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Precipitación de ADN con isopropanol: duración y magnitud del almacenamiento en frío

Precipitación de ADN con isopropanol: duración y magnitud del almacenamiento en frío


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Los protocolos de preparación de ADN a menudo incluyen un paso de precipitación final con alcohol, a menudo isopropanol, donde el ADN debe mantenerse en el alcohol, a una temperatura baja, como -20 ° C o -70 ° C, a menudo durante la noche.

¿De qué sirve mantenerlo a baja temperatura? ¿Es más bajo mejor? ¿En qué punto ve rendimientos decrecientes?

¿Y el tiempo? ¿Es realmente necesario pasar la noche o, digamos, bastaría con una hora? ¿Las temperaturas más bajas dan como resultado precipitaciones más rápidas?


Para la precipitación se usan diferentes reactivos: Primero se agrega sal en condiciones ligeramente ácidas para asegurarse de que el ADN precipite en un ambiente menos polar. Esto se logra agregando alcoholes como etanol o isopropanol.

Se piensa comúnmente que una incubación a bajas temperaturas mejora los resultados, pero curiosamente esto no es cierto. Hay un artículo de Bethesda Research Laboratories que se llama "Precipitación de ADN con etanol". que analiza estas relaciones (temperatura, tiempo y concentración de alcohol) con gran detalle, definitivamente vale la pena leerlo.

La Figura 1-3 de este documento muestra la influencia del etanol (pero estoy bastante seguro de que esto no es muy diferente para el isopropanol):

Preferiría la precipitación con etanol al ispropanol siempre que sea posible. El isopropanol coprecipita las sales, por lo que hay que lavarlo varias veces con etanol al 70% y es menos volátil que el etanol, por lo que el paso de secado lleva más tiempo. También es menos eficaz la limpieza de compuestos orgánicos como el fenol y, a veces, los gránulos son más difíciles de ver.

Por otro lado, puede resultar útil cuando se trata de grandes volúmenes, ya que solo se necesitan 0,7 volúmenes de isopropanol frente a 2,5 volúmenes de etanol.

Las precipitaciones con isopropanol generalmente no se incuban sino que se centrifugan directamente después de la mezcla. Aquí hay un protocolo de mi laboratorio (que originalmente vino de Qiagen, si mal no recuerdo):

  • Ajustar la concentración de sal, por ejemplo, con acetato de sodio (0,3 M, pH 5,2, concentración final) o acetato de amonio (2,0-2,5 M, concentración final).
  • Agregue 0,6-0,7 volúmenes de isopropanol a temperatura ambiente a la solución de ADN y mezcle bien.
  • Centrifugue la muestra inmediatamente a 10,000-15,000 x g durante 15-30 min a 4 ° C
  • Decantar con cuidado el sobrenadante sin alterar el sedimento.
  • Lave el sedimento de ADN agregando 1-10 ml (dependiendo del tamaño de la preparación) de etanol al 70% a temperatura ambiente. Esto elimina la sal coprecipitada y reemplaza el isopropanol con el etanol más volátil, lo que facilita la redisolución del ADN.
  • Centrifugar a 10,000-15,000 x g durante 5-15 min a 4 ° C
  • Repita los pasos de lavado y centrifugación una vez más.
  • Decantar con cuidado el sobrenadante sin alterar el sedimento.
  • Seque el pellet al aire durante 5-20 min (dependiendo del tamaño del pellet).
  • Vuelva a disolver el ADN en un tampón adecuado.

Abstracto

Se ha desarrollado un método de reacción en cadena de la polimerasa rápido y sencillo para la detección de Phytophthora infestans oosporas, el agente causal del tizón tardío de la papa en el suelo. El método implica la ruptura de las oosporas triturando tierra seca, usando propiedades abrasivas, en presencia de vidrio en polvo y leche desnatada en polvo en poco tiempo. Este último evita la pérdida de ADN por adsorción a partículas del suelo o por degradación y reduce la coextracción de inhibidores de PCR con el ADN. Después de la extracción con fenol / cloroformo, el ADN es adecuado para la amplificación por PCR directa sin un paso de precipitación. Esta amplificación conduce a la detección de patógenos en suelos infestados antes de plantar el cultivo. El ensayo de PCR en tiempo real que describimos es altamente sensible y específico, y tiene varias ventajas sobre los ensayos de PCR convencionales utilizados para P. infestans detección para confirmar el nivel de inóculo positivo en semillas de papa y en otros lugares. Con cantidades crecientes de moldes de ADN estándar, se determinaron los valores del ciclo umbral (Ct) respectivos y se estableció una relación lineal entre estos valores de Ct y el logaritmo de las cantidades de moldes iniciales. El método es rápido, rentable y, cuando se combina con controles internos adecuados, se puede aplicar a la detección y cuantificación de P. infestans oosporas a gran escala.


Abstracto

La conservación de la biodiversidad es una preocupación mundial y la gestión adecuada de las especies o comunidades amenazadas depende de la recopilación de datos fiables y precisos. A pesar de la amplia utilidad del ADN ambiental (eDNA) para la gestión de la conservación y la necesidad de una gestión adecuada de la biodiversidad en los trópicos, la investigación basada en eDNA llevada a cabo en regiones tropicales hasta ahora comprende solo una pequeña proporción de la bibliografía acumulada sobre eDNA. Para abordar la creciente demanda de datos ecológicos rápidos y confiables a nivel de especies y comunidades en las regiones tropicales, proporcionamos una revisión acuática centrada en el eDNA de (1) desafíos y consideraciones para el diseño de muestreo e inferencia de datos de eDNA en los trópicos, y (2) Aplicaciones de eDNA relevantes para la investigación ecológica y la gestión de la biodiversidad en los trópicos. Proponemos que la incorporación colaborativa del muestreo de eDNA con los estudios de campo convencionales tiene el potencial de revolucionar la eficacia de la gestión de la conservación de la biodiversidad en las regiones tropicales.


Resultados

Transcripción temporal y niveles de estado estable de metabolitos durante la aclimatación al frío

El análisis de microarrays de ADN dio como resultado la identificación de 8171 conjuntos de sondas que mostraron diferencias de intensidad de señal estadísticamente significativas afectadas por el tratamiento con CA (Tabla S1). Para detectar cambios en la transcripción y el contenido de metabolitos durante el inicio de la AC, las plantas se mantuvieron a 4 ° C hasta por 96 h. Los datos de metabolitos utilizados en el presente estudio se obtuvieron de nuestro trabajo previamente publicado (Kaplan et al., 2004). Todos los datos de metabolitos utilizados en los análisis actuales se obtuvieron del mismo material vegetal utilizado para realizar análisis de expresión génica, creando conjuntos de datos emparejados experimentalmente para hacer posible este análisis intrigativo. Las respuestas sostenidas y transitorias se clasificaron en tres categorías principales: tempranas (los cambios ocurrieron en 1-4 h), intermedias (los cambios ocurrieron en 12-24 h) y tardías (los cambios ocurrieron en 48-96 h). Una parte de los cambios observados en la expresión génica incluyó transcripciones de genes que codifican enzimas involucradas en muchas vías biosintéticas celulares, como la inducción de callosa, fermentación, fosfolípidos, almidón, azúcar, flavonoides, aminoácidos proteicos, ácido γ-aminobutírico (GABA). y biosíntesis de terpenoides, y la represión de fotorrespiración, ácido fólico, betaína, asimilación de sulfatos, etileno, ácido graso, gluconeogénesis, aminoácidos, brasinoesteroides y biosíntesis de clorofila (la lista de genes en este análisis pertenecientes a las diferentes vías metabólicas se presenta en la tabla S2). De manera similar, el perfil de metabolitos paralelo por GC-MS en las mismas plantas utilizadas para los análisis de expresión génica reveló que las intensidades de señal de 311 compuestos polares de baja masa molecular se alteraron en respuesta a CA, como se informó anteriormente (Kaplan et al., 2004). En general, los tamaños relativos del conjunto de aminoácidos en estado estable, los intermedios del ciclo del ácido tricarboxílico (TCA) y muchos metabolitos del metabolismo de los carbohidratos y los intermedios de la vía fenilpropanoide se vieron afectados por la AC (Tabla S3).

Se realizaron análisis de las variaciones estadísticamente significativas para las transcripciones y metabolitos en las respuestas temporales de las vías biosintéticas monitoreadas durante la AC, y revelaron cuatro tipos de relaciones de respuesta: 1, aumentos en los niveles de señal de las transcripciones para las enzimas de algunas vías (biosíntesis de rafinosa y derivación de GABA) que precedieron a aumentos en los niveles de señal de metabolitos de una manera consistente con la activación transcripcional 2, para muchas vías biosintéticas, incluidas Gly, Ala, Thr, Leu, síntesis de sacarosa y el ciclo de TCA, los aumentos en los niveles de señal de metabolitos precedieron a aumentos en la abundancia de transcripciones (Tabla 1 ) 3, para otras vías como Lys, Met, Trp, Tyr, Arg, Cys, vías biosintéticas de poliaminas y fenilpropanoides, los niveles de señal de transcripción de muchos genes disminuyeron, mientras que sus intensidades de señal de metabolito correspondientes aumentaron (Tabla 1) y 4, transcripciones para Las enzimas de las vías biosintéticas para Ile, Val y Glu no mostraron cambios detectables, pero el cor el contenido de metabolitos que respondieron mostró aumentos considerables. Estos cuatro tipos de relaciones de respuesta temporal para la transcripción y los datos de metabolitos demuestran una variedad de enlaces gen-metabolito en las respuestas de las plantas a la AC que dependen de la abundancia de la transcripción y son independientes.

Nivel de transcripción Nivel de metabolitos Ruta
Aumentar temprano sostenido Aumentar temprano sostenido BIOSÍNTESIS SERINA
Aumentar temprano sostenido Aumentar temprano sostenido BIOSÍNTESIS DE SUCROSA
Aumentar temprano sostenido Aumentar temprano sostenido HIDROLÍTICO DE DEGRADACIÓN DE ALMIDÓN
Aumentar intermedio Aumentar temprano sostenido BIOSÍNTESIS DE GLICINA
Aumentar intermedio Aumentar temprano sostenido GLICÓLISIS
Aumentar intermedio sostenido Aumentar temprano sostenido BIOSÍNTESIS ALANINA
Aumentar intermedio sostenido Aumentar temprano sostenido CICLO TCA
Aumentar intermedio sostenido Aumentar temprano sostenido BIOSÍNTESIS DE TRONINA
Aumentar el transitorio intermedio Aumentar b sostenido temprano BIOSÍNTESIS DE PROLINA
Aumentar tarde NA c DEGRADACIÓN PROLINE
Aumentar el transitorio intermedio (aminotransferasa) Aumentar temprano sostenido BIOSÍNTESIS DE LEUCINA
Sin cambios significativos Aumentar temprano sostenido BIOSÍNTESIS DE ISOLEUCINA
Sin cambios significativos Aumentar temprano sostenido BIOSÍNTESIS DE VALINA
Disminuir el transitorio intermedio N / A DEGRADACIÓN DE VALINA ISOLEUCINA
Disminuir intermedio Aumentar temprano sostenido BIOSÍNTESIS DE LISINA
Disminuir intermedio Aumentar temprano sostenido BIOSÍNTESIS DE METIONINA
Disminuir intermedio Aumentar temprano sostenido BIOSÍNTESIS DE POLIAMINA
Disminuir intermedio y tardío Aumentar temprano sostenido BIOSÍNTESIS TRIPTÓFANA
Disminuir intermedio y tardío Aumentar temprano sostenido BIOSÍNTESIS DE TIROSINA
Disminuir el transitorio intermedio Aumentar temprano sostenido BIOSÍNTESIS ARGININA
Disminuir tarde Aumentar temprano sostenido BIOSÍNTESIS DE CISTEÍNA
Aumentar el transitorio intermedio Aumentar la forma de U sostenida temprana BIOSÍNTESIS TREHALOSA
Aumentar el transitorio intermedio Aumentar intermedio sostenido BIOSÍNTESIS DE RAFINOSA
Sin cambios significativos Aumentar intermedio sostenido BIOSÍNTESIS DE ESPARAGINA
Sin cambios significativos Aumentar intermedio sostenido BIOSÍNTESIS DE GLUTAMATOS
Disminuir temprano sostenido N / A DEGRADACIÓN DE GLUTAMATOS
Disminuir temprano e intermedio Aumentar intermedio sostenido VÍA FENILPROPANOIDE
Aumentar intermedio sostenido Aumentar transitorio intermedio 24 h GABA SHUNT
Disminuir intermedio Disminuir el transitorio intermedio BIOSÍNTESIS DE ASPARTADO
  • Aumento / disminución precoz de la primera respuesta estadísticamente significativa se produjo a las 1 o 4 h. Aumento / disminución intermedio: la primera respuesta estadísticamente significativa se produjo a las 12 o 24 h. Aumento / disminución tardío: la primera respuesta estadísticamente significativa se produjo a las 48 o 96 h.
  • a Se puede encontrar una lista de genes que exhiben cambios en la abundancia de transcripciones asociados con cada vía en la Tabla S2. b Regulación diurna c no disponible

Análisis de componentes principales

El análisis de componentes principales (PCA) se utiliza para reducir la complejidad de los datos multivariados como un método para identificar patrones y expresar datos, de manera que destaquen similitudes y diferencias. Un uso común de PCA ha sido demostrar que los perfiles de metabolitos compuestos pueden ser característicos del estado metabólico de una planta o tejido: es decir, revelar un "fenotipo metabólico" característico y quizás diagnóstico (Fiehn et al., 2000). También se puede aplicar un concepto similar al estado de expresión génica (por ejemplo, Scholz et al., 2005). Usamos PCA para evaluar los cambios simultáneos en los patrones de expresión génica global (este estudio) y los datos del perfil de intensidad de la señal de los metabolitos que se obtuvieron de un trabajo previamente publicado (Kaplan et al., 2004). Los resultados muestran que durante el curso temporal de 4 días de CA, ni la transcripción ni los patrones de metabolitos fueron estáticos, sino que siguieron una secuencia progresiva, indicativa de un cambio continuo (Figura 1) tanto en el perfil de expresión del transcriptoma como en el perfil de metabolitos polares.

