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¿Fue HindII la primera endonucleasa de restricción que se extrajo?

¿Fue HindII la primera endonucleasa de restricción que se extrajo?


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Guiado por wikipedia y pmc encontré este artículo de Hamilton O. Smith. y .Daniel Nathans.

Una enzima de restricción es un componente de un sistema de modificación de restricción de una especificidad dada dentro de un organismo. El sistema R-MT consta de dos componentes enzimáticos, una endonucleasa de restricción y una enzima de modificación que comparten una especificidad de reconocimiento similar (o idéntica). Nos gustaría proponer que la designación género-especie se utilice como un nombre de sistema R-M de acuerdo con las siguientes reglas.

(1) El nombre del género y la especie del organismo huésped se identifica mediante la primera letra del género y las dos primeras letras de la especie para formar una abreviatura de tres letras en cursiva. Por ejemplo: E. coli, Eco y H. influenzae, Hin.

(2) La identificación de la cepa o el tipo sigue la abreviatura de género-especie en símbolos que no están en cursiva, p. Ej. EcoB o EcoK. En los casos en los que el sistema R-M está genéticamente especificado por un virus o pla, se proporciona la abreviatura género-especie del huésped en cursiva y el símbolo del elemento extracromosómico sigue sin cursiva, p. Ej. EcoPl, EwRI, etc. En casos ocasionales en los que podría ser necesario especificar la cepa huésped así como el elemento extracromosómico, el símbolo de identificación de la cepa puede insertarse entre paréntesis, p. Ej. Eco (B) Pl.

(3) Cuando una cepa huésped particular tiene varios sistemas R-M diferentes, estos se identifican con números romanos, por lo tanto, los sistemas R-M de la cepa d de H. injluenzae serían HindI, HindII, HindIII, etc.

Pregunta principal:

Ahora HindII fue -

  1. extraído de HAemophilus enfluenzae
  2. la cepa fue la cepa Rd, por lo que D
  3. y fue el 2do enzima a aislar? Por tanto, II.

Entonces, ¿cómo es el primer RE Tipo II?

HO. Smith, K.W. Wilcox y T.J. Kelley, que trabajaba en la Universidad Johns Hopkins en 1968, aisló y caracterizó la primero nucleasa de restricción cuyo funcionamiento dependía de una secuencia de nucleótidos de ADN específica. (wiki)


La explicación aquí es bastante simple: HindI, a pesar de haber sido aislado / descubierto antes HindII, es un Tipo i Enzima de restricción, no de tipo II:

Una enzima de restricción de tipo I de Haemophilus influenzae, Hind I, que requiere adenosina 5'-trifosfato y 5-adenosil metionina, se estudió por su actividad en la transfección y transformación del ácido desoxirribonucleico (ADN) […] La mayoría de las enzimas de restricción de Haemophilus pertenecen a las enzimas de restricción de tipo II según el sistema de clasificación propuesto por Boyer. Estas enzimas requieren solo Mg2 + para su acción en contraste con las enzimas de tipo I que requieren Mg2 +, adenosina 5'-trifosfato (ATP) y S-adenosil metionina (SAM).

(Fuente: Propiedades biológicas de una enzima de restricción de Haemophilus influenzae, Hind I)

Así, de hecho, HindII fue el primero tipo II Enzima de restricción aislada / descubierta, ya que está bien documentada.


PD: Como beneficio adicional, aquí hay una tabla con las principales diferencias entre los tipos de ER I, II, III y IV (Fuente: Thermo Fisher Scientific):

Tipo i:

  • Proteína de múltiples subunidades con actividades de restricción y metilación
  • Requisito de ATP
  • Sitio de escisión a una distancia variable del sitio de reconocimiento

Tipo II:

  • Secuencia de reconocimiento específica
  • Sitio de escisión dentro o cerca de la secuencia de reconocimiento
  • Genera terminales 5 'fosfato e hidroxilo 3' en el sitio de escisión
  • Mg2+ requisito para la mayoría

Tipo III:

  • Secuencia de reconocimiento de dos partes en orientación inversa
  • Sitio de escisión a una distancia específica de una de las secuencias de reconocimiento
  • Requisito de ATP

Tipo IV:

  • Escisión de solo ADN metilado
  • Sitio de escisión aproximadamente a 30 pares de bases del sitio de reconocimiento

Explicar los métodos de obtención de ADN para experimentos de clonación molecular y el proceso de creación de una molécula de ADN recombinante.

  • El vector de clonación se trata con una endonucleasa de restricción para escindir el ADN en el sitio donde se insertará el ADN extraño.
  • El ADN para experimentos de clonación también se puede obtener a partir de ARN usando transcriptasa inversa (ADN complementario o clonación de ADNc), o en forma de ADN sintético (síntesis de genes artificiales).
  • La creación de ADN recombinante es, en muchos sentidos, el paso más simple del proceso de clonación molecular.

Biotecnología: principios y procesos Preguntas adicionales importantes Tipo de respuesta muy corta

Pregunta 1.
¿Qué es la ingeniería genética?
Respuesta:
Ingeniería genética. Es una técnica para modificar artificial y deliberadamente el ADN (genes) para satisfacer las necesidades humanas. También se denomina tecnología de ADN recombinante o empalme de ADN. Es una especie de biotecnología.

Pregunta 2.
Defina ADN recombinante.
Respuesta:
ADN recombinante. Son moléculas de ADN que se forman mediante métodos de recombinación genética.

Pregunta 3.
¿Cuál es el papel de la endonucleasa de restricción?
Respuesta:
Las endonucleasas de restricción son enzimas específicas que pueden escindir el ADN de doble hebra en el sitio específico.

Pregunta 4.
¿Qué son los BAC y los YAC? (CBSE 2016)
Respuesta:
Los BAC y YAC son cromosomas artificiales de bacterias y levaduras eficientes para la transferencia de genes. Son vectores.

