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Detectabilidad de SARS-COV-2 versus viabilidad

Detectabilidad de SARS-COV-2 versus viabilidad


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Esta semana (# 47 de 2020) se publicaron dos meta-revisiones en The Lancet.

Los valores de Ct y la infectividad del SARS-CoV-2 en superficies, una breve reseña publicada el 19 de noviembre en The Lancet Infectious Diseases, observó que las muestras de virus cultivables se correlacionan con valores de Ct de 29 · 3 (superficie de acero) o 29 · 5 (plástico superficie), mientras que los valores de Ct de 32 · 5 (superficie de acero) o 32 · 7 (superficie de plástico) se correlacionan con la detección de virus no cultivables.

Dinámica de carga viral del SARS-CoV-2, SARS-CoV y MERS-CoV, duración de la diseminación viral e infecciosidad: una revisión sistemática y un metanálisis, publicado el 19 de noviembre en The Lancet Microbe, promueve esta observación y concluye que por Estas métricas, las personas infectadas con SARS-CoV-2 no son infecciosas después del día 9.

¿Sugiere esto un límite superior de nueve días para virus viables en un ambiente estándar (22 ° C, 40-60% de HR) o las condiciones de la superficie pueden ser más hospitalarias que las células vivas?


Pruebas de diagnóstico y detección de SARS-CoV-2

La confirmación de casos respalda la vigilancia, el rastreo de contactos rápido y eficaz, la implementación de medidas de prevención y control de infecciones de acuerdo con las recomendaciones nacionales y contribuye a la atención adecuada del paciente.

Para obtener orientación sobre las estrategias de prueba, consulte la lista de documentos del ECDC más abajo en esta página.

Para obtener recomendaciones de la OMS, está disponible el documento de orientación Recomendaciones de estrategias de pruebas de laboratorio para COVID-19.


Recomendaciones de bioseguridad de laboratorio para SARS-CoV-2 y COVID-19

La pandemia actual de la enfermedad del coronavirus 2019 (COVID-2019) ha creado desafíos sin precedentes para las comunidades, los trabajadores de la salud y los profesionales de laboratorio que buscan controlar la propagación del SARS-CoV-2, el virus causante del COVID-2019. A pesar de la naturaleza relativamente novedosa del SARS-CoV-2, las guías provisionales de bioseguridad de laboratorio emitidas por los Centros de Control de Enfermedades (CDC) y la Organización Mundial de la Salud (OMS) brindan claridad sobre varios asuntos relacionados con el manejo seguro de muestras dentro de los laboratorios clínicos y de investigación. Siguiendo estas pautas recomendadas, los laboratorios pueden limitar en gran medida el riesgo para ellos mismos y para los demás.

Estas son las consideraciones clave de las pautas provisionales de los CDC y la OMS.

P: ¿Qué paso (s) debe seguir mi laboratorio antes de recibir muestras de COVID-19?

R: Los laboratorios que esperan recibir muestras de COVID-19 deben consultar primero con el Oficial de Bioseguridad de su sitio y rsquos o con el Oficial de Seguridad y Salud Ambiental responsable para recibir orientación antes de recibir cualquier muestra. Además, los CDC y la OMS recomiendan realizar evaluaciones de riesgo específicas del sitio y de la actividad que involucren áreas y procesos de / por un laboratorio que se verán afectados por muestras sospechosas y confirmadas de COVID-19. Aunque el SARS-CoV-2 es un virus nuevo, comparte similitudes con otros virus patógenos y, como tal, es posible que los laboratorios ya estén preparados para manejar muestras de COVID-19 sin modificaciones significativas en las instalaciones y procedimientos.

P: ¿Qué nivel de bioseguridad (BSL) se recomienda para los laboratorios que manipulan muestras sospechosas de COVID-19?

R: Los CDC recomiendan que los laboratorios clínicos que manipulen muestras de pacientes, como muestras respiratorias, sangre (y componentes de la sangre) y la práctica de la orina Precauciones estándar dentro de una instalación BSL-2. Además, el trabajo que involucre ARN genómico de longitud completa también debe llevarse a cabo en BSL-2.

Las actividades que impliquen altas concentraciones de virus vivo (por ejemplo, propagación o aislamiento) o grandes volúmenes de muestras infecciosas deben realizarse en un entorno BSL-3 como mínimo.

Aquellos que busquen una lista completa de requisitos para cada nivel de bioseguridad pueden hacer referencia a las definiciones en el recurso CDC & rsquos, disponible gratuitamente. Bioseguridad en Laboratorios Microbiológicos y Biomédicos (BMBL) 6a edición

P: ¿Qué tipo de recinto de contención de laboratorio se requiere para procesar muestras de COVID-19?

R: Los CDC y la OMS recomiendan actualmente que se utilicen cabinas de bioseguridad (BSC) de clase II en cualquier momento en que un procedimiento de laboratorio tenga el potencial de generar aerosoles o gotitas como resultado del vórtex, pipeteo, centrifugación u otras técnicas. Los BSC de Clase II son una opción ideal para manipular muestras de COVID-19 porque brindan 3 niveles de protección: protección del personal (el usuario), protección del producto (la muestra) y protección del medio ambiente (el laboratorio). Las muestras sospechosas de COVID-19 que se analizarán mediante rRT-PCR se beneficiarán adicionalmente del patrón de flujo de aire laminar filtrado ISO 5 HEPA generado dentro de los BSC de Clase II. Los BSC de Clase II, Tipo A2 o Tipo C1 son adecuados y no no tener un requisito de ventilación externa. La Clase II, Tipo B2, que debe tener ventilación externa por diseño, también son aceptables.

Nota: Cualquier BSC de Clase II que se utilice para manipular muestras de COVID-19 (o cualquier otro uso) debe ser probado y certificado por un profesional capacitado antes de su uso.

P: ¿Qué desinfectantes de laboratorio se recomiendan para su uso contra el SARS-CoV-2?

