une al 3 & # x02032 hidroxilo de la ribosa (o desoxirribosa) del residuo anterior para formar un enlace fosfodiéster, liberando un pirofosfato (PPI). El equilibrio de la reacción es impulsado aún más hacia el alargamiento de la cadena por la pirofosfatasa, que cataliza la escisión de PP.I en dos moléculas de fosfato inorgánico (véase la tabla 2-7).


Resultados y discusión

Química

Las rutas sintéticas construidas para obtener los productos deseados se ilustran en el Esquema 1 y el Esquema 2, mientras que el Esquema 3 muestra la ruta sintética utilizada para sintetizar los intermedios bencílicos. 4- (5,6-dicloro-1 (2)H-benzo [D] [1,2,3] triazol-1-il) anilina intermedios (13 y 15) se sintetizaron según el procedimiento descrito anteriormente (Carta et al., 2007). Dicloruro de diacilo (14a-gramo) y reactivos 1- (clorometil) -4-nitrobenceno se adquirieron comercialmente (Sigma-Aldrich). Todos los derivados de bis-benzotriazol-dicarboxamida diseñados se prepararon por condensación de las correspondientes benzotriazol-anilinas (13,15 y 16 & # x0201318) con el dicloruro de diacilo adecuado (14a-g) en N, N-dimetilformamida (DMF) en presencia de trietilamina (TEA). Estas rutas sintéticas proporcionaron los compuestos deseados bis-benzotriazol-dicarboxamidas (3a-g, 5e-g, 7a-g, 8a-g, 9a-g) y los correspondientes derivados ácidos mono-sustituidos (4a-d,F, 6f, 10a-g, 11a-g, 12a-d, f) como productos secundarios, que también fueron separados, purificados y evaluados biológicamente. Las bis-benzotriazol-dicarboxamidas y los derivados ácidos mono-sustituidos se obtuvieron generalmente en proporciones variables. Intermedios 16& # x0201318 se obtuvieron como se muestra en el Esquema 3, mediante una primera sustitución del benzotriazol correctamente sustituido (19& # x0201321) con 1- (clorometil) -4-nitrobenceno en condiciones básicas para trietilamina (TEA). Los dos isómeros se separaron del 5,6- (R) -1 (2) - (4-nitrobencil) -1H (2H) -benzo [D] [1,2,3] triazol mezcla y el 5,6- (R) -1- (4-nitrobencil) -1H-benzo [D] [1,2,3] triazoles (22& # x0201324) fueron sometidos a reducción por dos vías sintéticas diferentes. Intermedios 16 y 17 se obtuvieron por reducción de 22 y 23 respectivamente, con hidracina y paladio sobre carbono en etanol, mientras que el compuesto 18 fue ganado por la reducción de 24 resuelto en etanol con metilhidrazina en el autoclave durante 48 & # x000a0h.

ESQUEMA 1. Síntesis de N, N & # x02032-bis [4- (1H(2H) -benzo [D] [1,2,3] triazol-1 (2) il) fenil] alquil (aril) dicarboxamidas (3a-g 5e-g) y 4 - ((4- (5,6-dicloro-1H(2H) -benzo [DÁcidos] [1,2,3] triazol-1 (2) -il) fenil) amino) -4-oxoalquil (aril) oico (4a-d, f 6f). 1) DMF, TEA, r.t., 3 & # x0201372 & # x000a0h.

ESQUEMA 2. Síntesis de norte,norte& # x02032-bis [4 - ((5,6-R-1H-benzo [D] [1,2,3] triazol-1-il) metil) fenil] alquil (aril) dicarboxamidas (7a-gramo 8a-gramo 9a-gramo) y 4 - ((4 - ((5,6-R-1H-benzo [D] [1,2,3] triazol-1-il) metil) fenil) amino) -4-oxoalquil (aril) oicos ácidos (10 a-gramo, 11a-gramo 12a-D,F). 1) DMF, TEA, r.t., 3 & # x0201372 & # x000a0h.

