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16.3: Restricción In Silico - Biología

16.3: Restricción In Silico - Biología



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Concepto

Las enzimas de restricción actúan como tijeras moleculares. Los que usamos en Biología Molecular son aquellos que cortan dentro de secuencias conocidas que ocurren con suficiente frecuencia, pero lo suficientemente raras como para cortar nuestro ADN en fragmentos analizables. Los biólogos moleculares suelen utilizar 6 cortadores. Esto significa que el sitio de digestión está "restringido" a una secuencia de reconocimiento de 6 nucleótidos. Estos nucleótidos suelen ser palindrómicos, como se discutió. antes de.

Imagine una pieza lineal de ADN como una cuerda. Al cortar la cuerda una vez, se obtienen 2 piezas. Ahora considere un plásmido. Esto ya se discutió como una pieza circular de ADN. Con un círculo, no hay extremos. cortar el plásmido una vez da como resultado 1 pieza de ADN en lugar de 2. Tenga esto en cuenta al digerir plásmidos circulares. En este caso, el nucleótido 1 es adyacente y contiguo al último nucleótido de la secuencia.

In Silico Digestión

  1. Esta actividad está destinada a complementar Identificación de ADN (actividad)
  2. Inicie UGENE y abra los siguientes archivos:
    • pGlo.gb
    • pUC19.gb
    • pcDNA3.1.gb
    • pUC con inserto
  3. En el Objetos menú, haga clic con el botón derecho en las secuencias y seleccione "Marcar como circular
    • Las secuencias ahora se tratarán como ADN circular.
    • De esta manera, el primer nucleótido y el último nucleótido se vuelven adyacentes como una secuencia continua.

4. En el menú superior, seleccione ComportamientoAnalizarEncuentra sitios de restricción.

  • Esto cargará un conjunto de enzimas de restricción predeterminadas
  • Si no hay ninguno cargado, selecciónelos individualmente (se encuentran en orden alfabético)
    • Elija: BamHI, BglII, ClaI, DraI, EcoRI, EcoRV, HindIII, KpnI, PstI, SalI, SmaI, XbaI, XmaI, NotI

5. ComportamientoClonaciónDigerir en fragmentos

  • Elija su enzima.
  • Tratar Posterior III para cada plásmido.
  • Se agregarán fragmentos a la vista circular y se agregarán anotaciones para estos fragmentos.
  • Puede usar esta información para calcular cuántos fragmentos provienen de enzimas según la cantidad de veces que cortan y por las coordenadas de nucleótidos que se encuentran en la anotación del fragmento.

En silico

En biología y otras ciencias experimentales, un en silico El experimento es uno que se realiza en computadora o mediante simulación por computadora. La frase es pseudo-latina para "en silicio" (en latín sería en silicio), refiriéndose al silicio en los chips de computadora. Fue acuñado en 1987 como una alusión a las frases latinas en vivo, in vitro, y en el lugar, que se utilizan comúnmente en biología (especialmente en biología de sistemas). Las últimas frases se refieren, respectivamente, a experimentos realizados en organismos vivos, organismos vivos externos y dónde se encuentran en la naturaleza.


Un experimento de clonación de ADN in silico para el laboratorio de bioquímica

Este ejercicio de laboratorio introduce a los estudiantes a los conceptos de la tecnología del ADN recombinante al mismo tiempo que acomoda un importante proyecto semestral en purificación, estructura y función de proteínas en un laboratorio de bioquímica para estudiantes de pregrado de nivel junior y senior. También es adecuado para cursos de ciencias forenses enfocados en biología del ADN y clases avanzadas de biología de la escuela secundaria. Los estudiantes comienzan examinando un mapa de plásmido con el objetivo de identificar qué enzimas de restricción se pueden usar para clonar un fragmento de ADN extraño que contiene un gen de interés en el vector. Desde el sitio web de la Iniciativa del Centro Nacional de Biotecnología, se instruye a los estudiantes para que recuperen una secuencia de proteínas y utilicen el programa de traducción inversa de Expasy para traducir de forma inversa la proteína a ADNc. Luego, los estudiantes usan OligoAnalyzer de Integrated DNA Technologies para predecir la cadena de ADN complementaria y obtener secuencias de reconocimiento de ADN para las enzimas de restricción deseadas del sitio web de New England Biolabs. Los estudiantes agregan las secuencias de restricción de ADN apropiadas al ADN extraño de doble hebra para clonar en el plásmido e infectar células de Escherichia coli. Los estudiantes son introducidos a herramientas de biología computacional, terminología de biología molecular y el proceso de clonación de ADN en esta valiosa sesión única, experimento in silico. Este proyecto desarrolla la comprensión de los estudiantes del proceso de clonación en su conjunto y contrasta con otras experiencias de laboratorio y pasantías en las que los estudiantes pueden estar involucrados en solo una parte del proceso / técnicas de clonación. Los estudiantes interesados ​​en realizar estudios de posgrado e investigación o empleo en un laboratorio o industria académica de bioquímica o biología molecular se beneficiarán más de esta experiencia.