R: Actualmente, los CDC recomiendan utilizar desinfectantes reconocidos en la Lista N de la Agencia de Protección Ambiental y rsquos (EPA), de los cuales todos están aprobados para su uso contra el SARS-CoV-2. Muchos desinfectantes de la Lista N contienen peróxido de hidrógeno, alcohol, lejía o componentes de amonio cuaternario. Consulte con el fabricante del desinfectante si no está seguro de la idoneidad de un agente en particular contra el SARS-CoV-2.

P: ¿Qué recursos y guías de bioseguridad adicionales están disponibles para los laboratorios que manejan muestras del virus SARS-CoV-2 y COVID-19?

Labconco se ha comprometido con su seguridad en el laboratorio desde 1925. Si tiene alguna pregunta sobre la idoneidad de su BSC Clase II y rsquos para el manejo de muestras de COVID-19, comuníquese con nosotros.


El genoma del coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2) se expresa inicialmente como dos poliproteínas grandes. Su principal proteasa, M pro, es esencial para producir proteínas virales funcionales, lo que la convierte en un objetivo farmacológico clave. Günther et al. usó cristalografía de rayos X para detectar más de 5000 compuestos que son medicamentos aprobados o medicamentos en ensayos clínicos. La pantalla identificó 37 compuestos que se unen a M pro. Las estructuras de alta resolución mostraron que la mayoría de los compuestos se unen al sitio activo, pero también revelaron dos sitios alostéricos donde la unión de un fármaco provoca cambios conformacionales que afectan al sitio activo. En los ensayos basados ​​en células, siete compuestos tenían actividad antiviral sin toxicidad. El más potente, la calpeptina, se une covalentemente en el sitio activo, mientras que el segundo más potente, el pelitinib, se une en un sitio alostérico.

La enfermedad del coronavirus (COVID-19) causada por el SARS-CoV-2 está creando un tremendo sufrimiento humano. Hasta la fecha, no se dispone de ningún fármaco eficaz para tratar directamente la enfermedad. En la búsqueda de un fármaco contra COVID-19, hemos realizado un cribado cristalográfico de rayos X de alto rendimiento de dos bibliotecas de fármacos reutilizables contra la proteasa principal del SARS-CoV-2 (M pro), que es esencial para la replicación viral. A diferencia de los experimentos de detección de fragmentos de rayos X comúnmente aplicados con moléculas de baja complejidad, nuestra pantalla probó medicamentos y medicamentos ya aprobados en ensayos clínicos. A partir de las estructuras proteicas tridimensionales, identificamos 37 compuestos que se unen a M pro. En ensayos posteriores de reducción viral basados ​​en células, un peptidomimético y seis compuestos no peptídicos mostraron actividad antiviral en concentraciones no tóxicas. Identificamos dos sitios de unión alostéricos que representan objetivos atractivos para el desarrollo de fármacos contra el SARS-CoV-2.

La infección de las células del huésped por el SARS-CoV-2 se rige por la compleja interacción de factores moleculares tanto del huésped como del virus (1, 2). Los coronavirus son virus de ARN con un genoma de aproximadamente 30.000 nucleótidos. Los marcos de lectura abiertos virales se expresan como dos poliproteínas grandes superpuestas que deben separarse en subunidades funcionales para la actividad de replicación y transcripción (1). Esta escisión proteolítica se logra principalmente mediante la proteasa principal (M pro), también conocida como proteasa de tipo 3C 3CL pro o nsp5. M pro escinde la poliproteína viral pp1ab en 11 sitios distintos. El motivo de escisión del núcleo es Leu-Gln ↓ (Ser / Ala / Gly) (1). M pro posee un pliegue similar a quimotripsina adjunto con un dominio helicoidal C-terminal y alberga una díada catalítica compuesta por Cys 145 e His 41 en su sitio activo, que está formado por cuatro bolsas principales que están marcadas de acuerdo con su posición con respecto a la unión cortante del sustrato (Fig.1) (1). El sitio activo está ubicado en una hendidura entre los dos dominios N-terminales de la estructura de tres dominios del monómero, mientras que el dominio helicoidal C-terminal está involucrado en la regulación y dimerización de la enzima (Fig. 1A). Debido a su participación central en la replicación del virus, M pro es reconocido como un objetivo principal para el descubrimiento de medicamentos antivirales y las actividades de detección de compuestos con el objetivo de identificar y optimizar medicamentos que pueden abordar las infecciones por coronavirus (3). De hecho, varias publicaciones recientes confirman el potencial de dirigirse a M pro para inhibir la replicación del virus (1, 2, 4).

(A) Dibujo esquemático de la estructura del dímero M pro. El protómero A se muestra en blanco y el protómero B está en rojo. Para mayor claridad, los 29 compuestos de unión (barras amarillas) solo se representan en uno de los dos protómeros. Se destacan los residuos catalíticos His 41 (H41) y Cys 145 (C145), el sitio activo y dos sitios de unión al fármaco alostérico. (B) Vista de cerca del sitio activo con el sustrato peptídico unido (barras azules), modelado a partir de SARS-CoV M pro (PDB 2Q6G). La unión escindible se indica en amarillo y con la punta de flecha verde. Las bolsas de unión al sustrato S1ʹ, S1, S2 y S4 se indican mediante regiones coloreadas.

Para encontrar candidatos a fármacos contra el SARS-CoV-2, realizamos una pantalla cristalográfica de rayos X a gran escala de M pro contra dos bibliotecas de reutilización que contienen 5953 compuestos de Fraunhofer IME Repurposing Collection y la biblioteca Safe-in-man de Dompé Farmaceutici SpA (5).

En contraste con los experimentos de cribado de fragmentos cristalográficos, los compuestos en la reutilización de bibliotecas son químicamente más complejos (fig. S1A) (6, 7). Por lo tanto, estos compuestos probablemente se unan de manera más específica y con mayor afinidad (8). Debido a los pesos moleculares más altos, realizamos experimentos de cocristalización a un pH fisiológico de 7.5 en lugar de sumergir el compuesto en cristales nativos (9).