Pregunta 5.
Nombre la bacteria del suelo que contiene el gen para la producción de endotoxinas.
Respuesta:
Agrobacterium tumefaciens.

Pregunta 6.
Nombra una técnica mediante la cual se puedan separar los fragmentos de ADN. (CBSE Delhi 2008)
Respuesta:
Electroforesis en gel.

Pregunta 7.
¿Cuál es el principio de la electroforesis en gel?
Respuesta:
Los fragmentos de ADN están cargados negativamente, por lo que se mueven al ánodo bajo un campo eléctrico a través de la matriz (generalmente agarosa). Este gel de matriz actúa como tamiz y los fragmentos de ADN se resuelven según su tamaño.

Pregunta 8.
Nombre el compuesto utilizado para teñir el ADN que se utilizará en tecnología recombinante. ¿Cuál es el color de ese ADN teñido?
Respuesta:
El compuesto utilizado para teñir el ADN es el bromuro de etidio. El ADN teñido se vuelve naranja.

Pregunta 9.
Nombra la técnica para la transferencia genética de vectores menos directa.
Respuesta:
Pistola de genes.

Pregunta 10.
¿Cuál es el papel de "Ori" en cualquier plásmido?
Respuesta:
El plásmido es ADN circular procariota que tiene una secuencia de nucleótidos desde donde comienza la replicación. A esto se le llama el origen de la replicación.

El papel de Ori es iniciar la replicación. Además, Ori controla el número de copias de ADN enlazado.

Pregunta 11.
Haz £ normal. coli tienen alguna resistencia genética a los antibióticos?
Respuesta:
No.

Pregunta 12.
¿Cuál es la función del TPA?
Respuesta:
El TPA (activador del plasminógeno tisular) disuelve los coágulos de sangre después de un ataque cardíaco y un derrame cerebral.

Pregunta 13.
Dé un ejemplo en el que la tecnología del ADN recombinante haya proporcionado una amplia gama de herramientas en el diagnóstico de enfermedades.
Respuesta:
Construcción de sondas, que son segmentos cortos de ADN monocatenario unidos a un marcador radiactivo o fluorescente.

Pregunta 14.
Dar la forma completa de PCR. ¿Quién lo desarrolló? (CBSE Delhi 2013)
Respuesta:
La PCR es una reacción en cadena de la polimerasa. Fue desarrollado por Kary Mullis en 1985.

Pregunta 15.
¿Cuál es la fuente de la ADN polimerasa, es decir, la polimerasa Taq? (CBSE fuera de Delhi 2013)
Respuesta:
La polimerasa Taq se aísla de la bacteria Thermus Aquaticus.

Pregunta 16.
Defina "fusión del ADN diana".
Respuesta:
El ADN diana que contiene la secuencia a amplificar se desnaturaliza por calor (alrededor de 94 ° C durante 15 segundos) para separar sus cadenas complementarias. Este proceso se denomina fusión del ADN diana.

Pregunta 17.
Expanda ELISA. Escribe una solicitud. (CBSE Delhi 2013)
Respuesta:
Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas ELISA. Importancia: se utiliza para el diagnóstico del SIDA.

Pregunta 18.
¿Qué son los animales transgénicos? Dé un ejemplo. (CBSE fuera de Delhi 2016)
Respuesta:
Animales transgénicos: Los animales obtenidos por ingeniería genética que contienen transgenes se conocen como animales transgénicos.
Ejemplo. Vaca transgénica 'Rosie'.

Pregunta 19.
¿Cuántos ciclos de PCR son adecuados para la amplificación adecuada del segmento de ADN?
Respuesta:
20-30 ciclos.

Pregunta 20.
Definir terapia génica.
Respuesta:
Terapia génica: es el reemplazo de un gen defectuoso por un gen funcional sano normal.

Pregunta 21.
¿Cuál es la importancia del banco de genes?
Respuesta:
Proporciona una reserva de la que se pueden obtener genes para mejorar las variedades o utilizarlos en ingeniería genética.

Pregunta 22.
¿Cuál puede ser la fuente de ADN termoestable?
Respuesta:
El ADN termoestable se obtiene de una bacteria Thermus Aquaticus.

Pregunta 23.
¿Qué son los marcadores seleccionables?
Respuesta:
Los genes que pueden seleccionar células transformadas de las células no recombinantes se denominan marcadores seleccionables.

Pregunta 24.
¿Por qué se usa la enzima celulasa para aislar material genético de células vegetales y no de células animales? (CBSE 2010)
Respuesta:
La celulasa se usa para romper la pared celular de las células vegetales, mientras que las células animales carecen de pared celular. La pared celular está hecha de celulosa que puede ser degradada por la celulasa.

Pregunta 25.
Dé un ejemplo de cada planta transgénica y animal transgénico.
Respuesta:

Pregunta 26.
¿Cuál sería la concentración molar de ADN humano en una célula humana?
Respuesta:
Los seres humanos tienen 3 M de ADN por célula, es decir, la concentración molar es 3.

Pregunta 27.
¿Las células eucariotas tienen endonucleasas de restricción?
Respuesta:
Sí, las células eucariotas poseen endonucleasas de restricción. Están involucrados en la edición (corrección de pruebas) y reparaciones del ADN durante la replicación del ADN.

Pregunta 28.
Nombra una técnica mediante la cual se puedan separar los fragmentos de ADN. (CBSE Delhi 2008)
Respuesta:
Hazte electroforesis.