Digestión in silico

  1. Esta actividad está destinada a complementar la identificación de ADN (actividad)
  2. Inicie UGENE y abra los siguientes archivos:
    • pGlo.gb
    • pUC19.gb
    • pcDNA3.1.gb
    • pUC con inserto
  3. En el Objetos menú, haga clic con el botón derecho en las secuencias y seleccione & # 8220 Marcar como circular
    • las secuencias ahora se tratarán como ADN circular
    • el primer nucleótido y el último nucleótido se vuelven adyacentes como una secuencia continua de esta manera
  4. En el menú superior, seleccione ComportamientoAnalizarEncuentra sitios de restricción
    • esto cargará un conjunto de enzimas de restricción predeterminadas
    • si no hay ninguno cargado, selecciónelos individualmente (se encuentran en orden alfabético)
      • elija: BamHI, BglII, ClaI, DraI, EcoRI, EcoRV, HindIII, KpnI, PstI, SalI, SmaI, XbaI, XmaI, NotI
  5. ComportamientoClonaciónDigerir en fragmentos
    • Elige tu enzima
    • Tratar PosteriorIII para cada plásmido
    • Se agregarán fragmentos a la vista circular y se agregarán anotaciones para estos fragmentos
    • Puede usar esta información para calcular cuántos fragmentos provienen de enzimas según la cantidad de veces que cortan y por las coordenadas de nucleótidos que se encuentran en la anotación del fragmento.

16.3: Restricción In Silico - Biología

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Digestión in silico

  1. Esta actividad está destinada a complementar la identificación de ADN (actividad)
  2. Inicie UGENE y abra los siguientes archivos:
    • pGlo.gb
    • pUC19.gb
    • pcDNA3.1.gb
    • pUC con inserto
  3. En el Objetos menú, haga clic con el botón derecho en las secuencias y seleccione & ldquo Marcar como circular & rdquo
    • las secuencias ahora se tratarán como ADN circular
    • el primer nucleótido y el último nucleótido se vuelven adyacentes como una secuencia continua de esta manera
  4. En el menú superior, seleccione Comportamiento & rarr Analizar & rarr Encuentra sitios de restricción
    • esto cargará un conjunto de enzimas de restricción predeterminadas
    • si no hay ninguno cargado, selecciónelos individualmente (se encuentran en orden alfabético)
      • elija: BamHI, BglII, ClaI, DraI, EcoRI, EcoRV, HindIII, KpnI, PstI, SalI, SmaI, XbaI, XmaI, NotI
  5. Comportamiento & rarr Clonación & rarr Digerir en fragmentos
    • Elige tu enzima
    • Tratar PosteriorIII para cada plásmido
    • Se agregarán fragmentos a la vista circular y se agregarán anotaciones para estos fragmentos
    • Puede usar esta información para calcular cuántos fragmentos provienen de enzimas según la cantidad de veces que cortan y por las coordenadas de nucleótidos que se encuentran en la anotación del fragmento.

Encuentre sitios de reconocimiento de enzimas de restricción en la secuencia genómica

  1. Cargar archivo de secuencia de base genómica
  2. Si ha instalado datos de muestra, lea "Bsub_50kb.gbk" en el directorio RE_Fragments
  3. Se muestra el mapa de características de Bsub_50kb.gbk
  4. Busque sitios de reconocimiento de enzimas de restricción en esta secuencia de bases.
  5. Haga clic en el botón "Reconocimiento RE". Alternativamente, elija Clonación - & gt Restriction Enzyme en el menú.
  6. Se muestra el cuadro de diálogo "Selección de enzimas".
  7. Haga clic en el botón "Seleccionar todo".
  8. Se agrega un cheque a todas las enzimas de restricción.
  9. Haga clic en el botón "Mostrar sitio de reconocimiento".
  10. Se mostrará la ventana "Reconocimiento del sitio". El nombre de la enzima de restricción y el número de sitios de reconocimiento se enumeran en el lado izquierdo.
  11. Compruebe algunas enzimas de restricción.
  12. En el lado derecho se enumeran todos los sitios de reconocimiento de esas enzimas de restricción.
  13. Haga clic en una línea.
  14. La línea de matriz del mapa de características principal se desplaza automáticamente para mostrar su secuencia de reconocimiento de enzimas de restricción.
  15. La secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción se muestra en color y también se muestra el sitio de escisión.
  16. Haga clic en Digestión.
  17. Se muestra un mensaje de confirmación de ejecución.
  18. Haga clic en "Sí (Y)".
  19. Se muestra el cuadro de diálogo Lista de digestión.
  20. Revisalo.
  21. Haga clic en Cargar.
  22. El fragmento se carga en el directorio actual principal y se muestra un mensaje de confirmación de finalización.
  23. Haga clic en Aceptar.
  24. La matriz de fragmentos se carga al final del directorio actual principal.