ESQUEMA 3. Síntesis de 4 - ((5,6-R-1H-benzo [D] [1,2,3] triazol-1-il) metil) anilina (16 & # x0201318). 1) Cs2CO3, DMF, 60 & # x000b0C para 48 & # x000a0h 2) NH2NUEVA HAMPSHIRE2 (1:20), Pd / C (10% p / p), EtOH, 80 & # x000b0C durante 2 & # x000a0h (para proporcionar compuestos 16 y 17) 3) CH3NHNH2 (1:10), EtOH, 100 & # x000b0C durante 48 & # x000a0h en autoclave (para proporcionar compuesto 18).

Actividad antiviral

Todos los 56 compuestos sintetizados, representados en la Figura 3, se probaron en un ensayo de reducción de placa para determinar la actividad antiviral y en un ensayo de citotoxicidad basado en células. Los virus seleccionados para el ensayo fueron Coxsackievirus B5 (CV-B5), un patógeno humano bien conocido y la cepa de poliovirus Sb-1, ambos pertenecientes a la familia de Picornaviridae. Se evaluó la citotoxicidad de los compuestos frente a tres líneas celulares (Vero-76, MDBK, BHK-21). La Tabla 1 muestra los resultados de la actividad antiviral y la citotoxicidad correspondiente contra la línea celular que soporta la replicación viral, Vero-76. Se informan los resultados de los únicos compuestos activos: derivados 9a, 9b entre las bis-benzotriazol-dicarboxamidas y 4a-D entre los derivados ácidos mono-sustituidos. Los resultados de los derivados restantes no se informan en la tabla ya que resultaron no ser considerablemente activos (EC50 valores excedidos de 100 & # x000a0 & # x000b5M). 9a es el único compuesto entre los diseñados que resultó bastante activo contra los dos Picornavirus probados (EC50 valores de 23 y 43 & # x000a0 & # x000b5M, respectivamente). Sorprendentemente, los derivados monosustituidos obtenidos como productos secundarios se encontraron más activos que las correspondientes dicarboxamidas. Compuesto 4c fue el más activo contra CV-B5, junto con 4a y 4d con EC50 valores que van de 9 a 13 & # x000a0 & # x000b5M. Los dos últimos también están dotados de citotoxicidad escasa o nula contra la línea celular Vero-76 (CC50 90 & # x000a0 & # x000b5M y & # x0003e100 & # x000a0 & # x000b5M respectivamente).

FIGURA 3. Derivados sintetizados, norte,N & # x02032-bis [4-1H (2H) -benzo[D][1,2,3] triazol-1 (2) -il) fenil] alquil (aril) dicarboxamidas (serie 3 y 5) y norte,N & # x02032-bis [4-1H-benzo[D][1,2,3] triazol-1-il) (metil) fenil] alquil (aril) dicarboxamidas (serie 7 & # x020139). 4- (4- (5,6-dicloro-1H-benzo[D]Ácidos [1,2,3] triazol-1 (2) -il) fenil) amino) -4-oxoalquil (aril) oico (serie 4 y 6), 4- (4 - ((5,6-R-1H-benzo[D]Ácidos [1,2,3] triazol-1-il) metil) fenil) amino) -4-oxoalquil (aril) oico (serie 10 & # x0201312).

TABLA 1. Resultados de actividad antiviral y citotoxicidad para compuestos 9a, 9b entre las bis-benzotriazol-dicarboxamidas y 4a-D entre los derivados ácidos mono-sustituidos.