Pregunta 29.
Las técnicas biotecnológicas pueden ayudar a diagnosticar el patógeno mucho antes de que aparezcan en el paciente los síntomas de la enfermedad. Sugiera dos de estas técnicas. (CBSE fuera de Delhi 2019)
Respuesta:
PCR y reacción en cadena de la polimerasa # 8211
ELISA & # 8211 Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas

Pregunta 30.
¿Por qué no es posible que un ADN extraño se convierta en parte de un cromosoma en cualquier parte de su longitud y se replique? (CBSE 2014)
Respuesta:
Para la multiplicación de cualquier ADN extraño, debe ser parte de un cromosoma que tenga una secuencia específica conocida como origen de replicación.

Pregunta 31.
Mencione el tipo de células huésped adecuadas para que las pistolas genéticas introduzcan un ADN extraño. (CBSE Delhi 2014)
Respuesta:
Células vegetales.

Pregunta 32.
Nombre las enzimas que se utilizan para el aislamiento de ADN de células bacterianas y fúngicas para la tecnología de ADNr. (CBSE 2014)
Respuesta:
Lisozima para células bacterianas y quitinasa para células fúngicas.

Pregunta 33.
¿Qué es EcoRI? ¿En qué se diferencia EcoRI de una exonucleasa? (CBSE fuera de Delhi 2015)
Respuesta:
EcoRI es una enzima de restricción de endonucleasa que corta ambos grupos de ADN palindrómico en una posición específica de la base nitrogenada 5 & # 8242 (GAATTC) 3 & # 8242 mientras que la exonucleasa elimina los nucleótidos de los terminales de las cadenas de ADN.

Biotecnología: principios y procesos Preguntas adicionales importantes Tipo de respuesta corta

Pregunta 1.
(i) Durante la clonación de vectores, cuál de los dos será el preferido por los biotecnólogos, bacteriófagos o plásmidos. Justifica con razón.
Respuesta:
Los biotecnólogos prefieren los bacteriófagos para la clonación a los plásmidos porque tienen un número muy alto de copias de su genoma dentro de las células bacterianas, mientras que algunos plásmidos pueden tener solo una o dos copias por célula y otros pueden tener de 15 a 100 copias por célula. Los vectores de fagos son más eficaces que los plásmidos para clonar grandes fragmentos de ADN.

(ii) Nombrar la primera vaca transgénica desarrollada e indicar la Mejora en la calidad del producto producido por ella. (Documento de muestra CBSE 2018-19)
Respuesta:
La vaca transgénica Rosie produjo leche enriquecida con proteínas humanas (2,4 gramos por litro).

Pregunta 2.
¿Cuáles son las dos técnicas centrales que permitieron el nacimiento de la biotecnología?
Respuesta:
Las dos técnicas centrales que permitieron el nacimiento de la biotecnología moderna son:

  1. Técnicas de ingeniería genética para alterar la química del material genético (ADN y ARN), para introducirlos en los organismos hospedadores y así cambiar el fenotipo del organismo hospedador.
  2. Mantenimiento de un ambiente estéril (libre de contaminación microbiana) en los procesos de ingeniería química para permitir el crecimiento de solo el microbio / célula eucariota deseada en grandes cantidades para la fabricación de productos biotecnológicos como antibióticos, vacunas, enzimas, etc.

Pregunta 3.
Haga una lista de herramientas de tecnología de ADN recombinante. (CBSE Delhi, 2011)
Respuesta:
Herramientas clave de la tecnología del ADN recombinante:

  1. Enzimas de restricción
  2. Enzimas polimerasas
  3. Ligasas
  4. Vectores
  5. Organismo huésped.

Pregunta 4.
¿Qué significa EcoRI? ¿Cómo se deriva su nombre?
Respuesta:
EcoRI significa el nombre de endonucleasa de restricción:

  1. La primera letra mayúscula del nombre que proviene del género Escherichia es "E".
  2. Las segundas dos letras minúsculas provienen de la especie Coli de células procariotas de las que están aisladas, es decir, "co".
  3. La letra R se deriva del nombre de la cepa, es decir, Escherichia coli Ry 13.
  4. El número romano indica el orden en el que se aislaron las enzimas de esa cepa de bacterias.

Pregunta 5.
¿Qué son las secuencias de reconocimiento o los sitios de reconocimiento?
Respuesta:
Los sitios reconocidos por las endonucleasas de restricción se denominan sitios de reconocimiento. Las secuencias de reconocimiento son diferentes y específicas para las diferentes endonucleasas de restricción. Estas secuencias son de naturaleza palindrómica.

Pregunta 6.
Definir vector. Dar las propiedades de un "buen vector".
Respuesta:
Un vector es una molécula de ADN que tiene la capacidad de replicarse en una célula huésped adecuada y en la que se integra el fragmento de ADN que se va a clonar para la clonación.

Un buen vector debe tener las siguientes propiedades:

  • Debe tener un origen de replicación para que pueda replicarse de forma autónoma.
  • Debería ser fácil de aislar y purificar.
  • Debería introducirse fácilmente en las células huésped.

Pregunta 7.
¿Cuál es la diferencia entre clonación y vectores de expresión?
Respuesta:
Todos los vectores que se utilizan para la propagación de inserciones de ADN en un huésped adecuado se denominan vectores de clonación. Cuando un vector se diseña para la expresión, es decir, la producción de la proteína especificada por el inserto de ADN, se denomina vector de expresión.

Pregunta 8.
¿Qué entiende por el término marcador seleccionable?
Respuesta:
Marcador seleccionable:

  1. Un marcador es un gen que ayuda a seleccionar las células huésped que contienen el vector (transformante) y a eliminar los no transformantes. Permite selectivamente el crecimiento de transformantes.
  2. Los marcadores seleccionables comunes para E. coli incluyen los genes que codifican la resistencia a antibióticos como la ampicilina. cloranfenicol tetraciclina y kanamicina o el gen de la (i-galactosidasa que puede identificarse mediante una reacción de color. La E. coli normal no tiene resistencia contra ninguno de estos anticuerpos.