Un análisis paralelo de componentes principales (PCA) de la transcripción y los perfiles de metabolitos durante el transcurso del tiempo de aclimatación al frío. Cada punto representa la media de tres experimentos para la expresión génica y dos experimentos para el perfil de metabolitos. El PCA de la transcripción se indica con la línea continua y el PCA del metabolito se indica con la línea discontinua. Los distintos puntos de tiempo (en h) se indican en el gráfico. Los datos de metabolitos utilizados para este análisis se obtuvieron de un conjunto de datos previamente publicado (Kaplan et al., 2004 ).

Metabolismo de los aminoácidos

Los niveles de señal de la mayoría de los aminoácidos proteicos aumentaron durante el transcurso del tiempo de CA, mientras que los niveles de señal de transcripción implicados en la biosíntesis de aminoácidos aumentaron, permanecieron sin cambios o disminuyeron (Tabla 1). En la Figura 2 se muestra una ilustración de la organización general de las vías biosintéticas de aminoácidos. Aumentos de coordenadas aparentes en los tamaños de los grupos de aminoácidos derivados del 3-fosfoglicerato (Ser, O-acetilserina, Cys), fosfoenolpiruvato (Phe, Trp), piruvato (Leu, Val), oxaloacetato (Asn, Lys, Met, Thr, Ile) y α-cetoglutarato (Glu, Pro, Gln, Arg) se observaron durante CA ( Figura 2). Las excepciones notables a los aumentos de coordenadas fueron los intermedios de la vía shikimate y Asp, que permanecieron sin cambios en los niveles de tiempo cero durante la duración de CA. Claramente, el aumento considerable de los aminoácidos aromáticos no dependió del aumento de los niveles de shikimato en el estado estacionario.

Cambio en los niveles de señal de estado estable de aminoácidos en el contexto de familias biosintéticas de aminoácidos. Los valores debajo de cada cuadro de metabolito indican el cambio de veces en la intensidad de la señal en relación con el tiempo cero para 1, 24, 48 y 96 h de aclimatación al frío. La línea discontinua indica el fotorrespiratorio (Pres) vía para la biosíntesis de Gly y Ser. GABA, ácido γ-aminobutírico OAS, O-acetilserina 2PG, 2-fosfoglicolato. Esta figura fue modificada con permiso de la Figura 8.2 en Coruzzi y Last (2000) para ilustrar la dinámica de la intensidad de la señal durante la aclimatación al frío.

Entre los aminoácidos proteicos, la prolina ha atraído mucha atención porque se acumula de manera robusta en condiciones de estrés, incluido el estrés por frío (Gilmour et al., 2000 Verbruggen et al., 1993 Wanner y Junttila, 1999 Xin y Browse, 1998 Yoshiba et al., 1995). Hay dos vías biosintéticas que conducen a Pro: una a partir del glutamato (Figura 3) y la otra a partir de la ornitina. En la vía del glutamato, la enzima principal que proporciona el paso de control de la velocidad en la biosíntesis de Pro en plantas es la Δ 1 -pirrolina-5-carboxilato sintetasa (P5CS), que cataliza los dos primeros pasos (Figura 3a) del precursor Glu a Δ 1 -pirrolina-5-carboxilato (P5C). Esta enzima está sujeta a la regulación por retroalimentación por parte de Pro y por cambios mediados por la luz en la expresión génica (Hayashi et al., 1996 Hu et al., 1992). Arabidopsis contiene dos P5CS genes (Strizhov et al., 1997), ambos representados en la matriz ATH1 como un solo conjunto de sondas. La transcripción y el perfil de metabolitos aquí revelaron que los niveles de señal de ARNm en estado estacionario para P5CS aumentó notablemente después de 12 h de exposición a 4 ° C, y luego disminuyó a niveles cercanos al estrés después de 96 h de frío (Figura 3b). Niveles de señal de transcripción para Δ 1 -pirrolina-5-carboxilato reductasa (P5CR) (At5 g14800) se mantuvieron sin cambios durante las primeras 24 h de exposición a baja temperatura, y luego aumentaron modestamente a 1,3 y 1,7 veces después de 48 y 96 h (no se muestra). En contraste con los niveles de señal de transcripción colectiva observados, se produjo un aumento estadísticamente significativo de más del doble en la intensidad de la señal Pro después de 4 h de exposición a 4 ° C, y esto fue seguido por un aumento continuo y dramático a 130 veces del control. nivel de señal después de 96 h (Figura 3b). El aumento muy temprano en la señal Pro parece ser el resultado de la variación diurna, que no fue alterada por la baja temperatura, ya que las plantas de control sin tratar tomadas en el mismo punto de tiempo (control de 4 h) exhibieron un nivel de señal similar para Pro (datos no mostrados).

Integración de perfiles de transcripción y metabolitos para el metabolismo Pro durante el transcurso de tiempo de aclimatación al frío (CA). (a) Descripción general de la biosíntesis y degradación de prolina. (b) Niveles de señales de metabolitos y transcripciones. Las figuras de la izquierda son ampliaciones de los cambios en las intensidades de la señal de transcripción y metabolito que se acumulan durante las primeras etapas de la AC (0-12 h). GSA, γ-semialdehído glutámico P5C, Δ 1 -pirrolina-5-carboxilato P5CDH, Δ 1 -pirrolina-5-carboxilato deshidrogenasa P5CR, Δ 1 -pirrolina-5-carboxilato reductasa P5CS, Δ 1 -pirrolina-5-carboxilato sintetasa PDH, prolina deshidrogenasa. Los datos de metabolitos se obtuvieron como se describe en el texto.

Durante la degradación de Pro, la prolina deshidrogenasa (PDH) cataliza una conversión regulada por la oscuridad de Pro a P5C (Hayashi et al., 1996), y la Δ1-pirrolina-5-carboxilato deshidrogenasa (P5CDH) produce Glu a partir de P5C (Figura 3). Después de una disminución inicial, los niveles de señal de transcripción para PDH (At3 g30775) aumentó continuamente durante el período de luz (Figura 3) en 4.5 veces después de 96 h de CA, mientras que los niveles de señal de transcripción para P5CDH (At5g62530) permanecieron sin cambios por CA después de 48 y 96 h, cuando los niveles aumentaron ligeramente. En conjunto, está claro que durante la AC, la modulación de la abundancia de transcripciones no es suficiente para explicar la dinámica en los niveles Pro. La modulación de la actividad enzimática también debe ser un proceso regulador vital que se integra con los cambios en la expresión génica.

Derivación GABA

GABA es un metabolito que contiene amina de cuatro carbonos con propiedades crioprotectoras conocidas que se ha sugerido que desempeña un papel en las respuestas de señalización del estrés (Bouche y Fromm, 2004). El GABA se sintetiza mediante la descarboxilación irreversible del aminoácido Glu mediante una glutamato descarboxilasa citosólica (GAD) (Shelp et al., 1999 Figura 4a). Su degradación está además coordinada por la actividad de dos enzimas mitocondriales: GABA transaminasa (GABA-T), que cataliza una reacción reversible entre GABA y semialdehído succínico (SSA), y semialdehído deshidrogenasa succínico (SSADH), que oxida irreversiblemente SSA a succinato ( Bouche et al., 2003) (Figura 4a). Incrementos en los niveles de la señal de transcripción para dos GAD Los genes eran evidentes a las 12 h de CA, y precedieron al aumento en la intensidad de la señal de GABA que alcanzó su punto máximo a las 24 h, demostrando así una respuesta característica de transcripción regulada por abundancia (Figura 4b).

Integración de perfiles de transcripción y metabolitos para el metabolismo de GABA durante el transcurso de tiempo de aclimatación al frío. (a) Descripción general de la derivación GABA. (b) Niveles de señales de metabolitos y transcripciones. GABA, ácido γ-aminobutírico GABA-T, GABA transaminasa GAD, glutamato descarboxilasa GHB, ácido 4-hidroxibutírico SSA, semialdehído succínico SSADH, SSA deshidrogenasa SSR, semialdehído reductasa succínico. Los datos de metabolitos se obtuvieron como se describe en el texto.

Con respecto al catabolismo de GABA, encontramos que GABA-T Los niveles de la señal de transcripción no cambiaron como resultado de CA, pero eso SSADH Los niveles de señal de transcripción alcanzaron su punto máximo después de 24 h y, por lo tanto, precedieron a la siguiente disminución en el contenido de GABA observado a las 48 h (Figura 4b). El semialdehído succínico también se puede reducir a 4-hidroxibutarato (GHB) por la acción reversible de la semialdehído reductasa succínica citosólica (SSR). Se detectó GHB en plantas aclimatadas al frío, en consonancia con el aumento y la caída de GABA, pero los niveles de señal de transcripción para SSR se regularon ligeramente a la baja en general durante la CA (no se muestra). Por lo tanto, la transcripción y el perfil de metabolitos sugieren que el aumento transitorio en el contenido de GABA a las 24 h estaba estrechamente relacionado con el aumento coordinado de GAD y SSADH niveles de transcripción durante CA.

Metabolismo de la sacarosa

Los precursores para la síntesis de sacarosa se derivan de la reserva de hexosa fosfato, que consta de Glc-1-P, Glc-6-P y Fru-6-P, y el nucleótido de azúcar UDPGlc (Figura 5a). Los tres fosfatos de hexosa se mantienen en un equilibrio de estado estable relativo por la fosfoglucomutasa y por la isomerasa Glc-6-P (Dennis y Blakeley, 2000). Tras la transferencia a baja temperatura, los niveles de señal de Glc-6-P y Fru-6-P aumentaron rápidamente de forma hiperbólica hasta las 12 h, y luego permanecieron elevados durante la duración de la AC (Figura 5b). De acuerdo con las funciones de acción de masas de la fosfoglucomutasa y la isomerasa Glc-6-P, sus respectivos niveles de señal de transcripción no exhibieron cambios notables durante 96 h de CA (datos no mostrados). Estas enzimas funcionan como equilibradores y, por lo tanto, explican el estrecho paralelismo de los niveles de Glc-6-P y Fru-6-P a lo largo del tratamiento a baja temperatura. Tras la transferencia a baja temperatura, los niveles de señal de Fru-6-P permanecieron ligeramente mayores que los de Glc-6-P. Sin embargo, la actividad de Glc-6-P isomerasa debería favorecer mayores niveles de Glc-6-P sobre la de Fru-6-P.

Integración del perfil de transcripción y metabolito de la síntesis de fosfatos de hexosa y sacarosa durante el transcurso del tiempo de aclimatación al frío (CA). (a) Breve descripción de la síntesis de hexosa-fosfato y sacarosa. (b) Niveles de señales de metabolitos y transcripciones. Las cifras de la izquierda son ampliaciones de los cambios de los niveles de transcripción y metabolitos acumulados durante las primeras etapas de la AC (0-12 h). Fru, fructosa FK, fructoquinasa Glc, glucosa HEX, hexoquinasa SPP, sacarosa fosfato fosfatasa SPS, sacarosa fosfato sintasa SS, sacarosa sintasa Suc, sacarosa UDP-GlcPP UDP-glucosa pirofosforilasa. Los datos de metabolitos se obtuvieron como se describe en el texto.

Los precursores de la reserva de hexosa fosfato pueden provenir de un proceso de gluconeogénesis mediante la fosforilación de hexosas libres producidas a partir de la degradación de almidón y / o sacarosa (Figura 5a). Las enzimas hexoquinasa (HEX) y fructoquinasa (FK) catalizan la fosforilación de Glc y Fru libres, respectivamente (Figura 5a). Un aumento moderado en MALEFICIO Se detectaron niveles de señal de transcripción, que fueron paralelos a los aumentos de hexosa fosfato durante el período de 96 h de CA (Figura 5b). Por el contrario, los niveles de la señal de transcripción para FK aumentó dramáticamente por 4 h de choque frío, y continuó aumentando hasta 24 h, antes de disminuir a partir de entonces (Figura 5b). La cinética de la inducción robusta de FK en relación con el aumento de los niveles de Fru-6-P sugiere que, además de los procesos glucolíticos y / o gluconeogénicos, la FK puede proporcionar otra fuente biosintética que contribuya a los aumentos en la reserva de estado estacionario de Fru-6-P.