De los 5953 compuestos en nuestra pantalla, obtuvimos conjuntos de datos de difracción de rayos X para 2381 compuestos, que sometimos a un refinamiento de estructura automatizado seguido de un análisis de agrupamiento (10) y análisis de densidad del conjunto de datos de la bandeja (PanDDA) (11) (tabla S1). Observamos densidad de electrones adicional, que indica unión a M pro, para 43 compuestos, que se clasificaron como hits, que representan 37 compuestos distintos (tablas S1, S2 y S3). A partir de estos, el modo de unión podría determinarse sin ambigüedades para 29 moléculas (Fig. 1A y tabla S4). La mayoría de los aciertos se encontraron en el sitio activo de la enzima. De los 16 aglutinantes de sitios activos, seis se unen covalentemente como tioéteres a Cys 145, un compuesto se une covalentemente como tiohemiacetal a Cys 145, uno está coordinado con zinc y ocho se unen de forma no covalente. Los 13 compuestos restantes se unen fuera del sitio activo en varios lugares (Fig. 1A).

De los 43 resultados de nuestra pantalla de rayos X, 37 compuestos estaban disponibles en las cantidades necesarias para probar su actividad antiviral contra el SARS-CoV-2 en ensayos celulares (tabla S2). Nueve compuestos que redujeron la replicación del ARN viral (ARNv) en al menos dos órdenes de magnitud en las células Vero E6 (fig. S2) fueron evaluados adicionalmente para determinar las concentraciones efectivas que redujeron no solo ARNv sino también partículas infecciosas de SARS-CoV-2 en 50 % (CE50) (Figura 2). Además, se incluyeron AT7519 e ifenprodil, que mostraron una reducción del nivel de ARNv ligeramente menor, debido a sus distintos sitios de unión fuera del sitio activo. De estos 11, siete compuestos (AT7519, calpeptina, ifenprodil, MUT056399, pelitinib, tolperisona e isocianurato de triglicidilo) mostraron una reducción ≥100 veces en las partículas infecciosas en combinación con un índice de selectividad [SI calculado como la concentración citotóxica del 50% ( CC50) dividido por la CE50] de & gt5 o sin citotoxicidad en el rango de concentración probado y se consideran antivíricos activos (tabla S5).

El rendimiento de ARNv (círculos sólidos), los títulos virales (círculos semisólidos) y la viabilidad celular (círculos vacíos) se determinaron mediante transcripción inversa: reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa, ensayos de inmunofoco y el método CCK-8, respectivamente. CE50 para la reducción del título viral se muestra. Los puntos de datos individuales representan medias ± DE de tres réplicas independientes en un experimento.

Aquí, nos centramos en una descripción más detallada de los 11 compuestos analizados en la pantalla secundaria, que se agrupan según sus diferentes sitios de unión. Los resultados restantes se describen en el texto complementario y en las figs. S3 a S5.

Tolperisona, 2- [β- (4-hidroxifenil) -etilaminometil] -tetralona (HEAT) e isofloxitepina se unen covalentemente al sitio activo. La tolperisona tiene actividad antiviral (EC50 = 19,17 μM) y no presenta citotoxicidad (CC50 & gt 100 μM) (Fig.2), mientras que HEAT (EC50 = 24,05 μM, CC50 = 55,42 μM) e isofloxitepina (EC50 = 4,8 μM, CC50 = 17 μM) muestran una citotoxicidad desfavorable. Para los tres compuestos, solo se observan productos de degradación en el sitio activo. Tolperisona y HEAT son β-aminocetonas, pero solo observamos la parte del fármaco que contiene la cetona (2,4′-dimetilpropiofenona y 2-metil-1-tetralona), mientras que falta la parte restante con el grupo amina. El producto de degradación se une como aceptor de Michael al tiol de Cys 145, confirmado independientemente para CALOR mediante espectrometría de masas (figura S6 y tabla S6). La descomposición de tolperisona y HEAT se detectó tanto en la cristalización como en las condiciones de cultivo celular (fig. S7) y se informa que depende del pH (12). Los compuestos originales pueden considerarse profármacos (13, 14). En las estructuras de rayos X, los sistemas de anillos aromáticos de tolperisona (Fig. 3A) y HEAT (Fig. 3B) sobresalen en el bolsillo S1 y forman contactos de van der Waals con la columna vertebral de Phe 140 y Leu 141 y la cadena lateral de Glu. 166. Además, el grupo ceto acepta un enlace de hidrógeno de la cadena lateral imidazol de His 163. La tolperisona se utiliza como relajante del músculo esquelético (15). La estructura de rayos X sugiere que la isofloxitepina se une de manera similar como un fragmento a Cys 145 (Fig. 3C).

Los compuestos unidos se representan como barras de colores, y la superficie de M pro se muestra en gris con los residuos interactivos seleccionados que se muestran como barras. Las bolsas de unión al sustrato están coloreadas como en la Fig. 1. Los enlaces de hidrógeno están representados por líneas discontinuas. (A) Tolperisona. (B) CALOR. (C) Isofloxitepina. (D) Isocianurato de triglicidilo. (mi) Calpeptina. (F) MUT056399.

El isocianurato de triglicidilo tiene actividad antiviral (EC50 = 30,02 μM, CC50 & gt 100 μM) y adopta modos de unión covalentes y no covalentes al sitio activo. En ambos modos, el anillo central del compuesto se encuentra en la parte superior de la díada catalítica (His 41, Cys 145), y sus tres sustituyentes epoxipropilo llegan a los subsitios S1 ', S1 y S2. El modo de unión no covalente se estabiliza mediante enlaces de hidrógeno a la cadena principal de Gly 143 y Gln 166 y a la cadena lateral de His 163. En la forma unida covalentemente, un anillo de oxirano se abre mediante el ataque nucleofílico de Cys 145, formando un tioéter (Fig. 3D). Se ha probado el isocianurato de triglicidilo como agente antitumoral (16).