Actividad antitumoral

También se ensayó la actividad antitumoral de todos los compuestos sintetizados contra 7 líneas celulares cancerosas. Para este propósito, se seleccionaron las líneas celulares derivadas de leucemia-linfoma humano CCRF-CEM, WIL-2NS, CCRF-SB y las líneas celulares derivadas de tumores sólidos SK-MEL28, SK-MES 1, DU145, HeLa. La línea celular de fibroblastos CRL 7065 se utilizó como control. La Tabla 2 muestra los resultados de los compuestos más prometedores, derivados 3b, 3d entre bis-benzotriazol-dicarboxamidas y 4d, 9b entre los derivados ácidos mono-sustituidos. En términos generales, compuesto 3b mostró el rango más amplio de actividad reduciendo la proliferación celular de seis de siete líneas celulares con CC50 oscilando en los valores micromolares bajos. Derivado 3d tenía el CC más bajo50 valor frente a la línea celular CCRF-CEM (70 & # x000a0nM), mientras que resultó inactivo frente a la mayoría de las otras líneas celulares probadas. Entre los derivados ácidos mono-sustituidos, 4d demostró ser activo cuando se probó en líneas celulares derivadas de leucemia-linfoma humano, mientras que fue completamente inactivo contra tumores sólidos, lo que demostró una interesante selectividad de acción. Compuesto 9b es el que resultó activo contra todas las líneas celulares de cáncer probadas, demostrando un amplio rango de acción, mostrando, sin embargo, CC muy bajo.50 valores. Las dicarboxamidas resultaron ligeramente más citotóxicas cuando se probaron en la línea celular de control CRL 7065 que los derivados monosustituidos probados. Para determinar la selectividad citotóxica de los compuestos probados, se calculó el índice de selectividad (SI) como una proporción de CC50 de células no tumorales y CC50 de células tumorales. Dado que el mecanismo de acción no específico de los compuestos diseñados, los valores de SI resultaron muy bajos, excepto para el compuesto 3d. Este último poseía CC50 valores de 70 & # x000a0nM contra la línea celular tumoral CCRF-CEM y 370 & # x000a0nM contra la línea celular no tumoral CRL 7065, con un SI resultante de 5,3.

TABLA 2. Actividad antiproliferativa de compuestos 3b, 3d, 4d, y 9b contra líneas celulares derivadas de leucemia-linfoma humano y líneas celulares derivadas de tumores sólidos.

Los cuatro compuestos prometedores mencionados anteriormente (3b, 3d, 4d, y 9b) se sometieron luego a la selección de líneas celulares de tumores humanos NCI60 (tablas completas de resultados en Material complementario). Esta proyección fue realizada por el Nacional Cáncer Institute (NCI, Bethesda, Estados Unidos) y evaluó nuestros compuestos en el ensayo contra el cáncer a una concentración de 10 & # x000a0 & # x003bcM frente a un panel de 60 líneas de células tumorales humanas. El panel comprende una serie de diferentes líneas de cáncer que comprenden tumores hematológicos (leucemia) y sólidos (pulmón de células no pequeñas - NSCL, colon, sistema nervioso central - CNS, cáncer renal, ovárico, de mama y de próstata y melanoma). Entre los compuestos probados, 3b resultó ser el más activo con el rango de acción más amplio. Los resultados de los ensayos se informan como porcentaje de inhibición del crecimiento (PGI) y se representan en gráficos de barras representados en la Figura 4. Las líneas celulares se agrupan por tipo de cáncer. Nuestro compuesto de plomo 3b mostraron valores de PGI superiores al 50% para 29 de las 60 líneas celulares, lo que demuestra una amplia actividad antiproliferativa. Las mejores puntuaciones se registraron para el cáncer de mama, ya que la mayoría de los valores de PGI oscilaron entre el 48 y el 81%, y para el cáncer de próstata (valores de 80 y 66% de PGI frente a las dos líneas celulares). Compuesto 3b puede considerarse como un agente antiproliferativo interesante contra ovario (OVCAR-8, SK-OV-3), SNC (SF-295, SNB19, SNB75, U251) y NSCL (A549 / ATCC, HOP-62, NCI-H226, NCI -H23, NCI-H460, NCI-H522), mientras que el crecimiento de leucemia, melanoma, células cancerosas renales y de colon se vio menos afectado por la administración del derivado 3b. Este último también demostró ser citotóxico más que antiproliferativo, contra una línea celular de cáncer de ovario (OVCAR-4) que muestra una IGP del 105,56%.

FIGURA 4. Ensayo de cribado antiproliferativo: porcentaje de inhibición del crecimiento (%) registrado en un panel de sesenta líneas celulares tratadas con compuesto 3b a una concentración de 10 & # x000a0 & # x003bcM.