La sacarosa fosfato sintasa (SPS) cataliza la síntesis de sacarosa al convertir UDP-Glc y Fru-6 para producir Suc-6-P, y esta reacción es seguida por la actividad de la sacarosa fosfato fosfatasa (SPP), que elimina el grupo fosfato de Suc. 6-P para producir Suc y fosfato inorgánico (Figura 5a). Encontramos eso SPS Los niveles de la señal de transcripción aumentaron y alcanzaron su punto máximo a las 12 h de CA, y luego disminuyeron a niveles todavía muy por encima de los presentes antes de la exposición a baja temperatura (Figura 5b). Niveles de señal de transcripción para SPP se mantuvieron sin cambios durante CA (datos no mostrados). Los niveles de señal de sacarosa aumentaron inmediatamente dentro de 1 h de exposición al choque frío y continuaron aumentando hasta las 48 h, y luego disminuyeron a las 96 h (Figura 5b). Para descartar la posibilidad de que el aumento de tres veces en el nivel de señal de sacarosa después de 4 h de CA (6 h en el período de luz) fuera un cambio diurno impulsado por fotosíntesis, los niveles de señal de sacarosa se midieron en plantas de control en el mismo punto de tiempo, pero sin exposición a bajas temperaturas. No encontramos cambios en el contenido de sacarosa en las plantas de control (datos no mostrados). Estos resultados indican que el aumento temprano en los niveles de señal de sacarosa en respuesta a CA precedió al aumento observado en SPS y SPP niveles de señal de transcripción. Por lo tanto, el aumento inicial de sacarosa no dependió del aumento de la abundancia de transcripciones.

Para examinar si el aumento en el contenido de sacarosa durante la AC puede ser el resultado de una disminución en su utilización y degradación, se evaluaron los niveles de señal de transcripción para invertasas y sacarosa sintasas (SS). Se encontró que los niveles de la señal de transcripción que codificaban varias invertasas aumentaron, mientras que los de otras invertasas disminuyeron. De manera similar, los niveles de la señal de transcripción de la mayoría SS los genes no se vieron afectados por CA, y solo la señal de transcripción de un solo gen mostró un aumento transitorio (datos no mostrados).

Metabolismo de la rafinosa

La rafinosa es un trisacárido compuesto de unidades de galactosa, glucosa y fructosa, y funciona como un soluto compatible importante en las respuestas de estrés abiótico de las plantas (Taji et al., 2002). Los precursores inmediatos de la rafinosa son el galactinol y la sacarosa, y su tasa de biosíntesis depende de su disponibilidad (Figura 6a). El galactinol se sintetiza a partir de myo-inositol y UDP-galactosa por galactinol sintasa, y luego galactinol reacciona con sacarosa para formar rafinosa y myo-inositol catalizado por rafinosa sintasa (Taji et al., 2002 Figura 6a). De hecho, como se ve en las Figuras 5 (b) y 6 (b), los aumentos en los niveles de sacarosa y galactinol preceden claramente al aumento en el contenido de rafinosa, como podría esperarse de las relaciones sustrato-producto. Encontramos que los niveles de señal de transcripción para genes de galactinol sintasa y rafinosa sintasa aumentaron durante la AC y se regularon de manera coordinada. Los niveles de la señal de transcripción para ambas enzimas aumentaron después de 4 h de choque frío, alcanzaron un pico sincrónico a las 12 h, y luego disminuyeron gradualmente a niveles bajos de estado estable a las 96 h (Figura 6b). Quizás, como consecuencia, o como una ventaja de la influencia de la baja temperatura en el metabolismo, se puede ver que los aumentos en los niveles de la señal de transcripción para los genes que codifican tanto la galactinol sintasa como la rafinosa sintasa también precedieron claramente a los incrementos posteriores de galactinol y rafinosa. señales, que se hicieron evidentes solo a las 12 y 24 h, respectivamente, exactamente como se predeciría a partir de un proceso de transcripción regulada por abundancia (Figura 6b).

Integración de perfiles de transcripción y metabolitos de componentes biosintéticos de rafinosa durante el transcurso de tiempo de aclimatación al frío (CA). (a) Biosíntesis de rafinosa. (b) Evolución temporal de la expresión de metabolitos y genes. Las cifras de la izquierda son ampliaciones de los cambios en los niveles de transcripción y metabolitos acumulados durante las primeras etapas de la AC (0-12 h). (c) Productos de degradación de la rafinosa. GS, galactinol sintasa RS, rafinosa sintasa. Los datos de metabolitos se obtuvieron como se describe en el texto.

La degradación de la rafinosa da como resultado la producción de fructosa y melibiosa o sacarosa y galactosa (Figura 6c). La intensidad de la señal de melibiosa no cambió significativamente hasta 96 h (1,3 veces) de CA, y su nivel permaneció igual incluso después de 24 h de desaclimatación (1,4 veces), cuando las señales de rafinosa volvieron a niveles casi de control (2,6 veces) (Kaplan et al., 2004). De manera similar, los niveles de otro producto de degradación alternativo, la sacarosa, también disminuyeron después de 24 h de desaclimatación cuando la rafinosa se metabolizaba rápidamente (Kaplan et al., 2004 ).

Evolución temporal y dinámica de las respuestas a los carbohidratos

Muchos estudios han demostrado que el contenido de azúcares solubles en las hojas de Arabidopsis aumenta drásticamente durante la AC (Cook et al., 2004 Gilmour et al., 2000 Kaplan et al., 2004 Rohde et al., 2004 Wanner y Junttila, 1999). En el estudio actual, basado en el análisis de perfiles de metabolitos durante el transcurso del tiempo de CA, se examinaron la dinámica del sistema y la secuencia de eventos que conducen a niveles mejorados de carbohidratos. La Figura 7 muestra el curso temporal de las respuestas de la señal para los azúcares durante la AC y, mediante interpolación, designa el momento relativo del aumento o disminución en el valor de la señal para cada metabolito calculando el punto de tiempo en el que alcanzó el 50% en su valor máximo o mínimo (T0.5 [MAX]). Puede verse que los primeros carbohidratos que mostraron aumentos durante la AC fueron la maltosa y la maltotriosa, que son los productos de degradación directa del almidón por la actividad de la β-amilasa (Figura 7b). El aumento de la señal de la maltotriosa siguió al de la maltosa y, por lo tanto, puede ser un derivado o una consecuencia de la desproporción de la maltosa a la maltotriosa y la glucosa. Los niveles de señal de los disacáridos isomaltosa y maltitol muestran pocos cambios y no parecen ser los principales productos acumulados de la degradación del almidón. Sus niveles de señal aumentan más tarde que la maltosa y la maltotriosa, y parecen estar vinculados con niveles altos de señal de maltosa y maltotriosa (Figura 7a). Estos aumentos para los productos de degradación del almidón fueron seguidos sincrónicamente por la acumulación de hexosa fosfatos Glc-6-P, Fru-6-P, Gal-6-P y Man-6-P (Figura 7b). Los niveles de señal de Gal-6-P y Man-6-P aumentan rápidamente, exhibiendo un sorprendente paralelo entre sí seguido de un retorno oscilante de dos ciclos a los niveles de pre-tensión (Figura 7b). Las respuestas de Glc-6-P y Fru-6-P fueron paralelas y exhibieron un patrón hiperbólico hacia un nuevo nivel elevado de señal de estado estable, quizás característico de la necesidad metabólica de baja temperatura. Los fosfatos de hexosa son precursores inmediatos de la biosíntesis de sacarosa y, de hecho, se puede ver que su aumento se correspondía cinéticamente bien con el T0.5 [MAX] de sacarosa (Figura 7c).

Evolución temporal de la acumulación de carbohidratos durante la aclimatación al frío. (a) Productos de degradación del almidón, (b) hexosa fosfatos, (c) sacarosa y hexosas libres, y (d) metabolitos de rafinosa. T0.5 [MAX] Las estimaciones de puntos de tiempo se derivan de la interpolación de los perfiles del curso temporal de los metabolitos individuales donde se calculan los puntos temporales en los que cada metabolito alcanzó el 50% de su concentración máxima (* mínima) durante el curso temporal. El área sombreada indica los niveles de estado estacionario previos al estrés y por debajo. Para los metabolitos cuyos niveles disminuyeron, el T0.5 [MIN] se indican con un asterisco.

La intensidad de la señal de sacarosa aumentó durante 1 a 4 h de CA con un T0.5 [MAX] de aproximadamente 1 h. Este incremento fue seguido por incrementos señalados en sus productos de degradación Glc y Fru (Figuras 5b, 7c) con T0.5 [MAX] valores de aproximadamente 1 h. Dado el patrón hiperbólico de casi 1: 1, los aumentos observados en Glc y Fru sugieren una fuente común y muy probablemente reflejen la descomposición de la sacarosa por la invertasa. Los niveles de señal de transcripción para genes que codifican invertasas permanecieron constantes y no se vieron afectados por CA (datos no mostrados). Por lo tanto, el aumento del nivel de sustrato (sacarosa) y la compartimentación durante la AC sería el factor impulsor que resultaría en aumentos paralelos e hiperbólicos en los productos Glc y Fru. Por el contrario, el galactinol, tras el aumento observado en los niveles de la señal de transcripción para la galactinol sintasa (Figura 6b), se acumuló en etapas relativamente posteriores (T0.5 [MAX] = 8–9 h) durante la AC (Figura 7d). Finalmente, la acumulación combinada de galactinol junto con el aumento anterior de sacarosa contribuyen a la biosíntesis robusta y la acumulación de rafinosa en etapas secuencialmente posteriores de CA (T0.5 [MAX] = 17-18 h Figura 7d). Así, en general, el estimado T0.5 [MAX] Los valores sugieren una secuencia metabólica integrada de eventos que resulta en la aparente acumulación de carbohidratos durante la AC que se resume en la Figura 7.


La sequía histórica afecta la dinámica y la actividad de la población microbiana durante el secado y rehumedecimiento del suelo

Una historia de exposición a la sequía promovida por regímenes variables de precipitación puede seleccionar taxones microbianos del suelo tolerantes a la sequía, pero los mecanismos de supervivencia y muerte de las poblaciones microbianas a través del estrés selectivo del suelo secando y rehumedeciendo no se comprenden bien. Sometimos suelos recolectados de un experimento de sequía de campo de 15 años (historial de precipitación "alterado" con períodos secos prolongados, versus el control de campo "Ambiente") a un experimento de secado / rehumectación de laboratorio, para saber si la supervivencia selectiva de la población, la muerte, o el mantenimiento del potencial de síntesis de proteínas y la respiración microbiana a través de las condiciones variables del agua del suelo se vio afectado por el legado de la sequía en el campo. La composición de la comunidad microbiana, medida mediante la secuenciación Illumina MiSeq del gen de rRNA 16S y rRNA 16S, cambió con tratamientos de secado / rehumectación de laboratorio y de sequía en el campo. En suelos ambientales, hubo una mayor proporción de reducción de la abundancia de OTU (indicativo de mortalidad) durante el rehumedecimiento, mientras que los suelos alterados tuvieron una mayor proporción de poblaciones de OTU estables que no cambiaron en abundancia (indicativo de supervivencia) por secado / rehidratación. mojado. Los suelos alterados también tuvieron una menor proporción de genes de rRNA: rRNA (menor potencial de síntesis de proteínas) durante el secado, un mayor número medio ponderado de operones de rRNA (tasa de crecimiento potencial y selección r) que se asoció con una mayor abundancia de Firmicutes (pedido Bacillales) y tasas de respiración microbiana promedio más bajas. Estos datos demuestran que los suelos con un legado histórico de sequía más débil exhiben una mayor prevalencia de mortalidad por estrés hídrico microbiano y supervivencia diferencial y muerte en los niveles de OTU después de un secado y rehumectación a corto plazo, junto con un mayor potencial de pérdida de carbono. Este trabajo proporciona una visión novedosa de los mecanismos y las consecuencias de los cambios microbianos del suelo que resultan de las condiciones de sequía prolongada.

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Neveras especiales para -80 °C (-112 °F)

Esta vista poco apetitosa es la cicatriz en mi brazo de mi vacuna contra la viruela. Probablemente no tenga uno de estos si es joven, porque vacunas como esta en poblaciones enteras erradicaron con éxito la viruela en todo el mundo en 1980.

Esta vacuna en particular debe refrigerarse a -80 grados Celsius hasta que esté lista para su uso. Esto presenta un problema significativo para cualquier programa de vacunación masiva, porque si bien los congeladores de -80 grados son un negocio hecho en términos de fabricación, no se encuentran comúnmente en la atención médica comunitaria. Los laboratorios y los principales hospitales pueden tenerlos, pero se nos ha dicho que incluso en un país desarrollado, los médicos generales que tendrán la tarea de administrar la vacuna hasta ahora han tenido poca necesidad de uno. Si esto presenta un problema en un lugar con recursos importantes, entonces se magnifica significativamente en las regiones menos ricas del mundo, porque para combatir eficazmente una pandemia global es imperativo que todo el planeta esté vacunado para evitar que quede un reservorio de infección.

No soy biólogo, pero todas las clases de biología de la escuela enseñan los conceptos básicos de vacunación para los niños. A finales del siglo XVIII, el Dr. Edward Jenner inoculó con éxito a un niño con el virus de la viruela vacuna para conferir inmunidad a la viruela, y de ahí desarrolló la ciencia de la inmunología. Es probable que todos hayamos recibido vacunas similares que nuestra biología de la escuela secundaria simplifica para nosotros como relaciones debilitadas o menos potentes con el objetivo, y el hecho de que los asesinos del pasado ahora están retrocediendo en la memoria popular es testimonio de su éxito.

Estos son los golpes que mis médicos y su equipo en Oxfordshire administran por miles, y pueden proteger a generaciones de niños británicos con ellos usando solo un refrigerador relativamente convencional. ¿Qué tiene de especial la vacuna Pfizer / BioNTech? La respuesta está en su método de funcionamiento, en lugar de exponernos a un patógeno, se trata de una llamada vacuna de ARN. Contiene un fragmento del virus y material genético # 8217, que una vez administrado ingresa a nuestras células y desencadena sus respuestas inmunes al coronavirus. El problema que nos dicen radica en la fragilidad del ARN, y para evitar que se degrade es necesario un frigorífico extra frío.