Pregunta 9.
Explique el principio que ayuda a separar los fragmentos de ADN en la electroforesis en gel. (CBSE Delhi 2009 C)
Respuesta:
Obtener electroforesis es una técnica de moléculas como ADN / ARN / proteína en base a su tamaño bajo la influencia del campo eléctrico para que migren en la dirección del electrodo que porta la carga opuesta. Las moléculas cargadas positivamente se mueven hacia el cátodo (electrodo -ve) y viceversa. Estas moléculas se mueven a través de un medio o matriz y pueden separarse en función de su tamaño.

Pregunta 10.
Dar las aplicaciones de la tecnología PCR. (CBSE, Delhi 2013)
Respuesta:

  1. Amplificación de ADN y ARN.
  2. Determinación de la orientación y ubicación de los fragmentos de restricción entre sí.
  3. Detección de enfermedades genéticas como anemia falciforme, fenilcetonuria y distrofia muscular.

Pregunta 11.
¿Por qué se describe la “transformación genética mediada por Agrobacterium” en plantas como ingeniero genético natural de las plantas? (CBSE Delhi 2011)
Respuesta:
Agrobacterium tumefaciens es una bacteria fitopatógena que puede transferir parte de su ADN plasmídico porque infecta a las plantas hospedadoras. Agrobacterium produce agallas en la corona en la mayoría de las plantas dicotiledóneas. Estas bacterias contienen plásmidos inductores de tumores grandes (plásmidos Ti) que transmiten su gen causante de tumores al genoma de la planta huésped. Por lo tanto, la transferencia de genes ocurre en la naturaleza sin la participación humana, por lo que la transformación genética mediada por Agrobacterium se describe como ingeniería genética natural en plantas.

Pregunta 12.
Diferenciar la terapia génica y la clonación de genes.
Respuesta:
Diferencias entre la terapia génica y la clonación de genes:

Terapia de genes Clonación de genes
Es la sustitución y / o alteración de genes defectuosos responsables de enfermedades hereditarias por genes normales. Es la técnica de obtener copias idénticas de un segmento particular de ADN o de un gen.

Pregunta 13.
De lo que ha aprendido, ¿puede saber si las enzimas son más grandes o el ADN es más grande en tamaño molecular? ¿Como supiste?
Respuesta:
Las moléculas de ADN son de mayor tamaño en comparación con el tamaño molecular de las enzimas. Las enzimas son proteínas. La síntesis de proteínas se produce a partir de una pequeña porción de ADN denominada genes.

Pregunta 14.
¿Cómo funciona la endonucleasa de restricción? (CBSE Delhi 2013, 2014, Fuera de Delhi 2019)
O
¿Qué son las tijeras moleculares? Explique su papel. (CBSE 2009)
Respuesta:
Las enzimas endonucleasas de restricción se denominan tijeras moleculares que pueden cortar el ADN de doble hebra en sitios específicos.

Papel de la endonucleasa de restricción:

  • La endonucleasa de restricción inspecciona la longitud de la secuencia de ADN.
  • Encuentra una secuencia de reconocimiento específica, es decir, una secuencia de nucleótidos palindrómica en el ADN.
  • Estas enzimas cortan la hebra de ADN un poco lejos del centro de los sitios palindrómicos.
  • Por lo tanto, las endonucleasas de restricción dejan tramos colgantes llamados extremos pegajosos en cada hebra.

Pregunta 15.
¿Cómo y por qué se emplea la bacteria Thermus Aquaticus en la tecnología del ADN recombinante? Explicar. (CBSE Delhi 2009)
Respuesta:
La bacteria Thermus Aquaticus se emplea en la tecnología de ADN recombinante porque tiene ADN polimerasa termoestable (Taq. Polimerasa) que permanece activa durante la desnaturalización inducida por alta temperatura de un paso de PCR.

Esta enzima se emplea durante la amplificación de genes mediante PCR (reacción en cadena de la polimerasa). El fragmento amplificado se puede usar para ligar con un vector para clonación adicional.

Pregunta 16.
Nombra la fuente de la polimerasa Taq. Explique sus ventajas. (CBSE fuera de Delhi 2009)
Respuesta:
La polimerasa Taq se extrae de bacterias termoestables, concretamente Thermus Aquaticus. Permanece activo a una temperatura más alta y se utiliza para la desnaturalización del ADN durante la PCR.

Pregunta 17.
¿Qué son las proteínas recombinantes? ¿Cómo ayudan los biorreactores en su producción? (CBSE fuera de Delhi 2009, 2015)
Respuesta:
Proteínas recombinantes. Cuando cualquier gen que codifica una proteína se expresa en un huésped heterólogo, se denomina proteína recombinante. Los biorreactores ayudan en la producción de proteínas recombinantes a gran escala. Un biorreactor proporciona las condiciones óptimas para lograr la proteína recombinante deseada mediante métodos biológicos.

Pregunta 18.
¿Qué se entiende por clonación de genes?
Respuesta:
La formación de múltiples copias de un gen en particular se denomina clonación de genes. Un gen se separa y se liga a un plásmido similar a un vector. El plásmido recombinante se introduce en una bacteria libre de plásmido mediante transformación. Se hace que la bacteria transformada se multiplique y forme una colonia. Todas y cada una de las bacterias de la colonia tienen una copia del gen.

Pregunta 19.
Tanto el marcador del vino como un biólogo molecular que ha desarrollado una vacuna recombinante afirman ser biotecnólogos. ¿Quién en tu opinión tiene razón?
Respuesta:
Ambos son considerados biotecnólogos. El marcador de vino utiliza una cepa de levadura que produce vino por fermentación. El biólogo molecular usa un gen clonado para el antígeno. El antígeno se usa como vacuna. Esto permite la formación de antígenos en grandes cantidades. Ambos generan productos y servicios utilizando organismos vivos útiles para la humanidad.