Ensayo de apoptosis

Con el objetivo de investigar el mecanismo por el cual las células mueren después de la administración del compuesto principal, se realizó un ensayo de apoptosis. Se produjeron gráficos de datos empleando expresión fluorescente normalizada de Anexina V y PI (Figuras 5A y # x02013C). En base a la distribución de intensidades, se analizó el porcentaje de células vivas, apoptóticas tempranas, apoptóticas tardías y necróticas en condiciones tratadas y no tratadas. En las células no tratadas (control) la mayoría (91,4%) de las células eran viables, las células restantes murieron de forma apoptótica y necrótica (4,4 y 4,2%, respectivamente) (Figura 5A). Compuesto 3b indujo apoptosis después de 96 & # x000a0h de una manera dependiente de la dosis con 40% de células apoptóticas en 20 & # x000a0 & # x000b5m tratadas y 32% en 7 & # x000a0 & # x000b5m células tratadas (Figuras 5B, C, respectivamente). En particular, las Figuras 5D, E mostraron claramente que la mayoría de las células muertas se caracterizan por características apoptóticas tempranas.

FIGURA 5. N 1 ,N 5 -Bis (4- (5,6-dicloro-1H-benzo [D] [1,2,3] triazol-1-il) fenil) glutaramida (3b) indujo apoptosis en células SK-MES 1 de carcinoma de pulmón humano. El porcentaje de células vivas, apoptóticas y necróticas se midió mediante citometría de flujo utilizando el ensayo de PI-anexina V. Los gráficos de puntos muestran la muerte celular en células SK-MES1: control (A), células tratadas con 20 & # x000a0 & # x000b5M (B), células tratadas con 7 & # x000a0 & # x000b5M (C). Porcentaje de células vivas, apoptóticas y necróticas (DELAWARE). Cada valor representa la media & # x000b1 SD de experimentos independientes (norte & # x0003d 3).


4 importantes inhibidores de la síntesis de proteínas

Se sabe que muchas sustancias actúan como inhibidores de varias etapas de la síntesis de proteínas. Entre ellos se incluyen varios antibióticos producidos por una cepa de microorganismo y letales para otras cepas de la misma o de una especie diferente.

En el cuadro 22-10 se enumeran algunos de los inhibidores de la síntesis de proteínas mejor conocidos. Debido a que las acciones de muchos de estos inhibidores son bastante específicas, han demostrado ser herramientas extremadamente útiles en la elucidación paso a paso del mecanismo de síntesis de proteínas.

1. Inhibidores de la síntesis de proteínas procariotas y eucariotas:

El ácido aurintricarboocílico inhibe la formación del complejo de iniciación al evitar la asociación de ARNm con la subunidad ribosómica pequeña. Los inhibidores de la iniciación se distinguen fácilmente de los inhibidores que bloquean otras etapas de la síntesis de proteínas debido al efecto de retardo que sigue a su administración, es decir, la síntesis de proteínas continúa durante un corto tiempo después de la administración del inhibidor, porque las cadenas de péptidos cuyo crecimiento ya había comenzado no se ven afectados y crecen hasta completarse.

La edeína, un polipéptido aislado de Bacillus brevis, inhibe la unión de aminoacil-tRNA y N-formylmet-tRNA M F et (en procariotas) a la subunidad pequeña. El ácido fusídico es un antibiótico esteroideo en procariotas, inhibe la unión de aminoacil-tRNA al ribosoma, mientras que en eucariotas inhibe la translocación al reaccionar con el factor de elongación.

La puromicina fue uno de los primeros inhibidores de la síntesis de proteínas en tener determinado su efecto específico. Este antibiótico imita el aminoacil-tRNA y se une al sitio A libre de los ribosomas que participan en la síntesis de proteínas. La formación catalítica de un enlace entre el polipéptido naciente y la puromicina va seguida de la liberación de la peptidil-puromicina del ribosoma, ya que no es posible un alargamiento adicional.

Los efectos específicos de la puromicina se han utilizado ventajosamente para estudios de la longitud de la cadena naciente, la cinética del alargamiento de la cadena y la identificación de los efectos de otros antibióticos. La tetraciclina inhibe la síntesis de proteínas al bloquear la unión de aminoacil-tRNA a la subunidad pequeña.