Efectos de confusión

Desde un punto de vista aplicado, los protocolos FTR son indudablemente útiles para prolongar la vida útil de insectos importantes en instalaciones de pequeña escala. Sin embargo, su aplicación en la producción industrial de insectos puede enfrentar dificultades técnicas. Si bien es relativamente fácil cambiar rápidamente la temperatura de los gabinetes de pequeño volumen en poco tiempo, los cambios breves y recurrentes en la temperatura de las unidades de cría a gran escala (por ejemplo, el tamaño de la habitación) pueden ser mucho más desafiantes desde el punto de vista técnico y consumir energía. Además, el cambio de temperatura también afecta directamente a la humedad relativa (RH). Cuando la temperatura disminuye después de episodios cálidos sin cambiar el contenido de humedad del aire, la HR llegará finalmente al 100% y el vapor de agua comenzará a formarse condensación. Es bien sabido que los cambios en la HR afectan la fisiología de los insectos (por ejemplo, Boardman et al., 2013), y la variación de la HR que acompaña a la FTR también puede afectar directamente la supervivencia al frío de los insectos. De hecho, la alta humedad puede promover la supervivencia al frío de Drosophila a algunas temperaturas (Kobey y Montooth, 2013), pero esto no siempre es cierto (Boardman et al., 2013 Enriquez y Colinet, 2017). Los experimentos de FTR deben explorarse tanto a niveles constantes como variables de HR para desenredar los efectos de cada uno. El agua libre que puede condensarse en las superficies de los contenedores de cría bajo FTR, asociada con intervalos cálidos, también puede crear ambientes que sean altamente propicios para el crecimiento de hongos y microbios (Sikorowski y Lawrence, 1994). Aún no se ha evaluado si la FTR favorece la contaminación de las colonias de insectos y el posible costo de las respuestas inmunitarias. Por último, cuando las etapas de alimentación se almacenan en FTR con suministro de alimentos, los insectos pueden ingerir alimentos durante los episodios cálidos, mientras que los insectos almacenados en CLT se mueren de hambre todo el tiempo (Koštál et al., 2016). Por lo tanto, los efectos positivos de FTR en algunos casos pueden resultar de factores distintos a la temperatura per se..


Nano y micropartículas de lípidos: una descripción general de la investigación relacionada con las patentes

Los rasgos de biocompatibilidad y versatilidad de los lípidos han llevado a que, en las últimas dos décadas, se diseñen muchas formulaciones de lípidos nano y microparticulados en forma de esferas y cápsulas, utilizando lípidos sólidos y líquidos como matrices. Esta revisión describe los principales tipos de nanopartículas y micropartículas lipídicas, así como sus métodos de preparación, vías de administración y principales campos de aplicación. También proporcionará una descripción general sintética de las principales patentes que se han presentado. La actividad de patentamiento en el campo de las nanopartículas lipídicas ha estado en curso durante 25 años y ha sido impulsada por el auge del uso de la nanotecnología como una herramienta innovadora para el tratamiento de enfermedades y el interés comercial potencial en un vehículo totalmente biocompatible. Inicialmente, la actividad se centró principalmente en los aspectos tecnológicos, y luego el enfoque se centró más en el uso y la composición. Los países emergentes también están solicitando un número cada vez mayor de patentes. Sin embargo, la limitación más importante aquí es el bajo número de productos comercializados, que se debe principalmente a restricciones regulatorias y razones económicas.

1. Introducción

Las nanopartículas y micropartículas de lípidos muestran muchas ventajas sobre las nanopartículas poliméricas y se han utilizado ampliamente en la administración de fármacos y activos. Muestran una mejor biocompatibilidad que las nanopartículas poliméricas, ya que están formadas por lípidos que son similares a sus homólogos fisiológicos [1].

En particular, las nanopartículas de lípidos son una herramienta de administración versátil. Además de los liposomas y niosomas, que son nanoestructuras vesiculares que están formadas por fosfolípidos y lípidos anfipáticos, respectivamente, y tienen un historial de uso largo y seguro, las últimas dos décadas han visto muchas formulaciones de nanopartículas que se han diseñado utilizando lípidos sólidos y líquidos como matrices. La estabilidad cinética y la morfología rígida son las principales ventajas que tienen las nanopartículas lipídicas sobre los sistemas coloidales lipídicos vesiculares (liposomas, niosomas, etc.). Las nanopartículas a base de lípidos superan las limitaciones de otros portadores farmacéuticos y cosméticos generalizados, las emulsiones, porque mejoran la estabilidad y la capacidad de carga y evitan la expulsión del fármaco / molécula activa durante el almacenamiento. Sin embargo, los sistemas de nanoemulsión pueden considerarse una plantilla para la generación de nanopartículas. De manera análoga, las nanopartículas lipídicas se preparan con frecuencia a partir de microemulsiones, que son sistemas termodinámicamente estables [2]. Las nanopartículas se pueden dividir en dos familias principales: nanoesferas, que tienen una estructura homogénea a través de la partícula, y nanocápsulas, que exhiben una estructura típica de núcleo-capa. Los tipos más importantes de nanopartículas lipídicas se muestran en la Figura 1.

1.1. SLN

Las nanopartículas de lípidos sólidos (SLN) son el tipo de nanoesferas más conocido. Los SLN están formados por lípidos sólidos con un diámetro medio de espectroscopia de correlación de fotones de aproximadamente entre 50 y 1000 nm [1]. Los ingredientes generales incluyen lípidos sólidos, tensioactivos y agua. El término lípido se usa aquí en un sentido amplio e incluye triglicéridos (por ejemplo, triestearina), glicéridos parciales, ácidos grasos (por ejemplo, ácido esteárico), esteroides (por ejemplo, colesterol) y ceras (por ejemplo, palmitato de cetilo). Se han utilizado todas las clases de tensioactivos (con respecto a la carga y el peso molecular) para estabilizar las dispersiones de lípidos [3]. Los SLN se desarrollaron a principios de la década de 1990 y durante mucho tiempo se han considerado sistemas portadores de fármacos prometedores, ya que son fisicoquímicamente estables y pueden producirse fácilmente a gran escala industrial, mientras que los costes de materia prima y producción son relativamente bajos [1]. La producción de SLN se basa principalmente, pero no exclusivamente, en tecnologías de nanoemulsión solidificada. La homogeneización de alta presión (HPH), la homogeneización de alto cizallamiento y la ultrasonicación se utilizan en la preparación de nanoemulsión [4, 5].

1.2. NLC

Los portadores de lípidos nanoestructurados (NLC) son nanopartículas de lípidos que se caracterizan por un núcleo lipídico sólido que consiste en una mezcla de lípidos sólidos y líquidos. Si bien la matriz de partículas lipídicas resultante muestra una depresión del punto de fusión en comparación con el lípido sólido original, la matriz sigue siendo sólida a la temperatura corporal. Se obtienen diferentes tipos de NLC, imperfectos, amorfos y de tipo múltiple, según el método de producción y la composición de la mezcla de lípidos (Figura 1). “En el tipo imperfecto, la cristalización de lípidos se ve alterada por pequeñas cantidades de aceites. En el tipo amorfo, la matriz lipídica es sólida, pero no cristalina (estado amorfo); esto se puede lograr mezclando lípidos particulares, por ejemplo hidroxiestearato de hidroxioctacosanilo y miristato de isopropilo. En el tipo múltiple, la matriz lipídica sólida contiene diminutos compartimentos de aceite. Este tipo se obtiene mezclando un lípido sólido con una mayor cantidad de aceite. La idea básica es que, al dar una determinada nanoestructura a la matriz lipídica, se aumenta la carga útil del compuesto activo y se evita la expulsión de los compuestos atrapados durante el almacenamiento ”[6]. La HPH puede producir NLC y el proceso puede modificarse para producir dispersiones de partículas lipídicas con contenidos sólidos que oscilan entre el 30 y el 80% [7].

1.3. LDC

Se desarrollaron nanopartículas de conjugado lípido-fármaco (LDC) para superar las bajas capacidades de carga de fármacos de SLN y NLC para fármacos hidrófilos (Figura 1). “En un proceso típico, una masa de conjugado fármaco-lípido insoluble se prepara mediante la formación de una sal (por ejemplo, con un ácido graso) o mediante un enlace covalente (por ejemplo, ésteres o éteres). El LDC obtenido se procesa luego para crear una formulación de nanopartículas, utilizando HPH con la ayuda de una solución acuosa de surfactante ”[6, 8].

1.4. LNC

Las nanocápsulas de lípidos (LNC) son la forma patentada más conocida de nanoestructuras de capa de núcleo de lípidos. Están compuestos por una capa externa, formada por lípidos sólidos y agentes emulsionantes, y un núcleo aceitoso (Figura 1) [2]. A diferencia de los NLC de tipo múltiple, que se componen de una matriz lipídica sólida que contiene numerosos compartimentos aceitosos, en los que los fármacos tienden a dividirse, los LNC poseen un único núcleo aceitoso que contiene el fármaco, que está rodeado por una fina capa sólida (estructura de capa central) .

Pasando ahora a las micropartículas lipídicas, los tipos más conocidos son las micropartículas lipídicas sólidas (SLM).

1.5. SLM

"SLM tiene una composición equivalente a SLN, pero con un tamaño de partícula mayor (& gt1000 nm), lo que significa que sus dominios de aplicación y rutas de administración pueden ser diferentes" [6, 9]. De hecho, a pesar de su considerable potencial como sistemas portadores de fármacos, el SLM todavía tiene que ver un uso significativo, en comparación con el SLN. La principal restricción para su uso en la administración parenteral de fármacos es el hecho de que no son adecuados para administración intravenosa. administración debido a los límites de tamaño. Sin embargo, su uso en la administración pulmonar de fármacos es prometedor.

1.6. Descripción general de la patente

En la Tabla 1 se muestra un resumen de los principales tipos de partículas lipídicas que son objeto de solicitudes de patente. Además de los tipos de nanopartículas mencionados anteriormente, también se incluyeron patentes relativas a nanopartículas híbridas de lípidos poliméricos (PLN). Los PLN consisten en una matriz mixta de lípidos y polímeros, en la que el polímero se introduce para mejorar las características de las nanopartículas o para facilitar la incorporación del fármaco. Además, también se enumeran las patentes relativas a sistemas nanoparticulados funcionalizados y de forma variable.

2. Métodos de preparación

2.1. Métodos de preparación de nanopartículas lipídicas

(a) Homogeneización en caliente. HPH ha demostrado repetidamente que es una técnica sencilla sin disolventes desde la década de 1950. Está bien establecido para la producción a gran escala de emulsiones parenterales O / W y está disponible para la industria farmacéutica. Recientemente se ha utilizado en la producción de SLN, NLC y LDC y es el método principal para estas nanopartículas. Sin embargo, involucra algunos parámetros críticos del proceso, como altas temperaturas y presiones (fuerzas de cavitación), que pueden causar un estrés termodinámico y mecánico significativo en el producto resultante. Por esta razón, y con el fin de superar los métodos patentados, los métodos de preparación alternativos y de fácil manejo han sido objeto de una extensa investigación [4, 6, 23].

(b) Plantillas de microemulsión. SLN se puede producir a partir de plantillas de microemulsión. Gasco y col. [24] fueron los primeros investigadores en utilizar una plantilla de microemulsión para la preparación de SLN "los lípidos se calientan por encima de su punto de fusión y se añade una fase acuosa, que contiene tensioactivos y co-tensioactivos, con agitación a la misma temperatura para formar un O / W transparente microemulsión ”[6]. También se pueden preparar múltiples W / O / W. A continuación, la microemulsión se diluye en agua fría (2-10 ° C) para precipitar las nanopartículas.

Hace unos años, se desarrolló otro método basado en microemulsión para la producción de SLN estable [25]. Los autores partieron de una microemulsión O / W, que consistió en una cera emulsionante como fase lipídica y una solución de tensioactivo polimérico como fase acuosa, que se mantuvo a una temperatura de 37-55 ° C, según el punto de fusión del cera emulsionante. Los SLN se obtuvieron enfriando la microemulsión O / W sin diluir a temperatura ambiente mientras se agitaba. “Una ventaja de esta invención es que SLN se puede formular de forma rápida, reproducible y rentable a temperaturas de funcionamiento suaves a partir del precursor de la microemulsión en un proceso de un solo paso y contenido en un solo recipiente, vial o recipiente de fabricación” [6].

(c) Métodos basados ​​en solventes. Se han propuesto métodos basados ​​en disolventes como un medio para encapsular moléculas que presentan problemas de estabilidad y biodisponibilidad en varios tipos de nanopartículas lipídicas, independientemente de los aspectos limitantes de los problemas de toxicología de los disolventes. “Una de las principales ventajas de los métodos basados ​​en disolventes es la temperatura de funcionamiento suave, que puede ser útil para la encapsulación de fármacos termosensibles” [6]. El desplazamiento de solvente es el más simple de estos métodos. Se basa en disolver el lípido en un solvente orgánico miscible en agua (por ejemplo, etanol, acetona e isopropanol) e inyectar esta solución en agua, usando una aguja de jeringa, bajo agitación. Los métodos alternativos basados ​​en disolventes comienzan con un precursor de emulsión O / W o W / O / W. Se pueden preparar emulsiones utilizando un disolvente orgánico volátil o parcialmente miscible en agua, que disuelve el lípido. Las nanopartículas se forman cuando el disolvente se elimina por evaporación (método de evaporación del disolvente) o por dilución con agua (método de difusión del disolvente) [4, 22, 23].