Pregunta 20.
Ha creado una molécula de ADN recombinante ligando un gen a un vector plásmido. Por error, su amigo agrega una enzima exonucleasa al tubo que contiene el ADN recombinante. ¿Cómo se verá afectado su experimento si planea pasar a la transformación ahora?
Respuesta:
No es probable que el experimento se vea afectado, ya que la molécula de ADN recombinante es circular y cerrada, sin extremos libres. Por tanto, no será un sustrato para la enzima exonucleasa que elimina los nucleótidos de los extremos libres del ADN.

Pregunta 21.
Explique el trabajo realizado por Cohen y Boyer que contribuyó enormemente a la biotecnología. (CBSE2012)
Respuesta:
Trabajo de Cohen y Boyer:

  1. Descubrimiento de la endonucleasa de restricción, una enzima de E. coli que corta el ADN en la secuencia palindrómica.
  2. Preparación de ADN recombinante (Plásmido y ADN de interés).
  3. Su trabajo estableció la tecnología de ADN recombinante (ADNr), también llamada ingeniería genética.

Pregunta 22.
¿Cómo se forman los "extremos pegajosos" en una hebra de ADN? ¿Por qué se llaman estos? (CBSE Delhi 2014)
Respuesta:
1. Las enzimas de restricción cortan la hebra de ADN un poco lejos del centro del sitio palíndromo, pero entre las mismas dos bases en hebras opuestas. Como resultado, quedan porciones monocatenarias en cada extremo. Estos tramos de ADN que sobresalen se denominan "extremos pegajosos".

2. Los extremos pegajosos se denominan así porque forman enlaces de hidrógeno con sus contrapartes de corte complementario. La pegajosidad ayuda en la acción de la ADN ligasa.

Pregunta 23.
¿Cómo se mantiene un sistema de cultivo continuo en biorreactores y por qué? (CBSE Delhi 2019)
Respuesta:
Para mantener un sistema de cultivo continuo, el medio usado se drena por un lado del biorreactor y el medio fresco se agrega por un lado. Este tipo de método de cultivo produce una mayor biomasa que conduce a mayores rendimientos del producto deseado.

Pregunta 24.
La enzima galactosidasa se considera un marcador de mejor selección. Justifica la afirmación. (CBSE Delhi 2019)
Respuesta:
Las cepas recombinantes se pueden diferenciar de las no recombinantes fácilmente usando este marcador seleccionable. La selección se realiza en función del cambio de color. Todos se cultivan en una sustancia cromogénica. Los no recombinantes cambiarán de incoloros a azul mientras que en los recombinantes se produce la inactivación por inserción del gen de la galactosidasa.

Por tanto, los recombinantes no mostraron cambios de color. Este es un solo paso, un método fácil de selección.

Biotecnología: principios y procesos Preguntas adicionales importantes Tipo de respuesta larga

Pregunta 1.
¿Qué es la ingeniería genética? Explique brevemente los distintos pasos comunes a toda la tecnología de ingeniería genética.
O
Con la ayuda de diagramas se muestran los diferentes pasos en la formación de ADN recombinante mediante la acción de la endonucleasa de restricción. (CBSE 2011)
Respuesta:
Ingeniería genética: es una técnica para modificar artificial y deliberadamente el ADN (genes) para satisfacer las necesidades humanas. También se denomina tecnología de ADN recombinante o empalme de ADN.

Es una especie de biotecnología:

  1. Aislamiento de material genético que tiene el gen de interés.
  2. Corte del gen de interés del genoma y el vector con la misma enzima endonucleasa de restricción. Gen amplificador de interés (PCR).
  3. Ligar el gen de interés y el vector utilizando ADN ligasa formando ADNr.
  4. Transformación de rDNA en la célula huésped.
  5. Multiplicar la célula huésped para crear clones.


Diagrama que muestra varios pasos involucrados en la tecnología de ADN recombinante para la producción de una proteína recombinante.

Pregunta 2.
Enumere tres características importantes necesarias para preparar un organismo genéticamente modificador.
Respuesta:
Condiciones necesarias para la preparación:

  1. Identificación de ADN con genes deseables.
  2. Introducción del ADN identificado en el hospedador.
  3. Mantenimiento del ADN introducido en el huésped y transferencia del ADN a su progenie.

Pregunta 3.
¿Cómo se denominan las enzimas endonucleasas de restricción? Escribe ejemplos. (CBSE 2014
Respuesta:
El nombre de las enzimas de restricción es el siguiente:

  1. La primera letra del nombre proviene del género y las dos siguientes letras del nombre de la especie de la célula procariota de la que están aisladas.
  2. La siguiente letra proviene de la cepa del procariota.
  3. Los números romanos que siguen a estas cuatro letras indican el orden en el que se aislaron las enzimas de esa cepa de la bacteria.
  1. EcoR I se aísla de Escherichia coli RY 13.
  2. Hind II es de Haemophilus influenza.
  3. Bam H I es de Bacillus amylotiquefaciens.
  4. Sal I es de Streptomyces Albus
  5. Pst I es de Providencia stuartii.

Pregunta 4.
Explique cualquiera de los tres métodos de transferencia de genes sin vectores. (CBSE fuera de Delhi 2013)
Respuesta:
Vectores de transferencia genética. Los siguientes son métodos comunes de transferencia de genes de vectores.

  1. Microinyección: la microinyección es el proceso / técnica de introducir genes extraños en una célula huésped inyectando el ADN directamente en el núcleo mediante microagujas o micropipetas.
  2. Electroporación: La electroporación es el proceso mediante el cual se producen agujeros transitorios en la membrana plasmática de la célula (huésped) para facilitar la entrada de ADN extraño.
  3. Gene Gun: Gene Gun es la técnica de bombardear microproyectiles (partículas de oro o tungsteno) recubiertos con ADN extraño con gran velocidad hacia la célula objetivo.