2. Inhibidores específicos para procariotas:

El cloranfenicol (cloromicetina) se une a la gran subunidad de los ribosomas procarióticos e interfiere con el funcionamiento de la péptido sintetasa, inhibiendo así el alargamiento de la cadena. La colicina E3 inhibe la síntesis de proteínas en procariotas al interferir de alguna manera con el funcionamiento de la subunidad pequeña. La eritromicina se une a los ribosomas que no participan en la síntesis de proteínas, lo que evita su participación potencial, pero no se une a los ribosomas que contienen cadenas nacientes (es decir, ribosomas que forman parte de un polisoma funcional). La estreptomicina fue uno de los primeros antibióticos descubiertos y se empleó como agente contra la infección bacteriana durante muchos años antes de que se conocieran sus acciones químicas específicas.

La estreptomicina se une a la proteína S12 de la subunidad del ribosoma pequeño, provocando la liberación de N-formylmet-tRNA M F et de los complejos de iniciación (evitando así la iniciación del crecimiento de la cadena) y también provocando una lectura errónea de los codones del ARNm por los ribosomas que ya participan en el alargamiento de la cadena.

3. Inhibidores específicos para eucariotas:

La anisomicina es un antibiótico producido por Streptomyces que inhibe la formación de enlaces peptídicos cuando se une a la subunidad ribosomal pequeña. La cicloheximida se une a la subunidad grande, evitando la translocación del ARNt en el sitio A al sitio P. La toxina diftérica (producida por una cepa de Corynebacterium diphtherial) inhibe la síntesis de proteínas a través de su acción sobre EF-2 (translocasa). El EF-2 existe en las células de dos formas: libre y unido al ribosoma. La toxina diftérica actúa enzimáticamente para alterar el EF-2 libre, inactivando el factor. El EF-2 unido al ribosoma no es susceptible de inactivación por la toxina.

Pactamydn (producido por una cepa de Streptomyces) se une a pequeñas subunidades libres (no a pequeñas subunidades que ya forman parte de los polisomas), donde previene la iniciación al inhibir la unión de met-tRNA j y la formación del complejo de iniciación. Los efectos tóxicos de la ricina (una proteína presente en el ricino) se conocen desde hace casi un siglo.

La ricina consta de dos cadenas polipeptídicas (unidas por puentes disulfuro), una de las cuales actúa como inhibidor una vez que se incorpora a la célula. La ricina actúa sobre la subunidad grande, evitando la formación del complejo de iniciación 80 S. Al igual que la ricina, el fluoruro de sodio actúa como un inhibidor o el NaF de iniciación bloquea la adición de la subunidad grande al ARNm.

La esparsomicina, otro antibiótico producido por Streptomyces, inhibe la asociación del resto de aminoácidos del aminoacil-tRNA para que no se una a la subunidad grande y, al hacerlo, bloquea la péptido sintetasa. La THcodermina es el único compuesto químico identificado hasta ahora como un inhibidor específico de la etapa de terminación de la síntesis de polipéptidos.

4. Inhibidores de la síntesis de proteínas orgánicas:

La síntesis de proteínas por los ribosomas mitocondriales y de cloroplasto también está sujeta a inhibición por ciertos antibióticos y otras sustancias químicas. Poco después de la demostración inicial de la síntesis de proteínas organelares, se descubrió que el cloranfenicol, un potente inhibidor de la síntesis de proteínas procariotas, bloquea la síntesis en mitocondrias y cloroplastos, mientras que la cicloheximida, que bloquea la síntesis de proteínas ribosómicas citoplasmáticas eucariotas, no tiene efecto sobre la síntesis mitocondrial y de cloroplastos. .

Estas observaciones dieron mayor credibilidad a la noción de que las células procariotas, las mitocondrias y los cloroplastos tienen un origen evolutivo común. Sin embargo, ahora está claro que el panorama es considerablemente más complejo. Por ejemplo, la estreptomicina, que inhibe la síntesis de proteínas procariotas, no inhibe la síntesis de proteínas mitocondriales en las células de levadura.