Calpeptina muestra la actividad antiviral más alta en la pantalla (EC50 = 72 nM, CC50 & gt 100 µM). Se une covalentemente a través de su grupo aldehído a Cys 145, formando un tiohemiacetal. Este inhibidor peptidomimético ocupa las bolsas de sustrato S1 a S3, similar a los inhibidores peptidomiméticos GC-376 (17, 18), inhibidores de la calpaína (19), N3 (2) y la α-cetoamida 13b (1). El esqueleto peptidomimético forma enlaces de hidrógeno con la cadena principal de His 164 y Glu 166, mientras que la cadena lateral de norleucina mantiene los contactos de van der Waals con el esqueleto de Phe 140, Leu 141 y Asn 142 (figura 3E). La calpeptina tiene actividad conocida contra el SARS-CoV-2 M pro en ensayos enzimáticos (17). La estructura es muy similar a la leupeptina, un inhibidor de proteasa común (fig. S3A), que sirvió como control positivo en nuestra pantalla de rayos X, pero no se probó más en ensayos antivirales.. Los experimentos de acoplamiento in silico también sugirieron la calpeptina como una posible molécula de unión a M pro (tabla S7). La calpeptina también inhibe la catepsina L (20), y se sugiere la doble focalización de la catepsina L y M pro como una ruta atractiva para la inhibición del SARS-CoV-2 (19).

MUT056399 se une de forma no covalente al sitio activo (EC50 = 38,24 μM, CC50 & gt 100 µM). El núcleo de difenil éter de MUT056399 bloquea el acceso al sitio catalítico, que consta de Cys 145 e His 41. El grupo carboxamida terminal ocupa el bolsillo S1 y forma enlaces de hidrógeno a la cadena lateral de His 163 y la columna vertebral de Phe 140 (Fig. 3F). El grupo etil fenilo de la molécula penetra profundamente en el bolsillo S2, que se agranda por un desplazamiento de la cadena lateral de Met 49 fuera del bolsillo de unión del sustrato. MUT056399 fue desarrollado como un agente antibacteriano contra multirresistente Staphylococcus aureus cepas21).

El maleato de quipazina mostró una actividad antiviral moderada (EC50 = 31,64 μM, CC50 & gt 100 µM). En la estructura de rayos X, solo se observa el contraión de maleato unido covalentemente como un tioéter (texto complementario y fig. S3B). Se observa maleato en estructuras de otros seis compuestos que no muestran actividad antiviral. Por tanto, es probable que la actividad antiviral observada sea causada por un efecto de quipazina fuera del objetivo.

En general, la actividad enzimática de M pro se basa en la arquitectura del sitio activo, que depende fundamentalmente de la dimerización de la enzima y la orientación relativa correcta de los subdominios. Esto podría permitir que los ligandos que se unen fuera del sitio activo afecten la actividad. De hecho, identificamos dos de estos sitios de unión alostéricos de M pro .

Cinco compuestos de nuestra pantalla de rayos X se unen en un bolsillo hidrofóbico en el dominio de dimerización C-terminal (Fig. 4, A y B), ubicado cerca del orificio de oxianión en el bolsillo S1 del sitio de unión del sustrato. Uno de estos mostró una fuerte actividad antiviral (Fig. 2). Otro compuesto se une entre los dominios catalítico y de dimerización de M pro.

(A) Vista de cerca del sitio de unión en el dominio de dimerización (protómero A, representación de dibujos animados gris), cerca del sitio activo del segundo protómero (protómero B, representación de superficie) en el dímero nativo. Se indican los residuos que forman la bolsa hidrófoba. Pelitinib (verde oscuro) se une a la hélice α C-terminal en Ser 301 y empuja contra Asn 142 y el giro β del bolsillo S1 del protómero B (residuos marcados con un asterisco). El recuadro muestra el cambio conformacional de Gln 256 (barras grises) en comparación con la estructura de M pro apo (barras blancas). (B) RS-102895 (violeta), ifenprodil (cian), PD-168568 (naranja) y tofogliflozin (azul) ocupan el mismo bolsillo de unión que el pelitinib. (C) AT7519 ocupa una hendidura profunda entre el dominio catalítico y de dimerización de M pro. (D) Cambios de conformación en la estructura de M pro unida a AT7519 (gris) en comparación con los de la estructura de apo (blanco).

En el centro del primer sitio de unión alostérico se encuentra un bolsillo hidrofóbico formado por Ile 213, Leu 253, Gln 256, Val 297 y Cys 300 dentro del dominio de dimerización C-terminal (Fig. 4A). Pelitinib, ifenprodil, RS-102895, PD-168568 y tofogliflozin explotan este sitio insertando una fracción aromática en este bolsillo.

Pelitinib muestra la segunda actividad antiviral más alta en nuestra pantalla (EC50 = 1,25 μM, CC50 = 13,96 µM). Su anillo de benceno halogenado se une al surco hidrofóbico en el dominio helicoidal, que se vuelve accesible por el movimiento de la cadena lateral Gln 256 (Fig. 4A). El resto central de 3-cianoquinolina interactúa con el extremo de la hélice C-terminal (Ser 301). El sustituyente de éter etílico empuja contra Tyr 118 y Asn 142 (del bucle 141-144 del bolsillo S1) del protómero opuesto dentro del dímero nativo. La integridad de este bolsillo es crucial para la actividad enzimática (22). Pelitinib es un aceptor de Michael catalizado por amina (23) y se desarrolló como un agente anticanceroso para unirse a una cisteína en el sitio activo del inhibidor del receptor del factor de crecimiento epidérmico de tirosina quinasa (24). Sin embargo, desde su posición de unión observada, es imposible que llegue al sitio activo, y no se encuentra evidencia de unión covalente a Cys 145 en los mapas de densidad de electrones.

Ifenprodil y RS-102895 se unen al mismo bolsillo hidrofóbico en el dominio de dimerización que el pelitinib (Fig. 4B, Fig. S4, A y B y texto complementario). Sólo ifenprodil (EC50 = 46,86 μM, CC50 & gt 100 µM) muestra una actividad moderada. RS-102895 (EC50 = 19,8 μM, CC50 = 54,98 μM) interactúa, similar al pelitinib, con el segundo protómero formando dos enlaces de hidrógeno a las cadenas lateral y principal de Asn 142, mientras que los otros compuestos exhiben una interacción más débil o nula con el segundo protómero. PD-168568 y tofogliflozin se unen al mismo sitio pero están inactivos (Fig. 4B y Fig. S4, C y D).