Pregunta 5.
Escribe una nota sobre el vector de clonación.
Respuesta:
Vectores de clonación:

  1. Los plásmidos y bacteriófagos son los vectores más utilizados.
  2. Los vectores sintéticos / modificados genéticamente en la actualidad también se utilizan para unir fácilmente el ADN extraño y la selección de recombinantes de no recombinantes.
  3. Se requieren las siguientes características para facilitar la clonación en un vector:
    (a) Origen de la replicación (Ori)
    (b) Marcador seleccionable
    (c) Sitio de clonación (reconocimiento)
    (d) Tamaño pequeño del vector.

Pregunta 6.
¿Qué es PCR? Enumere los tres pasos principales. Muestre los pasos con un croquis esquemático.
Respuesta:

  1. PCR. Reacción en cadena de la polimerasa.
  2. Tres pasos de PCR.
    (a) Desnaturalización
    (b) Recocido de imprimación y
    (c) Extensión de cebadores.


Los tres pasos de la PCR

Pregunta 7.
Nombra los diversos vectores de clonación y explica cómo se puede utilizar un plásmido para la ingeniería genética.
Respuesta:
Vectores de clonación:

  • Plásmidos
  • Bacteriófagos
  • Vectores de plantas y animales
  • Saltar genes (transposones)
  • Cromosomas artificiales de bacterias, levaduras y mamíferos (BAC, YAC).

Uso de plásmido como material genético Los plásmidos se obtienen a partir de bacterias. Se tratan con una enzima endonucleasa de restricción para obtener los fragmentos del genoma deseado. Se les permite fusionarse con la ayuda de una enzima ADN ligasa. Los plásmidos recombinantes así formados se utilizan como material genético.

Pregunta 8.
Proporcione varios medios por los cuales se forma un huésped competente para la tecnología del ADN recombinante. ¿Por qué y cómo se puede hacer que las bacterias sean "competentes"? (CBSE Delhi 2013)
Respuesta:
Una célula huésped debe ser lo suficientemente competente como para tomar la molécula de ADN para la transformación, ya que se pueden usar los siguientes métodos.

  1. Uso de cationes divalentes: las bacterias se tratan con Ca 2+, etc. para que el ADN ingrese a la bacteria a través de los poros de su pared celular.
  2. Choque de calor: las células se pueden incubar en hielo y luego a 42 ° C para un choque de calor y luego se pueden volver a poner en hielo.
  3. Microinyección: el ADN recombinante se inyecta directamente en el núcleo de una célula animal.
  4. Biolístico. Las células bombardeadas con micropartículas de oro o tungsteno de alta velocidad recubiertas de ADN se conocen como pistolas genéticas.

Pregunta 9.
¿Cómo se transfiere el ADN recombinante al hospedador?
Respuesta:
Transferencia de ADN recombinante al hospedador:

  1. Las células bacterianas deben ser competentes para absorber ADN, esto se hace tratándolas con una concentración específica de calcio, que aumenta la eficiencia con la que el ADN ingresa a la célula a través de los poros de su pared celular.
  2. Luego, el ADN recombinante se puede forzar en dichas células incubando las células con ADN recombinante en hielo, luego colocándolas a 42 ° C y luego volviéndolas a poner en hielo (tratamiento de choque térmico).
  3. La microinyección es un método en el que el ADN recombinante se inyecta directamente en el núcleo de la célula animal con la ayuda de microagujas o micropipetas.
  4. La pistola genética o biolística es un método adecuado para células vegetales, donde las células son bombardeadas con micropartículas de oro o tungsteno de alta velocidad recubiertas de ADN.
  5. Los patógenos desarmados se utilizan como vectores cuando se les permite infectar la célula, transfieren el ADN recombinante al huésped.

Pregunta 10.
¿Por qué el ADN no puede atravesar la membrana celular? ¿Cómo se puede hacer que las bacterias sean competentes para absorber un plásmido? Explica un método para la introducción de ADN extraño en una célula hospedante de una planta. Nombre un patógeno que se utilice como vector desarmado. (CBSE fuera de Delhi 2019)
Respuesta:
El ADN es una molécula hidrófila, por lo que no puede atravesar la membrana celular.

Las células bacterianas se vuelven "competentes" tratándolas con una concentración específica de catión divalente como el calcio para absorber el plásmido. El catión divalente aumenta la eficiencia con la que el ADN ingresa a la bacteria a través de los poros de la pared celular.

Procedimiento: el ADN recombinante se introduce en las células huésped bacterianas "competentes" incubándolas en el hielo. Se sigue colocándolos brevemente a 42 ° C. Se denomina tratamiento de "stock térmico". De nuevo se vuelven a colocar en hielo. Este proceso permite que las bacterias absorban el ADN recombinante.

La pistola genética o el método biolístico se utiliza para la introducción de ADN extraño en una célula hospedante de una planta. Aquí, las células vegetales son bombardeadas con micropartículas de oro o tungsteno de alta velocidad recubiertas de ADN. Agrobacterium tumefaciens o Retrovirus pueden usarse como vector desarmado.

Pregunta 11.
Escriba una nota sobre los vectores utilizados durante la tecnología del ADN recombinante. (CBSE Delhi 2008)
Respuesta:
Se utiliza un vector o ADN de vehículo como vehículo para transferir ADN seleccionado a las células. Un plásmido con su pequeño ADN de una bacteria es una buena opción para la transferencia indirecta de genes porque puede moverse de una célula a otra y hacer varias copias de sí mismo. Sin embargo, los cromosomas artificiales de bacterias y levaduras llamados BAC y YAC, respectivamente, son más eficientes para las transferencias de genes eucariotas.