Otros antibióticos inhiben la síntesis de proteínas mitocondriales pero no tienen ningún efecto sobre los procariotas. La eritromicina inhibe la síntesis de proteínas en procariotas, mitocondrias de levadura y cloroplastos, pero no bloquea la síntesis de proteínas en las mitocondrias de mamíferos.

La última observación sugiere que la naturaleza de la síntesis de proteínas mitocondriales varía entre los diferentes grupos de eucariotas. En general, las mitocondrias de eucariotas superiores son más resistentes a los inhibidores de la síntesis de proteínas procariotas que las mitocondrias de eucariotas inferiores. En los cloroplastos, la síntesis de proteínas es inhibida por los mismos agentes que bloquean este proceso en las células procariotas.

La sensibilidad diferencial de los ribosomas citoplasmáticos y mitocondriales eucariotas a inhibidores específicos proporciona un medio para examinar las fuentes de ciertas proteínas mitocondriales. La síntesis de una proteína mitocondrial en presencia de cicloheximida (un inhibidor del citoplasma) indica que las mitocondrias son la fuente de la proteína, mientras que la síntesis de la proteína en presencia de cloranfenicol indica que la proteína mitocondrial se produce en el citoplasma y luego se mueve. a las mitocondrias.

Experimentalmente, las determinaciones de este tipo se llevan a cabo incubando células en medios que contienen tanto aminoácidos marcados radiactivamente como inhibidor. La síntesis de la proteína mitocondrial se manifiesta por la aparición de radiactividad en la proteína posteriormente aislada de la mitocondria.

Usando este enfoque, ha sido posible demostrar que quizás del 85 al 90% de todas las proteínas ribosómicas mitocondriales se sintetizan en el citoplasma y luego se importan a las mitocondrias, donde, junto con el ARNr mitocondrial, se ensamblan en ribosomas. De los siete polipéptidos que componen la enzima citocromo oxidasa, cuatro se sintetizan en el citoplasma y tres se sintetizan en las mitocondrias.


COVID-19: Parada viral de la síntesis de proteínas

Investigadores de Munich y Ulm han determinado cómo el coronavirus pandémico SARS-CoV-2 inhibe la síntesis de proteínas en las células infectadas y han demostrado que desarma eficazmente el sistema inmunológico innato del cuerpo.

Aunque su nombre es relativamente inespecífico y de hecho opaco, se ha demostrado que la proteína no estructural 1 (Nsp1) codificada por el coronavirus SARS-Cov-2, responsable de la pandemia actual, tiene un efecto devastador en las células huésped. Nsp1 es de hecho una de las armas centrales utilizadas por el virus para asegurar su propia replicación y propagación en huéspedes humanos. Nsp1 se identificó como un factor de virulencia tras el brote del coronavirus del SARS relacionado hace casi 20 años, cuando se demostró que inhibía la síntesis de proteínas en las células infectadas. Ahora, investigadores de Ludwig-Maximilians-Universitaet (LMU) en Munich y el Hospital Universitario de Ulm han descubierto qué hace que Nsp1 sea tan potente. En un artículo que aparece en la revista Ciencias, describen en detalle el modo de acción de la proteína.

En todas las células biológicas, la tarea de sintetizar proteínas se realiza mediante complejas máquinas moleculares conocidas como ribosomas. Los ribosomas interactúan con los ARN mensajeros (ARNm), que sirven como planos para la síntesis de proteínas y traducen la secuencia de nucleótidos de cada ARNm en la secuencia de aminoácidos de la proteína correspondiente. La secuencia de aminoácidos a su vez determina la forma y función biológica de cada proteína individual. Los ribosomas constan de dos subunidades distintas, y Nsp1 se une a la más pequeña, la subunidad 40S. El ARNm inicialmente se une a la subunidad pequeña, antes de la interacción de esta última con la subunidad 60S para formar la cavidad a través de la cual se enhebra el ARNm. El nuevo estudio muestra que un extremo de la proteína Nsp1 interactúa con la subunidad 40S de tal manera que evita la unión del ARNm. Con la ayuda de microscopía crioelectrónica de alta resolución, el profesor Roland Beckmann y sus colegas del LMU Gene Center han demostrado con detalle tridimensional cómo Nsp1 se une estrechamente a un bolsillo específico en la subunidad ribosómica pequeña e inhibe la formación de ribosomas funcionales. . Otros experimentos revelaron que Nsp1 también puede interactuar con estados de configuración específicos del ribosoma completamente ensamblado.