El segundo sitio alostérico está formado por el surco profundo entre los dominios catalíticos y el dominio de dimerización. AT7519 es el único compuesto en nuestra pantalla que identificamos unido a este sitio (Fig. 4C). Aunque solo tiene una actividad moderada, lo discutimos aquí porque este sitio puede ser un objetivo. El anillo de benceno clorado participa en varias interacciones de van der Waals con el bucle 107-110, Val 202 y Thr 292. El pirazol central tiene contactos de van der Waals con Ile 249 y Phe 294, y su grupo carbonilo adyacente forma un enlace de hidrógeno con la cadena lateral de Gln 110. La piperidina terminal se encuentra encima de Asn 151 y forma enlaces de hidrógeno con el carboxilato de Asp 153. Esto da como resultado un desplazamiento del bucle 153-155, estrechando ligeramente la ranura de unión. El átomo de Cα de Tyr 154 se mueve 2.8 Å, acompañado por un cambio conformacional de Asp 153 (Fig. 4D). Esto permite la unión de hidrógeno al compuesto y la formación de un puente salino a Arg 298. Arg 298 es crucial para la dimerización (25). La mutación Arg 298 Ala provoca una reorientación del dominio de dimerización en relación con el dominio catalítico, lo que conduce a cambios en el orificio de oxianión y la desestabilización del bolsillo S1 por el extremo N terminal. AT7519 se evaluó para el tratamiento de cánceres humanos (26). El potencial de inhibición alostérica de M pro a través de la modulación de Arg 298 se ha demostrado de forma independiente mediante espectrometría de masas (27).

Nuestra pantalla de rayos X reveló 43 compuestos que se unen a M pro, con siete compuestos que muestran actividad antiviral contra el SARS-CoV-2. Presentamos evidencia estructural de la interacción de estos compuestos en los sitios activos y alostéricos de M pro, aunque no podemos excluir que los efectos fuera del objetivo jugaron un papel en el efecto antiviral en el cultivo celular, en particular para compuestos con un índice de selectividad bajo. Por el contrario, la ausencia de actividad antiviral de los compuestos que se unen claramente a M pro en el cristal podría deberse a la rápida metabolización en el entorno celular. La calpeptina y el pelitinib mostraron una fuerte actividad antiviral con baja citotoxicidad y son adecuados para la evaluación preclínica. En cualquier caso, todos los compuestos de impacto son estructuras líderes valiosas con potencial para un mayor desarrollo de fármacos, especialmente porque las bibliotecas de reutilización de fármacos ofrecen la ventaja de una bioactividad y permeabilidad celular probadas (28).

El compuesto más activo, calpeptina, se une en el sitio activo de forma similar a otros miembros de la gran clase de inhibidores basados ​​en péptidos que se unen como tiohemi-acetales o cetales a M pro (29). Además de este inhibidor peptidomimético, descubrimos varios inhibidores no peptídicos. Los compuestos que se unían al sitio activo de M pro contenían nuevos aceptores de Michael basados ​​en β-aminocetonas (tolperisona y HEAT). Estos compuestos conducen a la formación de tioéteres y no se han descrito como profármacos para proteasas virales. También identificamos un aglutinante no covalente, MUT056399, que bloqueaba el sitio activo. Además de esta inhibición común del sitio activo, identificamos compuestos que inhiben la enzima mediante la unión en dos sitios alostéricos de M pro.

El primer sitio alostérico (dominio de dimerización) está en la vecindad directa del bolsillo S1 del monómero adyacente dentro del dímero nativo. El pelitinib demuestra el potencial de inhibición antiviral a través de este sitio. La naturaleza hidrófoba de los residuos que forman la bolsa principal se conserva en todos los coronavirus humanos M pro (fig. S8). En consecuencia, los fármacos potenciales dirigidos a este sitio de unión pueden ser eficaces contra otros coronavirus. El potencial del segundo sitio alostérico como un objetivo farmacológico se demuestra por la actividad antiviral moderada observada de AT7519.


El interactoma revela la biología del SARS-CoV-2

Nuestro estudio destaca las interacciones entre las proteínas del SARS-CoV-2 y las proteínas humanas que están involucradas en varios complejos y procesos biológicos (Fig. 3). Estos incluyeron la replicación del ADN (NSP1), reguladores epigenéticos y de expresión génica (NSP5, NSP8, NSP13 y E), tráfico de vesículas (NSP2, NSP6, NSP7, NSP10, NSP13, NSP15, ORF3a, E, M y ORF8), modificación de lípidos (S), procesamiento y regulación de ARN (NSP8 y N), ubiquitina ligasas (ORF10), señalización (NSP7, NSP8, NSP13, N y ORF9b), maquinaria de transporte nuclear (NSP9, NSP15 y ORF6), citoesqueleto (NSP1 y NSP13) , mitocondrias (NSP4, NSP8 y ORF9c) y la matriz extracelular (NSP9).

332 interacciones de alta confianza entre 26 proteínas del SARS-CoV-2 (diamantes rojos) y proteínas humanas (círculos blancos del fármaco: complejos proteicos naranjas: proteínas amarillas en el mismo proceso biológico: azul). Color del borde proporcional al grosor del borde de la puntuación MiST proporcional a los recuentos espectrales. Las interacciones físicas entre las proteínas del huésped (líneas negras delgadas) se seleccionaron de CORUM, IntAct y Reactome. Se puede encontrar un mapa interactivo de interacción proteína-proteína en kroganlab.ucsf.edu/network-maps. ECM, matriz extracelular ER, retículo endoplásmico snRNP, ribonucleoproteína nuclear pequeña. norte = 3 muestras biológicamente independientes.

Aproximadamente el 40% de las proteínas que interactúan con el SARS-CoV-2 se asociaron con compartimentos de endomembrana o vías de tráfico de vesículas. Las interacciones del huésped con NSP8 (partícula de reconocimiento de señales (SRP)), ORF8 (control de calidad de la proteína en el retículo endoplásmico), M (morfología del retículo endoplásmico) y NSP13 (organización del centrosoma y Golgi) pueden facilitar la marcada reconfiguración del retículo endoplásmico y el tráfico de Golgi durante la infección por coronavirus, y las interacciones en los compartimentos periféricos con NSP2 (WASH), NSP6 y M (ATPasa vacuolar), NSP7 (proteínas Rab), NSP10 (AP2), E (AP3) y ORF3a (HOPS) también pueden modificar la endomembrana compartimentos para favorecer la replicación del coronavirus. NSP6 y ORF9c interactúan con los receptores Sigma que han sido implicados en la remodelación de lípidos y la respuesta al estrés del retículo endoplásmico. Estas proteínas interactúan con muchos fármacos humanos (ver "Actividad antiviral de compuestos dirigidos al huésped").