Cromosoma artificial de levadura y plásmido

Pregunta 12.
(i) Identifique las ilustraciones A y B en lo siguiente:
(a)
(B)
Respuesta:
A = 5 y # 8242 GAATTC 3 y # 8242
Puntos B para ORI (origen de la replicación).

(ii) Escriba el término dado a A y C y ¿por qué?
Respuesta:
A representa una secuencia palindrómica de nucleótidos. C-final pegajoso.

(iii) Amplíe PCR. Mencione su importancia en biotecnología. (CBSE Delhi 2011)
Respuesta:
PCR, reacción en cadena de la polimerasa. Ayuda en la amplificación de genes.

Pregunta 13.
Escriba el papel de los siguientes sitios en el vector de clonación pBR322:
(a) rop
Respuesta:
Papel de rop, ori y marcador seleccionable en el vector de clonación pBR322.

Papel de rop: el gen Rop regula el número de copias. El proceso Rop participa en la estabilización de la interacción entre el ARN I y el ARN II, lo que a su vez evita la replicación de pBR322.

(b) ori
Respuesta:
Origen de la replicación (Ori):

  • Es una secuencia específica de bases de ADN, que se encarga de iniciar la replicación.
  • Un ADN ajeno para la replicación debe estar vinculado al origen de la replicación.
  • Un ADN procariota tiene normalmente un solo origen de replicación, mientras que el ADN eucariota puede tener más de un origen de replicación.
  • La secuencia es responsable de controlar el número de copias del ADN enlazado.

(c) marcador seleccionable (CBSE Delhi 2019 C)
Respuesta:
Marcador seleccionable:

  • Un marcador es un gen que ayuda a seleccionar las células huésped que contienen el vector (transformante) y a eliminar los no transformantes.
  • Los marcadores seleccionables comunes para E. coli incluyen los genes que codifican la resistencia a antibióticos como la ampicilina. El cloranfenicol, la tetraciclina y la kanamicina o el gen de la B-galactosidasa pueden identificarse mediante una reacción de color.

Pregunta 14.
(i) Explique la importancia de la secuencia de nucleótidos palindrómica en la formación de ADN recombinante.
Respuesta:
Las secuencias palindrómicas, es decir, la secuencia de pares de bases, se leen igual en ambas cadenas de ADN cuando la orientación de la lectura se mantiene igual, p.
5 '- GAATTC - 3'
3 '- CTTAAG - 5'

Cada endonucleasa inspecciona toda la secuencia de ADN en busca de una secuencia de reconocimiento palindrómico.

(ii) Escriba el uso de endonucleasa de restricción en el proceso anterior. (CBSE 2017)
Respuesta:
Al encontrar el palíndromo, la endonucleasa se une al ADN. Corta las hebras opuestas de ADN, pero entre las mismas bases en ambas hebras y forma extremos pegajosos. Estos extremos pegajosos facilitan la acción de la enzima ADN ligasa y ayudan en la formación de ADN recombinante.

Pregunta 15.
Describir las funciones del calor, los cebadores y la bacteria Thermus Aquaticus en el proceso de PCR. (CBSE 2017)
Respuesta:
Papel del calor: el calor ayuda en el proceso de desnaturalización en la PCR. El ADN de doble hebra se calienta en este proceso a una temperatura muy alta (95 ° C) para que ambas hebras se separen.

Papel de los cebadores: los cebadores son pequeños oligonucleótidos sintetizados químicamente de aproximadamente 10-18 nucleótidos. Estos son complementarios a una región de ADN molde y ayudan en la extensión de la nueva cadena. Rote de Bacterium Thermus

Aquaticus: de esta bacteria se aísla una ADN polimerasa Taq termoestable, que puede tolerar altas temperaturas y forma una nueva hebra.

Pregunta 16.
¿Cómo ha ayudado el uso de Agrobacterium como vectores a controlar la infestación de Meloidogyne incognita en las plantas de tabaco? Explique en la secuencia correcta. (CBSE 2018, Fuera de Delhi 2019)
O
(a) Escriba el mecanismo que permite a Agrobacterium tumefaciens desarrollar tumores en la dicotiledónea huésped.
(b) Indique cómo se han modificado Agrobacterium tumefaciens y algunos retrovirus como vectores de clonación útiles. (CBSE Delhi 2019 C)
Respuesta:
(a) Clonación
(b) Un nematodo Meloidogyne incognita infecta las raíces de las plantas de tabaco y causa una gran reducción en el rendimiento.

Para prevenir esta infestación se adoptó una estrategia novedosa que se basó en el proceso de interferencia de ARN (ARNi).

Se introdujeron genes específicos de nematodos en las plantas hospedadoras utilizando vectores de Agrobacterium. La introducción del ADN fue tal que produjo ARN tanto sentido como antisentido en las células huésped. Estos dos ARN, al ser complementarios entre sí, formaron un ARN bicatenario (ARNdc) que inició el ARNi y, por lo tanto, silenció el ARNm específico del nematodo. Debido a esto, el parásito no podría sobrevivir en un huésped transgénico expresando ARN de interferencia específico. La planta transgénica, por lo tanto, se protegió del parásito.

Pregunta 17.
Explique los roles de los siguientes con la ayuda de un ejemplo de cada uno en la tecnología del ADN recombinante:
(i) Enzimas de restricción
Respuesta:
Enzimas de restricción :
(a) Las enzimas de restricción pertenecen a la clase de enzimas nucleasas que rompe los ácidos nucleicos al escindir sus enlaces fosfodiéster.
(b) Dado que las endonucleasas de restricción cortan el ADN en un sitio de reconocimiento específico, se utilizan para cortar el ADN del donante para aislar el gen deseado.
(c) El gen deseado tiene extremos pegajosos que pueden ligarse fácilmente al vector de clonación cortado por las mismas enzimas de restricción que tienen extremos pegajosos complementarios para formar ADN recombinante.
(d) Un ejemplo es EcoR1 que se obtiene de la cepa “R” de la bacteria E. coli que corta el ADN en un sitio de reconocimiento palindrómico específico.
5 "GAATTC 3"
3 "CTTAAG 5"

(ii) Plásmidos (CBSE 2018)
Respuesta:
Plásmidos: Los plásmidos son ADN de bacterias de doble hebra circular extracromosómico, autónomo. Se utilizan como vectores de clonación en ingeniería genética porque son pequeños y se autorreplican. Algunos plásmidos tienen genes de resistencia a antibióticos que pueden usarse como genes marcadores para identificar plásmidos recombinantes de los no recombinantes.