(d) Método de coacervación. Recientemente se ha desarrollado un nuevo método sin disolventes (denominado coacervación) para la preparación de SLN de ácidos grasos. Esta técnica permite incorporar fármacos, incluso termosensibles, sin utilizar equipos muy complejos ni disolventes peligrosos. Por tanto, es un método económico para aplicaciones industriales y de laboratorio [26]. “Se basa en la interacción lenta que ocurre entre una solución micelar de una sal sódica de ácido graso y una solución ácida (solución coacervante) en presencia de un agente estabilizador polimérico anfifílico adecuado” [6]. Las nanopartículas de ácidos grasos se pueden precipitar reduciendo el pH.

(e) Tecnología de fluidos supercríticos. La tecnología de fluidos supercríticos (SCF) ha atraído un creciente interés, en los últimos años, por los beneficios que proporciona como método de producción de nanopartículas. La condición de SCF se obtiene por encima de la presión y temperatura críticas de una sustancia, en donde su solubilidad en el fluido puede ser modulada por cambios de presión relativamente pequeños. El dióxido de carbono es el SCF más utilizado por su bajo punto crítico, de 31 ° C y 74 bar, su seguridad y bajo coste. Se han desarrollado dos métodos principales basados ​​en SCF para la producción de SLN: la extracción de emulsiones con SCF (SFEE) y la atomización por fusión asistida por gas (GAMA).

En SFEE, las nanosuspensiones de lípidos se obtienen mediante la extracción con SCF del disolvente orgánico de las emulsiones O / W [27]. Extracción de solvente en CO supercrítico2 conduce a la precipitación de material lipídico / fármaco, que se disuelve como partículas compuestas. Una de las ventajas de esta técnica es la alta eficiencia de extracción por solvente del CO supercrítico.2, en comparación con los métodos convencionales, lo que permite eliminar el disolvente de forma rápida y completa y lograr una distribución del tamaño de partícula más uniforme (Figura 2).

En el método GAMA, “los lípidos se funden en una cámara de mezcla termostatizada (CM), donde se funden y se mantienen en contacto con CO supercrítico2”[6]. Luego, se abre una válvula en la parte inferior del CM, donde la mezcla saturada de lípidos se fuerza a través de una boquilla. La rápida despresurización de la mezcla crea un alto grado de sobresaturación y conduce a la precipitación de micropartículas, que son recolectadas por un sistema de recolección y dispersadas en agua mediante vórtex y tratamiento de ultrasonido para dar las nanosuspensiones (Figura 3) [28]. Este método no contiene disolventes, lo que lo hace ventajoso para los procesos industriales.

(f) Asistencia de microondas. Las microondas pueden ayudar a formar la plantilla de microemulsión utilizada para la preparación de nanopartículas [31] y en la producción directa de nanopartículas [32]. En este segundo caso, utilizar un reactor de microondas es sencillo, rápido, económico y sostenible. Esta tecnología facilita la producción de partículas en un solo recipiente, en uno o dos pasos y en un sistema cerrado. Además, no utiliza disolventes orgánicos ni grandes volúmenes de agua.

(g) Centrífuga asimétrica doble. Las nanopartículas de lípidos se pueden preparar en una centrífuga asimétrica dual (DAC) [33]. DAC se diferencia de la centrifugación convencional en que la muestra también gira alrededor de su propio eje vertical. Mientras que la centrifugación convencional empuja constantemente el material de muestra hacia afuera, esta rotación adicional fuerza constantemente el material de muestra hacia el centro de la centrífuga. Esta combinación única de dos movimientos contrarrotantes da como resultado fuerzas de cizallamiento y, por lo tanto, una homogeneización eficiente.

(h) Contactor de membrana. Se ha desarrollado otro método para producir SLN, uno que utiliza un contactor de membrana [34]. Se ha producido un módulo de funcionamiento. Incluye una membrana cerámica (0,1, 0,2 o 0,45 μm tamaño de poro) “que separa la fase acuosa, que se deja circular tangencialmente a la superficie de la membrana, y la fase lipídica” [6]. La fase lipídica se funde en un recipiente presurizado y se fuerza a través de un tubo hacia los poros de la membrana colocados en el módulo, lo que lleva a la formación de pequeñas gotas, que se desprenden de los poros de la membrana mediante un flujo de agua tangencial. Los SLN se forman después de que se enfría la dispersión de agua obtenida (Figura 4). El método propuesto permite la preparación continua de grandes volúmenes y, por lo tanto, se afirma que es muy adecuado para la ampliación industrial.

(i) Temperatura de inversión de fase. El método de temperatura de inversión de fase (PIT) se emplea habitualmente para la preparación de nanoemulsiones. El concepto PIT aprovecha la capacidad específica de algunos tensioactivos polietoxilados para cambiar sus afinidades por el agua y el aceite en función de la temperatura. “El uso de un tipo de tensioactivo de este tipo conduce a una inversión de la emulsión de una macroemulsión O / W a una emulsión W / O cuando la temperatura aumenta por encima del PIT” [6]. Entonces se forma una nanoemulsión O / W cuando la temperatura desciende por debajo del PIT. El método PIT se ha empleado también para la preparación de LNC, con un núcleo de aceite líquido o semilíquido interno y una capa lipídica externa que es sólida a temperatura ambiente [2]. También se ha adaptado recientemente para la preparación del GC. La fase acuosa, que contiene NaCl, y la fase oleosa, compuesta por lípidos sólidos y tensioactivos no iónicos, se calientan por separado a

90 ° C (por encima del PIT). A continuación, se añade gota a gota la fase acuosa, a temperatura constante y con agitación, a la fase oleosa, para obtener una emulsión A / O. A continuación, la mezcla se enfría a temperatura ambiente con agitación lenta y continua. La mezcla turbia se vuelve clara en el PIT y, por debajo del PIT, se forma una nanoemulsión O / W, que se convierte en SLN por debajo del punto de fusión de los lípidos ”[6, 36].

2.2. Métodos de preparación de micropartículas lipídicas

SLM puede obtenerse en suspensión o en estado sólido en polvo, dependiendo de la técnica utilizada [37].

(a) Dispersión de fusión. La técnica de dispersión en masa fundida se emplea para la formulación SLM. El SLM se puede obtener a partir de emulsiones O / W o múltiples W / O / W, dependiendo de la naturaleza química del fármaco. En el caso del precursor O / W, el fármaco lipófilo se disuelve en los lípidos fundidos, que se emulsionan con una solución de tensioactivo caliente en agua usando un mezclador de alto cizallamiento. A continuación, las micropartículas de lípidos se solidifican mediante enfriamiento a temperatura ambiente [38]. En el caso del precursor W / O / W, se forma una emulsión W / O primaria disolviendo el fármaco en la fase acuosa, que luego se pone en contacto con una fase acuosa externa a la misma temperatura. La emulsión múltiple A / A / A resultante se enfría luego a temperatura ambiente para obtener las micropartículas [39].

(b) Micronización criogénica. “En la micronización criogénica, matrices lipídicas que se obtienen mediante dispersión en estado fundido (el fármaco se mezcla con un lípido fundido) o extracción con disolvente (el fármaco y el lípido se disuelven en una mezcla de disolvente con agitación)” [6], almacenado a -80 ° C, y luego micronizado en un aparato personalizado bajo el efecto de nitrógeno líquido. Esta técnica solo se puede utilizar para la producción de micropartículas de 5-5000 μm de diámetro [40].

(c) Secado por pulverización. El secado por pulverización de las partículas lipídicas se realiza utilizando una solución de disolvente orgánico como alimentación. Esta solución se evapora a una forma de partículas secas en un proceso de un solo paso [41].

(d) Electropulverización. El atomizador electrostático en la técnica de electropulverización incluye una boquilla que se conecta a una fuente de alimentación de alto voltaje y se suministra con el líquido a atomizar. La solución de lípidos, que está en un disolvente orgánico, está contenida en una jeringa y un capilar metálico está conectado a una fuente de alimentación de alto voltaje y funciona como un electrodo. Un colector de láminas de metal se coloca frente al capilar y funciona como un contraelectrodo. Las partículas sólidas de lípidos se pueden formar evaporando el disolvente de las gotitas producidas por el campo eléctrico [42].

(e) Congelación por aspersión. “En el método de congelación por aspersión, los lípidos se calientan a una temperatura por encima de su punto de fusión” [6]. Los lípidos calientes se atomizan a través de una boquilla neumática en un recipiente, que se mantiene en un baño de hielo con dióxido de carbono. Las micropartículas que se obtienen (50-500 μm) luego se secan al vacío a temperatura ambiente [43].

2.3. Descripción general de la patente

En la Tabla 2 se muestra un resumen de las patentes tecnológicas más importantes que se refieren a los métodos de preparación antes mencionados, tanto para nanopartículas como para micropartículas de lípidos.

3. Rutas de administración

La administración dérmica es un área de gran potencial para las nanopartículas y micropartículas de lípidos, y su corto tiempo de comercialización lo hace especialmente prometedor para su uso en formulaciones cosméticas. Las distintas ventajas de la administración cutánea de partículas lipídicas son la capacidad de proteger los ingredientes químicamente lábiles contra la descomposición química, la capacidad de modular la liberación del fármaco y la capacidad de formar películas lipídicas adhesivas en la piel, lo que proporciona un posible efecto oclusivo [64]. .

Su tamaño de partícula y sus objetivos terapéuticos significan que las nanopartículas y micropartículas de lípidos se pueden utilizar para todas las aplicaciones parenterales: desde la administración intraarticular a la intramuscular, subcutánea e intravenosa [65]. Debido a su pequeño tamaño, las nanopartículas lipídicas pueden inyectarse por vía intravenosa y usarse para dirigir medicamentos a órganos específicos. Sin embargo, son eliminados de la circulación por el hígado y el bazo, como es el caso de todas las partículas coloidales inyectadas por vía intravenosa. Las nanopartículas lipídicas “sigilosas” que son capaces de evitar el sistema reticuloendotelial (RES) se pueden obtener recubriendo su superficie con polietilenglicol (PEG).

Las nanopartículas y micropartículas de lípidos se pueden administrar por vía oral en forma de dispersiones acuosas o, alternativamente, después de la transformación en una forma de dosificación sólida, como comprimidos, gránulos, cápsulas o polvos en sellos. Las dispersiones de partículas acuosas se pueden utilizar como fluido de granulación para la producción de comprimidos. Alternativamente, pueden transformarse en un polvo (por ejemplo, mediante secado por pulverización o liofilización) y agregarse a una mezcla de polvo para tabletas o usarse para llenar cápsulas de gelatina dura. Los costos de producción más bajos significan que el secado por aspersión puede ser el método preferido para transferir dispersiones de partículas de lípidos a polvos [1]. Si se administra por vía oral, las nanopartículas y micropartículas de lípidos pueden ayudar a la solubilización del fármaco en el tracto gastrointestinal (TGI). De hecho, pueden retener una sustancia poco soluble en un estado solubilizado y mejorar las interacciones soluto-disolvente, especialmente después de mezclarse con solubilizantes endógenos, como ácidos biliares o fosfolípidos. Además, su efecto protector, junto con sus propiedades de liberación sostenida y / o controlada, evita que los fármacos (macromoléculas en particular) sufran una degradación prematura y mejora su estabilidad en el TGI [66]. Además, las células M de los parches de Peyer pueden absorber partículas de tamaño nanométrico, lo que a su vez permite que el sistema portador evite el metabolismo del efecto de primer paso y se someta a una absorción linfática. La reducción de los efectos secundarios (es decir, la toxicidad estomacal de los antiinflamatorios no esteroideos (AINE)) y el enmascaramiento del gusto son también dos objetivos importantes para la administración oral de partículas lipídicas [67].

La aplicación pulmonar de micropartículas lipídicas también es prometedora, ya que muestran buenas propiedades de aerosolización y excelente estabilidad cuando se nebulizan como formulación líquida. Los SLM que se obtienen en forma sólida (es decir, mediante secado por atomización) son adecuados para este método de aplicación gracias a su tamaño aerodinámico. El diseño adecuado de las partículas lipídicas debe evitar que se depositen en las regiones bronquiales. De hecho, mientras que el aclaramiento bronquial rápido puede conducir a concentraciones de fármaco por debajo de los niveles terapéuticos, la retención de partículas lipídicas en los pulmones contribuye a una liberación prolongada del fármaco. Por tanto, se puede lograr una mayor biodisponibilidad del fármaco y efectos terapéuticos más prolongados, lo que da como resultado una dosificación reducida y unos intervalos de dosificación prolongados. Por tanto, las partículas lipídicas pueden ofrecer una amplia gama de beneficios en el tratamiento local de enfermedades graves de las vías respiratorias, así como para la administración sistémica de fármacos. Además, se ha demostrado en varios estudios que la administración pulmonar de matrices lipídicas presenta un bajo potencial toxicológico. Sin embargo, no se han realizado investigaciones sobre los efectos a largo plazo de la administración pulmonar repetida [68].