El tráfico hacia el retículo endoplásmico y las mitocondrias también puede verse afectado por la proteasa principal del SARS-CoV-2, NSP5. Identificamos una interacción de alta confianza entre NSP5 de tipo salvaje y el regulador epigenético histona desacetilasa 2 (HDAC2), y predijimos un sitio de escisión entre el dominio HDAC y la secuencia de localización nuclear de HDAC2 (Datos extendidos Fig. 6a-d), lo que sugiere que NSP5 puede inhibir el transporte de HDAC2 al núcleo y potencialmente podría afectar la capacidad de HDAC2 para mediar la inflamación y la respuesta al interferón 22,23. También identificamos una interacción entre NSP5 (C145A) catalíticamente muerta y tRNA metiltransferasa 1 (TRMT1), que es responsable de la modificación de la base de dimetilguanosina (m2,2G) en tRNA tanto nucleares como mitocondriales 24. Predecimos que TRMT1 también es escindido por NSP5 (Datos extendidos Fig. 6a-d), lo que lleva a la eliminación de su dedo de zinc y la señal de localización nuclear y probablemente resulta en una localización exclusivamente mitocondrial de TRMT1.


Los compuestos químicos en los alimentos pueden inhibir una enzima clave del SARS-CoV-2

Los compuestos químicos de las uvas muscadine inhiben eficazmente una importante proteasa del SARS-CoV-2. Crédito: De-Yu Xie, Universidad Estatal de Carolina del Norte

Los compuestos químicos en alimentos o bebidas como el té verde, las uvas muscadine y el chocolate amargo pueden unirse y bloquear la función de una enzima particular, o proteasa, en el virus SARS-CoV-2, según un nuevo estudio realizado por biólogos de plantas de Carolina del Norte. Universidad Estatal.

Las proteasas son importantes para la salud y la viabilidad de las células y los virus, dice De-Yu Xie, profesor de biología vegetal y microbiana en NC State y autor correspondiente del estudio. Si se inhiben las proteasas, las células no pueden realizar muchas funciones importantes, como la replicación, por ejemplo.

"Uno de los enfoques de nuestro laboratorio es encontrar nutracéuticos en alimentos o plantas medicinales que inhiban la forma en que un virus se adhiere a las células humanas o la propagación de un virus en las células humanas", dijo Xie.

En el estudio, los investigadores de NC State realizaron simulaciones por computadora y estudios de laboratorio que muestran cómo la llamada 'proteasa principal' (Mpro) en el virus SARS-CoV-2 reaccionaba cuando se enfrentaba a una serie de diferentes compuestos químicos vegetales ya conocidos por sus potentes propiedades antiinflamatorias y antioxidantes.

"Se requiere Mpro en SARS-CoV-2 para que el virus se replique y se ensamble", dijo Xie. "Si podemos inhibir o desactivar esta proteasa, el virus morirá".

Las simulaciones por computadora mostraron que los compuestos químicos estudiados del té verde, dos variedades de uvas muscadine, cacao en polvo y chocolate amargo pudieron unirse a diferentes porciones de Mpro.

"Mpro tiene una porción que es como un 'bolsillo' que fue 'llenado' por los compuestos químicos", dijo Xie. "Cuando se llenó este bolsillo, la proteasa perdió su función importante".

Experimentos de laboratorio in vitro completados por Yue Zhu, un Ph.D. del estado de Carolina del Norte. estudiante en el laboratorio de Xie, mostró resultados similares. Los compuestos químicos en el té verde y las uvas muscadine tuvieron mucho éxito en inhibir la función de Mpro. Los compuestos químicos en el cacao en polvo y el chocolate amargo redujeron la actividad de Mpro aproximadamente a la mitad.

"El té verde tiene cinco compuestos químicos probados que se unen a diferentes sitios en el bolsillo de Mpro, esencialmente abrumado para inhibir su función", dijo Xie. "Las uvas Muscadine contienen estos químicos inhibidores en sus pieles y semillas. Las plantas usan estos compuestos para protegerse, por lo que no es sorprendente que las hojas y pieles de las plantas contengan estos compuestos beneficiosos".


Conclusiones

Proteger a los trabajadores y a otras personas del COVID-19 presenta desafíos sustanciales, en parte porque tenemos más para aprender sobre cómo se propaga esta enfermedad y la mejor manera de prevenirla. Esperamos que este blog (y los comentarios publicados) inspiren nuevas ideas y nuevos proyectos para estudiar estas y otras cuestiones relacionadas. Los datos para ayudar a abordar estas preguntas serán fundamentales durante la pandemia actual; estos datos también pueden ser aplicables a otros agentes infecciosos a los que ya nos enfrentamos y a los nuevos agentes que inevitablemente enfrentaremos en el futuro.

William G. Lindsley, PhD, NIOSH Health Effects Laboratory Division

Francoise M. Blachere, MSc, NIOSH Health Effects Laboratory Division

Nancy C. Burton, PhD, MPH, CIH, NIOSH Division of Field Studies & Engineering

Brian Christensen, MPH, Amentum Services

Cherie F. Estill, PhD, NIOSH Division of Field Studies & Engineering

Edward M. Fisher, MS, NIOSH National Personal Protective Technology Laboratory

Stephen B. Martin, PhD, PE, NIOSH Respiratory Health Division

Kenneth R. Mead, PhD, PE, NIOSH Division of Field Studies & Engineering

John D. Noti, PhD, NIOSH Health Effects Laboratory Division

Melissa Seaton, MS, CIH, NIOSH Division of Science Integration

The Centers for Disease Control and Prevention is addressing questions related to the Coronavirus Disease 2019 through CDC-INFO and on their webpage. Please visit https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/index.html. You can find the most up-to-date information on the outbreak and get the latest answers to frequently asked questions. If you have specific inquiries, please contact CDC-INFO at https://wwwn.cdc.gov/dcs/contactus/form or by calling 800-232-4636.