Además, el equipo dirigido por Konstantin Sparrer en el Hospital Universitario de Ulm pudo demostrar que el cierre de la síntesis de proteínas conduce a un colapso casi completo de una de las principales líneas de defensa del cuerpo contra el virus. Nsp1 inactiva la respuesta inmune innata al inhibir una cascada de señalización vital. Los autores del estudio esperan que los conocimientos adquiridos permitan encontrar formas de neutralizar el nuevo coronavirus y así mitigar la gravedad de la enfermedad respiratoria que causa. One potential approach, they say, would be to develop a molecule that masks the viral protein's binding site. This should be feasible, since the Nsp1-binding pocket itself appears not to have an essential role in ribosomal function.


COVID-19: Viral shutdown of protein synthesis method found

Crédito: Pixabay / CC0 Public Domain

Researchers from Munich and Ulm have determined how the pandemic coronavirus SARS-CoV-2 inhibits the synthesis of proteins in infected cells and shown that it effectively disarms the body's innate immune system.

Although its name is relatively unspecific and indeed opaque, the Nonstructural Protein 1 (Nsp1) encoded by the coronavirus SARS-Cov-2, which is responsible for the current pandemic, has now been shown to have a devastating effect on host cells. Nsp1 is in fact one of the central weapons used by the virus to ensure its own replication and propagation in human hosts. Nsp1 was identified as a virulence factor following the outbreak of the related SARS coronavirus nearly 20 years ago, when it was shown to inhibit protein synthesis in infected cells. Now, researchers based at Ludwig-Maximilians-Universitaet (LMU) in Munich and Ulm University Hospital have discovered what makes Nsp1 so potent. In a paper which appears in the journal Ciencias, they describe the protein's mode of action in detail.

In all biological cells, the task of synthesizing proteins is performed by complex molecular machines known as ribosomes. Ribosomes interact with messenger RNAs (mRNAs), which serve as blueprints for protein synthesis, and translate the nucleotide sequence of each mRNA into the amino-acid sequence of the corresponding protein. The amino-acid sequence in turn determines the shape and biological function of each individual protein. Ribosomes consist of two distinct subunits, and Nsp1 binds to the smaller one—the 40S subunit. The mRNA initially binds to the small subunit prior to the latter's interaction with the 60S subunit to form the cavity through which the mRNA is then threaded.

The new study shows that one end of the Nsp1 protein interacts with the 40S subunit in such a way that it prevents binding of the mRNA. With the aid of high-resolution cryo-electron microscopy, Professor Roland Beckmann and his colleagues at the LMU Gene Center have shown in three-dimensional detail how Nsp1 binds tightly to a specific pocket in the small ribosomal subunit and inhibits the formation of functional ribosomes. Further experiments revealed that Nsp1 can also interact with specific configurational states of the fully assembled ribosome.

In addition, the team led by Konstantin Sparrer at Ulm University Hospital was able to show that the shutdown of protein synthesis leads to an almost complete collapse of one of the body's major lines of defense against the virus. Nsp1 inactivates the innate immune response by inhibiting a vital signaling cascade. The authors of the study hope that the insights gained will make it possible to find ways to neutralize the novel coronavirus, and thus mitigate the severity of the respiratory disease that it causes. One potential approach, they say, would be to develop a molecule that masks the viral protein's binding site. This should be feasible, since the Nsp1-binding pocket itself appears not to have an essential role in ribosomal function.


Figura 5

Figure 5. Hypothetical binding mode of compound 20 in a ternary complex with DNA and Top1. All distances are measured from heavy atom to heavy atom. The diagram is programmed for wall-eyed (relaxed) viewing. Compuesto 20 is shown in pink sticks, and the base pairs are displayed in lines.


Ver el vídeo: DNA synthesis inhibitors antibiotics. mode of action (Agosto 2022).