Las nanopartículas de lípidos pueden mejorar la eficacia terapéutica, el cumplimiento y la seguridad de los fármacos oculares, administrados a través de varias vías diferentes, tanto en los segmentos anterior como posterior del ojo. Son adecuados para la administración tópica debido a su capacidad para aumentar el tiempo de residencia corneal y así superar las barreras corneales. Además, a pesar de que la administración eficaz del fármaco en el segmento posterior del ojo es un desafío y que generalmente se requieren vías alternativas de administración (periocular e intravítrea), las formulaciones de nanopartículas lipídicas optimizadas para la retina deben tener como objetivo controlar la liberación del fármaco y reducir la frecuencia de administración [69 ].

3.1. Descripción general de la patente

Se han presentado varias patentes de uso sobre vías de administración específicas para partículas lipídicas: en la Tabla 3 se muestra un resumen.

4. Objetivos terapéuticos y / o tecnológicos

Se han propuesto nanopartículas y micropartículas de lípidos para la administración activa y de fármacos con varios objetivos terapéuticos y / o tecnológicos [4, 118, 119], los más relevantes se describen a continuación.

4.1. Terapia contra el cáncer

La justificación del uso de nanopartículas lipídicas para la administración de fármacos contra el cáncer se basa en varios mecanismos fisiológicos. Un tumor a menudo se asocia con una vascularización defectuosa y con fugas que resulta de una angiogénesis mal regulada. Por tanto, la materia particulada de tamaño submicrónico puede extravasarse preferentemente en el tumor y ser retenida allí, debido al llamado efecto de permeabilidad y retención mejoradas (EPR). La focalización pasiva de tumores basada en el efecto de EPR se puede lograr utilizando nanopartículas de lípidos diseñadas adecuadamente, que pueden evitar la opsonización por el complemento y la consiguiente eliminación por el RES. Las nanopartículas de lípidos de “circulación prolongada” están diseñadas para tener tamaños de partículas reducidos y superficies hidrófilas (están recubiertas con polímeros hidrófilos) por esta misma razón [120]. Además, las nanopartículas de lípidos diseñadas en la superficie se pueden usar para el direccionamiento activo para aumentar la citotoxicidad selectiva de células cancerosas. Esto se puede hacer aprovechando las diferencias en los antígenos de superficie y los receptores de las células cancerosas y sanas [96]. Por último, la resistencia a múltiples fármacos (MDR) es una limitación importante de la terapia con fármacos contra el cáncer. La MDR se asocia principalmente con la glicoproteína P (P-gp), que actúa como una bomba de salida de la célula para muchos fármacos (agentes anticancerosos, antibióticos, etc.). Las nanopartículas lipídicas pueden ayudar a superar el fenómeno MDR, probablemente porque transportan fármacos encapsulados a las células cancerosas mediante endocitosis, evitando así el mecanismo de salida del fármaco P-gp [120].

4.2. Superando la barrera hematoencefálica

Las nanopartículas de lípidos se han propuesto con frecuencia como vehículos que pueden superar la barrera hematoencefálica (BHE). La BBB actúa como una barrera física y regula el paso de moléculas seleccionadas entre el torrente sanguíneo y el cerebro. En particular, las estrechas uniones entre las células endoteliales significan que la difusión pasiva de solutos a través de la vía paracelular es muy limitada. Las nanopartículas lipídicas pueden ser útiles en el proceso de captación cerebral a varios niveles, ya que pueden (i) estabilizar fármacos contra la degradación química en fluidos biológicos, (ii) aumentar la permanencia en el torrente sanguíneo y así favorecer indirectamente la translocación al cerebro, y (iii) desencadenar directamente las células endoteliales, induciendo así la endocitosis, que también puede estar mediada por receptores a través de un mecanismo de direccionamiento activo. Aunque las nanopartículas de lípidos simples se han utilizado como vehículos para superar la BBB, la investigación está evolucionando actualmente hacia nanopartículas de lípidos dirigidas, que mejoran la selectividad de interacción entre las nanopartículas y las células endoteliales [121].

4.3. Terapia de genes

Las nanopartículas de lípidos se pueden utilizar con éxito como vectores no virales para la terapia génica. La terapia génica se logra mediante la introducción de material genético (ADN plasmídico, ADNp) en las células diana, para inducir la expresión de proteínas o, alternativamente, mediante el uso de oligonucleótidos antisentido (ASO) o ARN interferente pequeño (ARNip) como transcripción y / o traducción. inhibidores para silenciar genes defectuosos. Los ácidos nucleicos desnudos son fácilmente digeridos por enzimas en fluidos biológicos. Además, la internalización celular no ocurre espontáneamente porque tanto los ácidos nucleicos como las membranas celulares tienen superficies cargadas negativamente, lo que da como resultado respuestas terapéuticas no efectivas. Incluso si los vectores virales son los portadores más efectivos, los vectores no virales son más seguros, tienen costos más bajos, son más reproducibles y no presentan un límite de tamaño de ADN. El uso de nanopartículas lipídicas como vectores no virales en la terapia génica implica el uso de lípidos cargados positivamente que pueden unirse electrostáticamente a ácidos nucleicos. Esto es beneficioso para la transfección porque la condensación facilita la movilidad de los ácidos nucleicos, protegiéndolos de las enzimas ambientales, mientras que el carácter catiónico de los vectores permite la interacción con las superficies celulares cargadas negativamente [122].

4.4. Entrega de proteínas y péptidos

Las nanopartículas y micropartículas de lípidos se emplean ampliamente para el suministro de proteínas. El uso terapéutico de péptidos y proteínas está restringido por su alto peso molecular, carácter hidrófilo y estabilidad química limitada, lo que conduce a una baja biodisponibilidad, una mala transferencia a través de las membranas biológicas y una baja estabilidad en el torrente sanguíneo. La mayoría de los péptidos y proteínas disponibles se administran mediante inyección, pero su corta vida media significa que se requieren dosis repetidas, que son costosas, dolorosas y mal toleradas por los pacientes. En los últimos años se han realizado importantes esfuerzos hacia alternativas sin aguja a la administración de estas biomacromoléculas que utilizan principalmente, pero no exclusivamente, la vía oral. Sin embargo, también se han investigado las vías de administración bucal, nasal, pulmonar y transdérmica [98]. Las nanopartículas y micropartículas de lípidos pueden ser útiles en el suministro de péptidos y proteínas debido al efecto estabilizador y promotor de la absorción de los lípidos. Además, durante algún tiempo se han buscado vehículos en partículas como vehículos para antígenos proteicos. Se ha llevado a cabo un extenso trabajo en el área de la formulación de vacunas utilizando partículas lipídicas, ya que la mayoría de los antígenos peptídicos o proteicos son ineficaces para la inmunización de la mucosa debido a la degradación proteolítica en los sitios de la mucosa [123].

4.5. Entrega de antioxidantes y vitaminas

Las nanopartículas y micropartículas de lípidos tienen un gran potencial para proteger eficazmente los antioxidantes y las vitaminas contra la degradación (a menudo son sensibles a la luz y al oxígeno). Además, pueden mejorar la penetración cutánea. Por lo tanto, el uso de partículas lipídicas como sistemas de administración dérmica puede considerarse como una estrategia conveniente para mejorar la eficacia tópica de los antioxidantes. Algunos productos para el cuidado de la piel que contienen nanopartículas lipídicas cargadas con antioxidantes ya se han comercializado [124]. Además, los antioxidantes se caracterizan frecuentemente por una baja biodisponibilidad tras la administración oral. Su atrapamiento dentro de las nanopartículas lipídicas puede ayudar a aumentar la captación intestinal y así mejorar su farmacocinética [125].

4.6. Entrega de diagnósticos

Recientemente se han llevado a cabo importantes estudios preclínicos en el campo del diagnóstico utilizando nanopartículas lipídicas preparadas para la resonancia magnética (RM) con contraste positivo. Estos sistemas incluyen MnCl2, ácido dietilentriaminopentaacético de gadolinio (III) (Gd-DTPA) y el equivalente de manganeso (II) (Mn-DTPA). Los tintes del infrarrojo cercano (NiR) también se han conjugado con nanopartículas lipídicas, como Alexa Fluor ™ 488. Sin embargo, actualmente está ganando atención un nuevo concepto en la terapia del cáncer: la conjugación de agentes terapéuticos y herramientas de diagnóstico en la misma nanopartícula teranóstica multimodal [126 ].

4.7. Descripción general de la patente

La Tabla 4 proporciona un resumen de las patentes más importantes que se refieren al uso y la composición de nanopartículas y micropartículas de lípidos que se dedican a fines terapéuticos o tecnológicos específicos.

5. Preocupaciones del mercado

Las últimas décadas han visto un aumento gradual y significativo en el número de patentes registradas que se refieren a nanopartículas y micropartículas de lípidos. Por otro lado, cabe destacar que la mayoría de formulaciones que se han comercializado pertenecen al campo cosmético. Actualmente sólo se comercializan tres formulaciones orales a base de nanopartículas de lípidos, pero una de ellas tiene licencia como producto “nutracéutico” (Tabla 5). Sin embargo, aunque se puede estimar que hay más de 500 productos cosméticos que contienen NLC en todo el mundo, es difícil contarlos, ya que los NLC a menudo no figuran como productos NLC en la lista de la Nomenclatura Internacional de Ingredientes Cosméticos (INCI) [182].

Los esfuerzos de investigadores de todo el mundo están aumentando, como lo demuestra la cantidad de investigaciones publicadas en los últimos años. Este incremento se debe a las potenciales aplicaciones industriales de las nano y micropartículas lipídicas y al hecho de que pueden presumir de métodos de preparación sin disolventes y fácilmente ampliables, el uso de materiales biocompatibles, etc. Estos datos destacan una tendencia general en la patentando la actividad de partículas lipídicas en la década de 1990, la comunidad científica, especialmente en Europa, mostró un mayor interés en técnicas de preparación innovadoras para nanopartículas lipídicas, mientras que, desde el comienzo del nuevo milenio, la actividad patentadora se desplazó principalmente hacia aplicaciones de administración de medicamentos, y los investigadores de Los países emergentes se involucraron progresivamente más. También han surgido algunas pequeñas y medianas industrias (pymes) y empresas derivadas que dedican su actividad principal a las nanopartículas lipídicas: Italian Nanovector Srl, Russian Nanosystem Ltd., German PharmaSol GmbH, Spanish Lipotec SA, Indian Transgene Biotek Ltd. y Korean AmorePacific Corp son algunos ejemplos [189, 190]. De hecho, las PYME pueden considerarse la principal fuerza impulsora de la innovación en este campo, incluso más que las grandes empresas [182].

Sin embargo, existe una gran brecha entre el número de artículos de literatura y patentes a pesar del creciente interés en los portadores de lípidos [189, 190]. Además, una evaluación del estado de las patentes existentes revela que solo unas pocas han alcanzado el estado otorgado, mientras que el resto todavía se clasifican como solicitudes. Esto es aún más evidente cuando comparamos las patentes registradas y los productos comercializados.

Hay una serie de razones por las que muchas obras patentadas en esta área permanecen en una etapa inicial y no se traducen en productos industriales. Las preocupaciones regulatorias pueden jugar un papel clave. Así, a pesar de la gran cantidad de investigaciones realizadas sobre el uso de nanopartículas lipídicas para la administración dérmica [191], los aspectos regulatorios significan que todos los productos comercializados para la administración dérmica tienen licencia como cosméticos (Tabla 5), ​​de hecho, los productos cosméticos son más fáciles de procesar. en términos de tiempo e inversión económica ya que no requieren evaluación clínica.

De hecho, el desarrollo exponencial de la nanotecnología en los últimos años ha suscitado no solo grandes esperanzas, sino también una serie de cuestiones de seguridad, éticas y, en consecuencia, normativas que pueden obstaculizar significativamente el proceso de comercialización [192]. Desde un punto de vista regulatorio, las nanopartículas lipídicas se someten a las preocupaciones regulatorias generales de los nanomateriales.

Armonizar la definición de nanomateriales, tal como la utilizan los investigadores, productores y reguladores, es una estricta necesidad. Según la Recomendación de la Comisión Europea sobre la definición de nanomaterial (2011/696 / EU), 100 nm es el límite superior de demarcación, ya que se refiere al tamaño alrededor del cual las propiedades de los materiales pueden cambiar significativamente de sus equivalentes convencionales. Los tamaños de las nanopartículas de lípidos tienden a exceder los 100 nm, pero las partículas que son mayores de 100 nm, en el rango de tamaño submicrónico, aún pueden ofrecer "propiedades nanorelacionadas" debido a una mayor energía superficial, a pesar de tener una menor capacidad para penetrar a través de las membranas y la piel. [193].

La clasificación puede depender de la disciplina científica y del impacto de los nanomateriales en el organismo humano, pero también de la exposición ambiental. En particular, el Reglamento europeo sobre productos cosméticos (CE n. 1223/2009) asocia el concepto de insolubilidad y persistencia de nanomateriales a límites dimensionales (100 nm) [194], mientras que la evaluación de la eficacia y / o seguridad de los nanomateriales en los medicamentos sigue siendo basado en una evaluación caso por caso debido a la complejidad de estos sistemas. La Agencia Europea de Medicamentos (EMA) publicó un documento de reflexión sobre los medicamentos de uso humano basados ​​en nanotecnología, en 2006, que también incluía una definición oficial de nanomedicina, con un tamaño de hasta aprox. 100 nm [195]. Sin embargo, los productos basados ​​en nanotecnología que se han investigado para aplicaciones farmacéuticas tienen rangos de tamaño más amplios que la definición propuesta, lo que induce a la EMA a incluir también todas las "estructuras" con tamaños de menos de 1000 nm que están diseñadas para tener propiedades específicas [196] y puede mejorar la administración de fármacos en sitios específicos y alterar significativamente los perfiles toxicológicos. Por lo tanto, las agencias reguladoras requieren que los fabricantes realicen estudios precisos de autorización previa para evaluar los perfiles de calidad, seguridad y eficacia de un nuevo medicamento [197, 198].