Introducción

Figure 1. Custom RNA extraction protocol recovers viral RNA with high efficiency. (A) Schematic representation showing our bead-based extraction protocol in low-volume and high-volume versions. (B) High-efficiency viral RNA recovery from PBS and saliva using custom protocol. PBS or saliva (30 μL for low volume or 300 μL for high volume) were spiked with 10 000 copies of synthetic SARS-CoV-2 RNA. Our custom RNA extraction protocol was performed, and extracted RNA was compared to the input amount using RT-qPCR. (C) Recovery of RNA is calculated as the RNA level of extracted SARS-CoV-2 RNA relative to the spike-in amount. (D) Direct comparison of custom protocol with commercial kit using the same input and elution volumes. RNA was extracted from 200 μL of saliva with 50 particles/μL of heat-inactivated virus and eluted into 50 μL using either our custom protocol or the MagMAX kit and quantified by RT-qPCR. (E) Comparison of extraction and extraction-free methods. For all methods, saliva spiked with 50 viral particles/μL was used, and the same volume of inactivated saliva or eluted RNA was compared by RT-qPCR. For comparison of RNA extraction methods, maximum input volumes (400 μL for MagMAX vs 300 μL for custom) and minimal elution volumes (50 μL for MagMAX vs 10 μL for custom) were used. Relative RNA levels (log scale) represent each condition relative to spike-in aliquot on the same RT-qPCR plate. Fold-differences relative to custom protocol are indicated above each condition For the saliva control (no-inactivation), 8/12 replicates had no detectable levels of RNA and were not plotted. Four replicates were repeated across three different days for each condition (different colors represent different days). Error bars for all figures indicate the standard deviation.


Nanosponges could intercept coronavirus infection

Nanoparticles cloaked in human lung cell membranes and human immune cell membranes can attract and neutralize the SARS-CoV-2 virus in cell culture, causing the virus to lose its ability to hijack host cells and reproduce.

The first data describing this new direction for fighting COVID-19 were published on June 17 in the journal Nano letras. The "nanosponges" were developed by engineers at the University of California San Diego and tested by researchers at Boston University.

The UC San Diego researchers call their nano-scale particles "nanosponges" because they soak up harmful pathogens and toxins.

In lab experiments, both the lung cell and immune cell types of nanosponges caused the SARS-CoV-2 virus to lose nearly 90% of its "viral infectivity" in a dose-dependent manner. Viral infectivity is a measure of the ability of the virus to enter the host cell and exploit its resources to replicate and produce additional infectious viral particles.

Instead of targeting the virus itself, these nanosponges are designed to protect the healthy cells the virus invades.

"Traditionally, drug developers for infectious diseases dive deep on the details of the pathogen in order to find druggable targets. Our approach is different. We only need to know what the target cells are. And then we aim to protect the targets by creating biomimetic decoys," said Liangfang Zhang, a nanoengineering professor at the UC San Diego Jacobs School of Engineering.

His lab first created this biomimetic nanosponge platform more than a decade ago and has been developing it for a wide range of applications ever since. When the novel coronavirus appeared, the idea of using the nanosponge platform to fight it came to Zhang "almost immediately," he said.

In addition to the encouraging data on neutralizing the virus in cell culture, the researchers note that nanosponges cloaked with fragments of the outer membranes of macrophages could have an added benefit: soaking up inflammatory cytokine proteins, which are implicated in some of the most dangerous aspects of COVID-19 and are driven by immune response to the infection.

Making and testing COVID-19 nanosponges

Each COVID-19 nanosponge -- a thousand times smaller than the width of a human hair -- consists of a polymer core coated in cell membranes extracted from either lung epithelial type II cells or macrophage cells. The membranes cover the sponges with all the same protein receptors as the cells they impersonate -- and this inherently includes whatever receptors SARS-CoV-2 uses to enter cells in the body.

The researchers prepared several different concentrations of nanosponges in solution to test against the novel coronavirus. To test the ability of the nanosponges to block SARS-CoV-2 infectivity, the UC San Diego researchers turned to a team at Boston University's National Emerging Infectious Diseases Laboratories (NEIDL) to perform independent tests. In this BSL-4 lab -- the highest biosafety level for a research facility -- the researchers, led by Anthony Griffiths, associate professor of microbiology at Boston University School of Medicine, tested the ability of various concentrations of each nanosponge type to reduce the infectivity of live SARS-CoV-2 virus -- the same strains that are being tested in other COVID-19 therapeutic and vaccine research.

At a concentration of 5 milligrams per milliliter, the lung cell membrane-cloaked sponges inhibited 93% of the viral infectivity of SARS-CoV-2. The macrophage-cloaked sponges inhibited 88% of the viral infectivity of SARS-CoV-2. Viral infectivity is a measure of the ability of the virus to enter the host cell and exploit its resources to replicate and produce additional infectious viral particles.

"From the perspective of an immunologist and virologist, the nanosponge platform was immediately appealing as a potential antiviral because of its ability to work against viruses of any kind. This means that as opposed to a drug or antibody that might very specifically block SARS-CoV-2 infection or replication, these cell membrane nanosponges might function in a more holistic manner in treating a broad spectrum of viral infectious diseases. I was optimistically skeptical initially that it would work, and then thrilled once I saw the results and it sunk in what this could mean for therapeutic development as a whole," said Anna Honko, a co-first author on the paper and a Research Associate Professor, Microbiology at Boston University's National Emerging Infectious Diseases Laboratories (NEIDL).

In the next few months, the UC San Diego researchers and collaborators will evaluate the nanosponges' efficacy in animal models. The UC San Diego team has already shown short-term safety in the respiratory tracts and lungs of mice. If and when these COVID-19 nanosponges will be tested in humans depends on a variety of factors, but the researchers are moving as fast as possible.

"Another interesting aspect of our approach is that even as SARS-CoV-2 mutates, as long as the virus can still invade the cells we are mimicking, our nanosponge approach should still work. I'm not sure this can be said for some of the vaccines and therapeutics that are currently being developed," said Zhang.