Caracterización in silico de una proteína homeodominio relacionada con la familia iroquesa

Se ha demostrado que los genes homeobox desempeñan funciones importantes durante la diferenciación del cáncer y el desarrollo embrionario. Además, se ha demostrado que el subconjunto de genes de homeobox relacionados con Iroquois (IRX) está involucrado en varios procesos de desarrollo embrionario, como el patrón del eje anteroposterior y dorsoventral, así como regiones específicas del sistema nervioso central y la diferenciación. de la vesícula ótica, el epitelio branquial y las extremidades. Hemos caracterizado una nueva proteína homeodominio y el gen correspondiente mediante biología computacional. Dado que la secuencia de la proteína mostró una gran similitud con las proteínas IRX humanas, la proteína homeodominio recién identificada se denominó proteína homeodominio relacionada con la familia Iroquois (IFRX). Se encontró que la secuencia de la proteína IFRX estaba altamente conservada en vertebrados. El gen IFRX correspondiente se localizó en el cromosoma 10p12.1 y está organizado en siete exones. Se predice que la proteína se localiza en el núcleo, lo que respalda la evidencia de un papel funcional como factor de transcripción, como sugiere la existencia de un homeodominio. El perfil de expresión preliminar por medios biocomputacionales predijo un perfil de expresión bastante amplio con expresión en la médula ósea, cerebro, corazón, riñón, hígado, pulmón, páncreas, próstata, músculo esquelético, médula espinal, bazo y timo. Sin embargo, la expresión en varios tejidos pareció ser baja. Además, aproximadamente un tercio de todas las secuencias EST disponibles se obtuvieron de tejidos embrionarios, lo que sugiere que IFRX tiene un papel en el desarrollo embrionario.


Uso del sitio web de Phenogen para el análisis 'in silico' de la analgesia inducida por morfina: identificación de genes candidatos

La identificación de genes que contribuyen a fenotipos conductuales poligénicos (complejos) es un objetivo clave de la investigación genética actual. Un enfoque para este objetivo es combinar la información de expresión génica con información genética, es decir, cartografiar las regiones cromosómicas que regulan los niveles de expresión génica. Este enfoque se ha denominado "genómica genética" y, cuando se utiliza junto con la identificación de regiones genómicas (QTL) que regulan el rasgo fisiológico complejo que se investiga, proporciona una base sólida para el descubrimiento de genes candidatos. En este artículo, describimos la implementación del enfoque genómico genómico / fenotípico para identificar genes candidatos para la sensibilidad al efecto analgésico de la morfina en ratones endogámicos recombinantes BXD. Nuestro análisis se realizó "in silico", utilizando un recurso interactivo en línea llamado PhenoGen (http://phenogen.ucdenver.edu). Describimos en detalle el uso de este recurso, que identificó un conjunto de genes candidatos, algunos de cuyos productos regulan la localización celular y la actividad del receptor opiáceo mu. Los resultados demuestran cómo se puede utilizar PhenoGen para identificar un nuevo conjunto de genes que pueden investigarse más a fondo por su papel potencial en el dolor, la analgesia de la morfina y / o la tolerancia a la morfina.

© 2010 Los Autores, Biología de la Adicción © 2010 Sociedad para el Estudio de la Adicción.

Cifras

Figura 1. Diagrama de flujo para el uso de fenógeno

Figura 1. Diagrama de flujo para el uso de fenógeno

Las distintas pestañas del sitio web de Phenogen, como…

Figura 2. Expresión regional cerebral de Oprm1…

Figura 2. Expresión regional cerebral de Oprm1 (Un rojo), Phactr2 (B) (azul) y Spag9 (C)…


Actividad estrella: -

Es una alteración de la especificidad de la escisión del ADN mediada por enzimas de restricción que puede ocurrir en algunas condiciones no estándar que difieren de las óptimas para la enzima. Esta alteración conduce a la escisión en sitios inespecíficos.

Las condiciones no estándar incluyen:

1. pH alto (& gt8.0).
2. Concentraciones de glicerol & gt5% (importante, porque las enzimas generalmente se entregan como stock concentrado en 50% de glicerol).
3. Alta concentración de enzima (& gt100 U / & microg de ADN).
4. Tiempo de incubación prolongado con enzima.
5. Presencia de disolventes orgánicos en la reacción (por ejemplo, fenol, cloroformo, etanol, DMSO).
6. Cofactor incorrecto (es decir, Mn2 +, Hg2 + o Co2 + en lugar de Mg2 +).

Para evitar la actividad de las estrellas, utilice siempre el sistema tampón óptimo y la cantidad de enzima recomendada. Asegúrese de que la preparación de ADN esté libre de disolventes orgánicos y sales contaminantes.


Ver el vídeo: 1-Diseño Racional y Herramientas in silico - Modelado por Homología (Agosto 2022).