Por tanto, a pesar de que la comunidad científica y las empresas farmacéuticas privadas realizan un esfuerzo considerable para desarrollar nuevos productos farmacéuticos a nanoescala, la tasa de aprobación de nuevos productos de nanomedicina no ha superado el 10%, principalmente debido a fallos en el perfil de seguridad y eficacia durante los estudios preclínicos y clínicos [199]. Por tanto, otros nanosistemas, como las nanopartículas lipídicas, se vuelven cada vez más interesantes ya que ofrecen distintas ventajas: indudable biocompatibilidad de la matriz, métodos de preparación sin disolventes y, en algunos casos, sin necesidad de altas temperaturas. En particular, la presencia de solventes puede representar una deficiencia para un proceso industrial, ya que los solventes pueden afectar la estabilidad de los compuestos activos, su eliminación puede ser costosa y pueden inducir problemas toxicológicos (residuos) y ambientales.

Existe un cierto período de tiempo típico entre la invención de un sistema y su introducción al mercado. Desde la invención de los liposomas en 1965, tardaron unos 20 años en llegar al mercado cosmético (producto antienvejecimiento "Capture" lanzado por Dior en 1986) y 25 años para el primer producto farmacéutico (Alveofact por Dr. Karl Thomae GmbH Alemania) . En base a esto, y tomando 1992 como año de la invención de SLN, se podría haber esperado que los primeros productos farmacéuticos llegaran alrededor de 2016-2020. Sin embargo, hasta la fecha solo se han comercializado dos productos farmacéuticos basados ​​en nanopartículas lipídicas. Además, tras la crisis financiera de 2008, las empresas han reconsiderado sus políticas de inversión y desarrollo de productos y se han vuelto más conservadoras. Esto puede haber influido en las pruebas clínicas de los sistemas de nanopartículas de lípidos [182].

6. Conclusiones

La investigación sobre nanopartículas y micropartículas de lípidos se ha realizado durante casi 25 años. La actividad de patentamiento ha crecido y, al mismo tiempo, se ha disparado el uso de la nanotecnología como herramienta innovadora para tratar enfermedades, mientras que también ha aumentado el interés comercial potencial en materiales biocompatibles y técnicas de preparación sin disolventes. De hecho, las plantillas de microemulsión fueron la primera técnica que fue patentada por Gasco et al. en 1993, para la preparación de nanopartículas lipídicas. Desde entonces, se registraron un número creciente de patentes, hasta 2010. Se debe dar gran importancia a las patentes presentadas por Müller y Lucks en 1996. Son un hito en la investigación de nanopartículas lipídicas ya que adaptaron HPH, que es un bien establecido técnica industrial que se emplea actualmente para la preparación de nanoemulsión, para su uso en la producción de SLN, NLC y LDC. Desde entonces, se han presentado varias patentes tecnológicas sobre técnicas de preparación alternativas para superar las limitaciones de los métodos existentes.

Además, se ha presentado un número cada vez mayor de patentes de composición y uso, especialmente desde 2000. Esto probablemente se puede correlacionar con el descubrimiento de nuevos campos prácticos farmacológicos y tecnológicos en los que las tecnologías de nanopartículas lipídicas pueden utilizarse con éxito. De hecho, se ha presentado un número significativo de patentes de administración de fármacos por vía dérmica que demuestran una gama de ventajas que ofrecen estos sistemas de administración, incluida la estabilización química y el aumento de la penetración / permeación de fármacos en la piel. Este último aspecto se debe principalmente al efecto de oclusión de lípidos en la piel. Sin embargo, actualmente se está solicitando un número significativo de patentes de administración de fármacos por vía oral. Esto probablemente se deba a que la vía oral es la más extendida y aceptable para la terapia, y los medicamentos de clase IV del Sistema de Clasificación Biofarmacéutica (BCS) sufren varios problemas de biodisponibilidad. Además, algunos desafíos de administración de fármacos pueden considerarse oportunidades para las nanopartículas de lípidos.En primer lugar, se considera que las nanopartículas de lípidos son un medio interesante para superar la BHE debido a su composición de lípidos y su facilidad de funcionalización. En segundo lugar, una serie de mecanismos que están relacionados con el uso de nanopartículas lipídicas pueden beneficiar la terapia del cáncer. Algunos de los enfoques más interesantes en estos campos han sido objeto de patentes. Por último, un número considerable de patentes se han centrado en la administración de macromoléculas, los ácidos nucleicos y las proteínas son el futuro de la terapia farmacológica, y ambos presentan problemas comparables con la estabilidad, la escasa biodisponibilidad y el alto peso molecular, que dificultan su uso en las terapias actuales y también pueden ser un inconveniente tecnológico para la carga de nanopartículas y micropartículas de lípidos.

La mayoría de los productos a base de nanopartículas y micropartículas de lípidos comercializados están actualmente autorizados como cosméticos, mientras que el desarrollo de sistemas de administración de fármacos, especialmente para uso oral y parenteral, se encuentra todavía mayoritariamente, con algunas excepciones, en la etapa clínica o incluso preclínica. El principal obstáculo para llegar al mercado en el campo farmacológico parece ser el aspecto regulatorio: se requieren estudios clínicos costosos, y estos costos deben estar justificados por importantes resultados clínicos y ventajas sobre las formulaciones comerciales y alta reproducibilidad, así como la seguridad total de todos los materiales y formulaciones empleados. Si bien Europa y EE. UU. Son los países líderes en términos de solicitudes de patentes, vale la pena señalar que ha habido un aumento en la actividad de patentamiento de los países emergentes en los últimos años.

Conflictos de interés

Los autores declaran que no existen conflictos de intereses con respecto a la publicación de este artículo.

Expresiones de gratitud

Los autores desean agradecer al Ministerio de Educación, Universidad e Investigación de Italia (MIUR - beca Ricerca Locale 2017-2018) por la financiación.

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Derechos de autor

Copyright & # x00A9 2019 Luigi Battaglia y Elena Ugazio. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo la licencia de atribución de Creative Commons, que permite el uso, distribución y reproducción sin restricciones en cualquier medio, siempre que el trabajo original se cite correctamente.


Introducción

La exposición de las plantas a bajas temperaturas influye en la productividad, así como en la distribución geográfica, tanto de las plantas silvestres como de las cultivadas e induce cambios significativos en el metabolismo de las plantas (Alberdi y Corcuera 1991, Graham y Patterson 1982, Guy 1990). La respuesta de una planta al estrés por frío puede ser compleja y dependerá de si la temperatura se mantiene por encima o por debajo de 0 ° C, la duración de la exposición y si la planta es capaz o no de aclimatación al frío. En el caso de las plantas leñosas, la respuesta a las bajas temperaturas también se asocia con la respuesta al fotoperíodo corto. El proceso que se induce en las plantas en respuesta a temperaturas bajas sin congelación y que les permite aumentar su tolerancia a la congelación se denomina aclimatación al frío (Guy 1990, Thomashow 1998). Implica distintos cambios en la expresión génica, la expresión de proteínas y metabolitos (Prisa et al. 1995, Kaplan et al. 2004, Orvar et al. 2000, Öquist et al. 2001, Renaut et al. 2004, 2005, Thomashow et al. 2001). ).

Las tensiones ambientales que dan lugar a la deshidratación celular, como la congelación, la sal y el agua, a menudo conducen a cambios similares en la expresión y el metabolismo de los genes de las plantas (Cook et al.2004, Kaplan et al.2004, Kreps et al.2002, Rabbani et al. 2003, Seki et al. 2001), y existen interferencias en sus vías de señalización (Chinnusamy et al. 2004, Knight y Knight 2001). Se ha demostrado que estas condiciones deshidratantes pueden desencadenar ambas vías de respuesta comunes [p. Ej. Respuesta mediada por Ca 2+, cascadas de proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK) (Zhang y Klessig 2001), así como cascadas específicas de estrés (por ejemplo, ICE1, Chinnusamy et al. 2003, Fowler y Thomashow 2002, Sung et al. 2001) )]. El uso de enfoques genómicos, como microarrays y el análisis bioinformático de etiquetas de secuencia expresadas compiladas a partir de diferentes especies de plantas estresadas y no estresadas, así como diferentes tejidos dentro de la misma especie, han proporcionado una gran cantidad de información al revelar cambios globales en los genes. expresión y revelando la complejidad de la respuesta. Si bien se han identificado y utilizado genes inducibles a baja temperatura para mejorar la tolerancia a la congelación de las plantas mediante la transferencia de genes (Holmberg y Bulow 1998), el aumento de la tolerancia es a menudo muy modesto y puede resultar en rasgos fenotípicos deletéreos. Se ha reconocido que los mecanismos para afrontar el estrés a bajas temperaturas son complejos y multigénicos (Hughes y Dunn 1996, Thomashow 1998). Por lo tanto, para comprender mejor el proceso de tolerancia al frío y desarrollar estrategias para mejorar la resistencia, se encontró que los enfoques genómicos deben complementarse con análisis cualitativos y cuantitativos de la planta en varios niveles, incluidos el transcriptoma, el proteoma y el metaboloma.

A nivel del transcriptoma, existen técnicas poderosas como el análisis de microarrays que brindan una gran cantidad de información sobre qué genes están involucrados en la respuesta y adaptación al estrés ambiental. Sin embargo, estos resultados deben equilibrarse con el hecho de que la abundancia de ARNm y el nivel de proteína no están claramente correlacionados (Gygi et al. 1999), que los ARNm de bajo número de copias (potencialmente muy importantes para la regulación) no se miden tan fácilmente como los ARNm abundantes. y que los estudios de expresión génica no proporcionan información sobre la localización subcelular de los productos génicos o las modificaciones postraduccionales que se producen en una proteína que puede ser esencial para su función, transporte y activación (Rose et al. 2004). En respuesta al estrés por frío, se ha demostrado que un gran número de genes están sobreexpresados ​​o reprimidos (Chen et al.2002, Fowler y Thomashow 2002, Kreps et al.2002, Seki et al.2001, Shinozaki et al.2003, Sung et al. 2001, 2003).

A diferencia del perfil de transcripción, la metabolómica se puede utilizar para proporcionar un perfil global de una amplia gama de metabolitos (Cook et al. 2004, Gray y Heath 2005, Kaplan et al. 2004). Esta información es necesaria para comprender la biología de una célula o de un organismo, porque los niveles de varios metabolitos son el resultado neto de la actividad enzimática directa y de la regulación celular indirecta sobre los procesos transcripcionales o bioquímicos. La proteómica, el estudio de los cambios globales en las proteínas, proporciona un puente esencial entre el transcriptoma y el metaboloma. A través de estudios globales de cambios en proteínas en respuesta a bajas temperaturas y otras tensiones ambientales, se pueden identificar nuevas proteínas, interacciones proteína-proteína y modificaciones postraduccionales. La metabolómica, junto con la proteómica y la transcriptómica, y su integración en la biología del sistema, proporcionarán un análisis integral de la biología celular y el desarrollo de estrategias para alterar el metabolismo celular de manera dirigida y controlada.

El análisis de grandes porciones del proteoma en respuesta a tratamientos específicos ahora es posible mediante técnicas como la electroforesis bidimensional (2DE) o la cromatografía líquida junto con la espectrometría de masas en tándem (LC-MS / MS). Estas herramientas pueden proporcionar una evaluación más directa de los procesos bioquímicos al proporcionar información sobre las proteínas reales involucradas en las funciones enzimáticas, reguladoras y estructurales codificadas por genes y reguladas por factores de transcripción. Se sabe que diferentes familias de proteínas están asociadas con la respuesta de una planta al estrés por frío al ser sintetizadas nuevamente, acumulándose o disminuyendo. Entre otras cosas, estas proteínas están involucradas en la señalización, traducción, mecanismos de defensa del huésped, metabolismo de carbohidratos y metabolismo de aminoácidos. Estas proteínas incluyen deshidrinas y otras proteínas abundantes en embriogénesis tardía (LEA) (Close 1997, NDong et al. 2002, Welling et al. 2004, Wisniewski et al. 1999) y también proteínas anticongelantes (AFP) (Griffith y Yaish 2004). , proteínas de choque térmico [p. ej. proteína de choque térmico 70 (HSP70) Sung et al. 2001, Wisniewski et al. 1996] y otras proteínas reguladas por frío (COR) (Jaglo-Ottosen et al. 1998).

Aunque la viabilidad y la reproducibilidad de los geles bidimensionales han sido objeto de un gran debate, sigue siendo un método de uso común para separar proteínas de mezclas complejas. Esta revisión discutirá el potencial de usar técnicas electroforéticas bidimensionales seguidas de desorción / ionización láser asistida por matriz (MALDI) -tiempo de vuelo (TOF) o análisis MS-MS para realizar análisis proteómicos de plantas. También se discutirán las mejoras recientes de la técnica basada en gel mediante el uso de geles multiplexados con marcaje fluorescente, denominada electroforesis en gel de diferencia bidimensional (2D-DIGE). Entre sus múltiples ventajas, DIGE amplía el rango dinámico del análisis al detectar proteínas más poco abundantes sin saturar las altamente abundantes y proporciona resultados cuantitativos. Si bien también se encuentran disponibles técnicas sin gel para realizar análisis proteómicos, actualmente no se utilizan ampliamente en el campo de la biología vegetal. Esto se debe al hecho de que las técnicas sin gel requieren que esté disponible la secuencia de todo el genoma del organismo que se va a examinar. También se presentará una recopilación de los resultados proteómicos existentes relacionados con el estrés por frío en las plantas.