The researchers also expect these nanosponges would work against any new coronavirus or even other respiratory viruses, including whatever virus might trigger the next respiratory pandemic.

Mimicking lung epithelial cells and immune cells

Since the novel coronavirus often infects lung epithelial cells as the first step in COVID-19 infection, Zhang and his colleagues reasoned that it would make sense to cloak a nanoparticle in fragments of the outer membranes of lung epithelial cells to see if the virus could be tricked into latching on it instead of a lung cell.

Macrophages, which are white blood cells that play a major role in inflammation, also are very active in the lung during the course of a COVID-19 illness, so Zhang and colleagues created a second sponge cloaked in macrophage membrane.

The research team plans to study whether the macrophage sponges also have the ability to quiet cytokine storms in COVID-19 patients.

"We will see if the macrophage nanosponges can neutralize the excessive amount of these cytokines as well as neutralize the virus," said Zhang.

Using macrophage cell fragments as cloaks builds on years of work to develop therapies for sepsis using macrophage nanosponges.

In a paper published in 2017 in procedimientos de la Academia Nacional de Ciencias, Zhang and a team of researchers at UC San Diego showed that macrophage nanosponges can safely neutralize both endotoxins and pro-inflammatory cytokines in the bloodstream of mice. A San Diego biotechnology company co-founded by Zhang called Cellics Therapeutics is working to translate this macrophage nanosponge work into the clinic.

A potential COVID-19 therapeutic The COVID-19 nanosponge platform has significant testing ahead of it before scientists know whether it would be a safe and effective therapy against the virus in humans, Zhang cautioned. But if the sponges reach the clinical trial stage, there are multiple potential ways of delivering the therapy that include direct delivery into the lung for intubated patients, via an inhaler like for asthmatic patients, or intravenously, especially to treat the complication of cytokine storm.

A therapeutic dose of nanosponges might flood the lung with a trillion or more tiny nanosponges that could draw the virus away from healthy cells. Once the virus binds with a sponge, "it loses its viability and is not infective anymore, and will be taken up by our own immune cells and digested," said Zhang.

"I see potential for a preventive treatment, for a therapeutic that could be given early because once the nanosponges get in the lung, they can stay in the lung for some time," Zhang said. "If a virus comes, it could be blocked if there are nanosponges waiting for it."

Growing momentum for nanosponges

Zhang's lab at UC San Diego created the first membrane-cloaked nanoparticles over a decade ago. The first of these nanosponges were cloaked with fragments of red blood cell membranes. These nanosponges are being developed to treat bacterial pneumonia and have undergone all stages of pre-clinical testing by Cellics Therapeutics, the San Diego startup cofounded by Zhang. The company is currently in the process of submitting the investigational new drug (IND) application to the FDA for their lead candidate: red blood cell nanosponges for the treatment of methicillin-resistant staphylococcus aureus (MRSA) pneumonia. The company estimates the first patients in a clinical trial will be dosed next year.

The UC San Diego researchers have also shown that nanosponges can deliver drugs to a wound site sop up bacterial toxins that trigger sepsis and intercept HIV before it can infect human T cells.

The basic construction for each of these nanosponges is the same: a biodegradable, FDA-approved polymer core is coated in a specific type of cell membrane, so that it might be disguised as a red blood cell, or an immune T cell or a platelet cell. The cloaking keeps the immune system from spotting and attacking the particles as dangerous invaders.

"I think of the cell membrane fragments as the active ingredients. This is a different way of looking at drug development," said Zhang. "For COVID-19, I hope other teams come up with safe and effective therapies and vaccines as soon as possible. At the same time, we are working and planning as if the world is counting on us."


Chemical compounds in foods can inhibit a key SARS-CoV-2 enzyme, study finds

Chemical compounds in foods or beverages like green tea, muscadine grapes and dark chocolate can bind to and block the function of a particular enzyme, or protease, in the SARS-CoV-2 virus, according to a new study by plant biologists at North Carolina State University.

Proteases are important to the health and viability of cells and viruses, says De-Yu Xie, professor of plant and microbial biology at NC State and the corresponding author of the study. If proteases are inhibited, cells cannot perform many important functions -- like replication, for example.

"One of our lab's focuses is to find nutraceuticals in food or medicinal plants that inhibit either how a virus attaches to human cells or the propagation of a virus in human cells," Xie said.

In the study, the NC State researchers performed both computer simulations and lab studies showing how the so-called "main protease" (M pro ) in the SARS-CoV-2 virus reacted when confronted with a number of different plant chemical compounds already known for their potent anti-inflammatory and antioxidant properties.

"M pro in SARS-CoV-2 is required for the virus to replicate and assemble itself," Xie said. "If we can inhibit or deactivate this protease, the virus will die."

Computer simulations showed that the studied chemical compounds from green tea, two varieties of muscadine grapes, cacao powder and dark chocolate were able to bind to different portions of M pro .

"M pro has a portion that is like a 'pocket' that was 'filled' by the chemical compounds," Xie said. "When this pocket was filled, the protease lost its important function."

In vitro lab experiments completed by Yue Zhu, an NC State Ph.D. student in Xie's lab, showed similar results. The chemical compounds in green tea and muscadine grapes were very successful at inhibiting M pro 's function chemical compounds in cacao powder and dark chocolate reduced M pro activity by about half.

"Green tea has five tested chemical compounds that bind to different sites in the pocket on M pro , essentially overwhelming it to inhibit its function," Xie said. "Muscadine grapes contain these inhibitory chemicals in their skins and seeds. Plants use these compounds to protect themselves, so it is not surprising that plant leaves and skins contain these beneficial compounds."


Ver el vídeo: Quantum Blue SARS CoV-2 RBD+ Antibody Rapid Test (Julio 2022).


Comentarios:

  1. Deutsch

    maravillosamente

  2. Arion

    el mensaje comprensible

  3. Nezahualcoyotl

    miró y se decepcionó ..........

  4. Hardwin

    Maravilloso, este es un mensaje divertido

  5. Iuitl

    Debes decir que te han engañado.

  6. Daniel

    ¡¡¡Bien!!! En lugar de un libro para la noche.



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