Materiales y métodos

Material vegetal y crecimiento

Fruto de la variedad cultivada (C) “Puya” Capsicum annuum var. annuum se obtuvo de Irapuato, Guanajuato, México (20.67 ° N, 101.35 ° W). Fruto del pimiento silvestre (W) “Chiltepín” Capsicum annuum var. glabriusculum fue recolectada de una población silvestre ubicada en El Patol, Querétaro, México (20.79 ° N, 99.87 ° W). Las semillas se extrajeron de frutos secos, se lavaron con una solución de lejía al 10% v / v, se escarificaron con HCl 0,05 N a 35 ° C durante 30 min y se enjuagaron con agua destilada antes de plantar en macetas de 0,5 l que contenían un contenido de 3: 1: 1 mezcla de turba, vermiculita.

Las plantas se cultivaron en invernadero en Irapuato, con temperatura controlada en el rango de 18-28 ° C, luz y humedad naturales. Las plantas se fertilizaron cada 2 semanas con fertilizante NPK estándar. Una vez que las plantas alcanzaron la madurez sexual, F1 Los híbridos se produjeron utilizando C como hembra y W como macho, como se describió anteriormente (Pickersgill 1971). Se dejaron flores adicionales para que se autofecundaran para generar cepas parentales de C y W.

Análisis de la morfología del fruto

A los 40 DAA, se recolectaron 20 frutos por planta de cada una de las plantas de 10 C × W, 5 C y 5 W, y se escanearon a 300 dpi utilizando un escáner de superficie plana estándar. Las imágenes se analizaron utilizando el paquete de software ImageJ (Rueden et al.2017) para extraer los siguientes descriptores de forma: área (A), eje menor (MiA), eje mayor (MaA), relación de aspecto (AR = MaA / MiA), redondez (Ro = 4 × [(A) / π (MaA) 2]) y circularidad (Ci = 4π [(AR) / (perímetro) 2]). Los datos morfométricos se transformaron en log10 o arsina y se sometieron a un análisis de componentes principales (PCA) para obtener las principales tendencias de variación (PC). Los rasgos individuales (área, relación de aspecto, circularidad, ejes mayor y menor) estaban altamente correlacionados con PC1 (figura suplementaria S1 A, Material complementario en línea), por lo que decidimos utilizar PC1 como un rasgo en sí mismo para describir la morfología parental e híbrida, y también porque las PC pueden capturar bien fenotipos complejos (Rosas et al. 2013). Las contribuciones individuales de área, eje mayor, eje menor (descriptores de tamaño), así como relación de aspecto y circularidad (descriptores de forma) al PC1 fueron 0,74, 0,52, 0,22, 0,30 y 0,13, respectivamente (figura suplementaria S1 A, Material complementario en línea). La distribución de los cinco rasgos principales se muestra individualmente para cada genotipo en la figura complementaria S1. B – F, Material complementario en línea. El conocimiento de la herencia del rasgo es un componente importante de los enfoques genéticos cuantitativos, ya que determina la respuesta del rasgo a la selección y la naturaleza de los cambios genéticos que impulsan la divergencia fenotípica. Nos interesaba la distribución continua de la herencia además de las categorías discretas, que consideramos subjetivas. Como lo vemos, una distribución proporciona una forma menos sesgada de explorar cómo las variantes alélicas de los padres silvestres y cultivados interactúan en el híbrido heterocigoto, o su modo de acción genética.También abre la posibilidad de distinguir bins o categorías de dominancia incompleta, que a menudo se ignoran en los estudios de herencia de la expresión génica. Para estimar el dominio, usamos una medida del grado de dominio (k = D/a), que estima la relación entre el efecto aditivo y dominancia. Nosotros usamos k para evaluar la acción genética asociada con la variación entre C y W y la expresión genética, medida como abundancia de transcripciones. El efecto aditivo (a) proporciona una medida del grado de cambio en el fenotipo que ocurre en el híbrido con la sustitución de un alelo salvaje por un alelo cultivado, o viceversa. El efecto de dominancia (D) mide cómo el fenotipo en el F1 híbrido se desvía de un punto medio de las dos clases homocigotas, en este caso cada uno de los padres. Estimamos el aditivo (a = (W − C) / 2) y dominante (D = C × W - [(W + C) / 2]) efectos y calcular el grado de dominancia (k = D/a) de todos los rasgos morfométricos. Tanto PCA como k las estimaciones se realizaron en R (v. 3.5.2, CRAN).

Extracción de ARN, preparación de bibliotecas y secuenciación

Se extrajo el ARN total de la placenta y el tejido del pericarpio de los frutos a los 40 DAA, para un solo fruto cosechado de cada uno de tres individuos para cada genotipo (C, W o C × W), para un total de nueve muestras. Antes de la recolección de tejido de placenta y pericarpio, los frutos se limpiaron rápidamente con etanol y se disecaron para eliminar las semillas. El ARN se extrajo usando TRIzol (Invitrogen) siguiendo las recomendaciones del fabricante, con las siguientes modificaciones: El reactivo TRIzol se incubó a 56 ° C antes de usarlo, se realizó una extracción adicional de cloroformo-alcohol isoamílico 24: 1 La precipitación del ARN se realizó usando un volumen de solución salina solución (citrato de sodio 0,8 M + cloruro de sodio 1,2 M) para un volumen de isopropanol se realizó un lavado adicional con etanol al 70%. La concentración de ARN total se cuantificó utilizando un espectrofotómetro NanoDrop 2000 (Thermo Scientific Nanodrop) y la integridad del ARN se evaluó mediante electroforesis en un gel de agarosa no desnaturalizante al 1,5%. Para la secuenciación, se prepararon bibliotecas de ADNc a partir de 3 μg de ARN total (RIN ≥ 5) utilizando el kit de preparación de bibliotecas de ARN TrueSeq de Illumina v3. Las nueve bibliotecas de ADNc resultantes se secuenciaron en un medio carril de la plataforma Illumina Hi-Seq 4000, produciendo aproximadamente 350.000.000 millones de lecturas de extremos emparejados de 2 x 101 pb.

Expresión diferencial entre padres y evaluación del modo de acción genética

Las lecturas de secuenciación se filtraron primero usando Trimmomatic v. 0.32 (Bolger et al. 2014) para eliminar adaptadores y descartar lecturas con una calidad por base & lt25 o una longitud total & lt70 pares de bases. Las lecturas recortadas se analizaron luego con el software FastQC (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ consultado por última vez el 20 de octubre de 2019) para verificar su calidad, distribución de longitud y la ausencia de adaptadores Illumina. Los perfiles de expresión de abundancia absoluta de transcripción total se generaron pseudoalineando las lecturas de secuenciación con un transcriptoma de referencia de ají (CM334 v.1.55) (Kim et al.2014) utilizando Kallisto ver 0.43.0 (Bray et al. 2016) en pares modo con los parámetros -b 100, -t 16 y –bias. Alrededor del 71 al 86% de las lecturas pertenecientes a las bibliotecas cultivadas se asignaron a una sola característica en el transcriptoma de referencia, mientras que el porcentaje de lecturas asignadas para la W y F1 las bibliotecas oscilaron entre 66% y 73% y 61%% a 73%, respectivamente (tabla complementaria S1, Material complementario en línea). Las transcripciones con una mediana por genotipo de recuentos de lecturas inferior a cinco se excluyeron para un análisis adicional. Las estimaciones de abundancia de transcripciones se utilizaron para probar la expresión diferencial (FDR 5%) utilizando el paquete DESeq2 R (Love et al.2014) que mide la expresión diferencial ajustando un modelo lineal generalizado (GLM) siguiendo una distribución binomial negativa y escalando el tamaño de la biblioteca. normalizando factores. Después de normalizar los recuentos de lectura, se generaron perfiles de expresión para 16938 modelos de genes, que comprenden el 48,5% del total de modelos de genes. Evaluamos la divergencia transcripcional entre transcriptomas cultivados y silvestres ajustando un GLM para leer los datos de recuento utilizando una prueba de razón de probabilidad (LRT) (FDR = 5%) a través de DESeq2. El índice de grado de dominancia (k) se empleó como proxy para investigar el modo de acción de los genes (aditivo, dominante-recesivo, transgresor) de cada transcripción. La abundancia de transcripción normalizada se redujo a un valor medio por genotipo y k se calculó por filas mediante un script R personalizado.

Generación de datos ASE

Para identificar y cuantificar las lecturas específicas de los padres en la F1 transcriptomas híbridos, se empleó un enfoque de pseudoreferencia. Brevemente, las lecturas de los dos conjuntos de bibliotecas parentales se asignaron al genoma de referencia CM334 v.1.55 (Kim et al. 2014) con STAR (Dobin et al. 2013). Los archivos BAM resultantes se usaron luego para llamar a SNP a través del kit de herramientas GATK (Poplin et al.2017) usando el modo Haplotype Caller con parámetros predeterminados. Los SNP con genotipo homocigoto para el alelo alternativo y una profundidad de lectura de al menos 4 × se conservaron y se utilizaron para producir una pseudoreferencia para cada padre mediante la función FastaAlternateReferenceMaker del kit de herramientas GATK. Las bibliotecas C × W se mapearon de forma independiente a cada una de las dos pseudorreferencias a través de STAR y luego se analizaron mediante GATK como se mencionó anteriormente. El mapeo de lectura de los tres F1 bibliotecas contra la pseudoreferencia cultivada (F1–C) recuperó 54,910, 39,401 y 59,493 SNP, respectivamente, mientras que la alineación contra las tres pseudoreferencias salvajes (F1–W) arrojó 34.237, 24.134 y 36.394 SNP. Estos conjuntos de SNP se fusionaron y solo se conservaron las posiciones compartidas entre los seis conjuntos de SNP, luego se asignaron a modelos de genes y se filtraron por la calidad de la alineación y la profundidad de cobertura (QUAL & gt30 DP & gt20). Para capturar sitios SNP con información inequívoca con respecto a la expresión específica de los padres, solo los SNP en posiciones bialélicas con genotipos heterocigotos y recíprocos entre F1–C y F1–Las alineaciones W (por ejemplo, A / G G / A) se mantuvieron (tabla complementaria S2, Material complementario en línea). Para crear los perfiles ASE, la profundidad de lectura de cada alelo se recuperó de los archivos VCF solo si los valores de la profundidad de lectura por alelo mostraban reciprocidad entre C × W – W y C × W – C. Finalmente, la profundidad de lectura por alelo se sumó sobre el mapeo de SNP en el mismo modelo de gen, lo que resultó en perfiles de ASE para 5077 transcripciones en tres réplicas.

Modelado Cis- y Trans-Divergencias regulatorias a través de GLM

A nivel transcripcional, la expresión génica se rige por interacciones entre cis- y trans-Elementos reguladores, por lo tanto, las mutaciones que afectan a cada uno de ellos oa ambos, impactan en la expresión de genes posteriores. El rol de cis- y trans-Las variaciones regulatorias en la abundancia de transcripciones Las diferencias entre las dos accesiones parentales se pueden inferir evaluando el desequilibrio alélico de dos alelos en un común. trans ambiente en un híbrido F1. En este escenario, las transcripciones con desequilibrio alélico sugieren que los vínculos cis-La variación de actuación es responsable de las diferencias de expresión entre los padres.

Usando el paquete DESeq2 R, modelamos ASE como la expresión diferencial entre los dos alelos en los transcriptomas C × W. Se ajustó un GLM y se ejecutó un LRT para probar dos modelos: reducido = ∼ 1 completo = ∼ alelo. Para probar trans-actuando variación, ajustamos un GLM para probar si al menos un alelo parental se expresaba diferencialmente entre el F0 y F1 generaciones. Probamos dos modelos con un LRT: reducido = ∼ alelo + generación completa = ∼ alelo + generación + alelo × generación. Luego, se escribió un script R personalizado para clasificar las transcripciones en siete categorías de divergencia regulatoria según McManus et al. (2010). De este conjunto, un total de 2.339 (69%) transcripciones analizadas mostraron expresión conservada tanto en F0 y F1 ya través de generaciones, mientras que 1.517 transcripciones se clasificaron como ambiguas porque los patrones de importancia observados no tienen una interpretación biológica a nivel transcripcional (McManus et al. 2010). Cis-sólo se definió como expresión diferencial significativa entre C y W en F0, evidencia de cis divergencia sin evidencia de trans efectos. Trans-sólo se definieron como expresión diferencial significativa entre C y W en F0, evidencia de trans sin evidencia de cis divergencia. Nos centramos en las transcripciones con expresión no conservada o no ambigua. Estimamos la contribución relativa de cis- y trans-Cambios regulatorios en la producción de diferencias de expresión en F0 agrupando genes de acuerdo con sus tamaños de efecto (| parentLog2FC (W / C) |), y calculando el cis porcentaje (|cis|/(|cis|+|trans|)).


Ver el vídeo: Extracción ADN por el Dr Alberto Jimenez (Julio 2022).


Comentarios:

  1. Scanlan

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  2. Ari

    Tu mente pytlivy :)

  3. Doune

    ¡Más fácil cuando se acelera!

  4. Yuli

    Tienes toda la razón. En esto, algo es y es una excelente idea. Lo guardo.

  5. Samumi

    Creo que este es un pensamiento maravilloso.



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