Para obtener los productos deseados, los plásmidos se cortan y se ligan con los genes deseados y se transforman en una célula huésped para su amplificación. Un ejemplo de plásmidos modificados artificialmente es pBR322 (construido por Bolívar y Rodríguez) o pUC (construido en la Universidad de California).

Pregunta 18.
Cuando el producto génico se requiere en grandes cantidades, las bacterias transformadas con el plásmido dentro de las bacterias se cultivan a gran escala en un fermentador industrial que luego sintetiza la proteína deseada. Este producto se extrae del fermentador para uso comercial.
(a) ¿Por qué el medio usado se drena por un lado mientras que el medio fresco se agrega por el otro? Explicar.
Respuesta:
En el biorreactor utilizado, se drena el medio y se añade el medio fresco para mantener las células en su fase logarítmica / experimental fisiológicamente más activa.

(b) Enumere cuatro condiciones óptimas para lograr el producto deseado en un biorreactor. (Documento de muestra CBSE 2020)
Respuesta:
Condición para obtener el producto deseado en un biorreactor:

Pregunta 19.
Enumere los pasos en la formación de ADNr.
Respuesta:
Pasos en la formación de ADNr:
La tecnología de ADN recombinado implica los siguientes pasos:

  1. Aislamiento de ADN.
  2. Fragmentación del ADN por endonucleasas de restricción.
  3. Aislamiento del fragmento de ADN deseado.
  4. Amplificación del gen de interés.
  5. Ligadura del fragmento de ADN en un vector usando ADN ligasa.
  6. Transferencia del fragmento de ADN al vector usando ADN ligasa.

Pregunta 20.
¿Cómo se amplifica el gen aislado de interés? (CBSE Delhi 2019, 2019 C)
Respuesta:
Amplificación del ADN / gen de interés:

  1. La amplificación se refiere al proceso de realizar múltiples copias del segmento de ADN in vitro.
  2. Emplea la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
  3. El proceso fue diseñado por K. Mullis,
  4. Esta técnica implica tres pasos principales:
    (a) Desnaturalización
    (b) Recocido de imprimación y
    (c) Extensión de cebadores.
  5. El ADN de doble hebra se desnaturaliza sometiéndolo a altas temperaturas.
  6. Se utilizan dos conjuntos de cebadores. Los cebadores son los segmentos cortos de ADN sintetizados químicamente (oligonucleótidos), que son complementarios al segmento de ADN (de interés).
  7. La enzima ADN polimerasa (polimerasa Taq) se utiliza para hacer copias de ADN haciendo uso de la plantilla genómica y el cebador.

Pregunta 21.
Enumere las características necesarias para facilitar la clonación en un vector. Muestre con un dibujo el vector de clonación de E. coli que muestra los sitios de restricción.
O
Bosquejo pBR322. (CBSE 2012, Fuera de Delhi 2019)
Respuesta:
Características necesarias para facilitar la clonación del vector.

  1. Origen de la replicación (Ori)
  2. Marcador seleccionable
  3. Sitios de clonación
  4. Vectores para la clonación de genes en plantas y animales.
    Sitios de vector de clonación

Vector de clonación de E. coli pBr322 que muestra sitios de restricción (HindIII, EcoRI, BamHI, Sal I, Pvu II, Pst I, ClaI), oriV y genes de resistencia a antibióticos (ampR y tetR). Rop codifica las proteínas implicadas en la replicación del plásmido.

Pregunta 22.
Con la ayuda de un simple croquis se muestra la acción de la enzima de restricción (EcoR1).
Respuesta:
La acción de la enzima de restricción.

Ecol corta el ADN entre las bases G y A solo cuando la secuencia GAATTC está presente en el ADN.

Pregunta 23.
Explique la importancia de (a) ori, (b) ampR y (c) rop en el vector E. colt. (CBSE Fuera de Delhi 2009, Fuera de Delhi 2019)
Respuesta:

  1. Importancia de ori: esta es una secuencia desde donde comienza la replicación y cualquier fragmento de ADN, cuando se une a esta secuencia, se puede hacer para replicar dentro de las células huésped, permite múltiples copias por célula.
  2. Importancia de ampR: es el gen de resistencia a los antibióticos para la ampicilina. Ayuda en la selección de células transformadoras.
  3. Importancia de rop: codifica las proteínas implicadas en la replicación del plásmido.

Pregunta 24.
Nombra dos vectores de clonación. Describa las características necesarias para facilitar la clonación en un vector. (Papel de muestra CBSE)
Respuesta:
Los plásmidos y bacteriófagos son dos ejemplos del vector de clonación. Un vector es una molécula de ADN que tiene la capacidad de replicarse en una célula huésped adecuada y en la que se integra el fragmento de ADN que se va a clonar para la clonación.

Un buen vector debe tener las siguientes propiedades:

  • Debería poder replicarse de forma autónoma.
  • debe ser fácil de aislar y purificar,
  • Debe introducirse fácilmente en las células huésped.

Vectores de clonación: todos los vectores que se utilizan para la propagación de inserciones de ADN en un huésped adecuado se denominan vectores de clonación. Cuando un vector se diseña para la expresión, es decir, la producción de la proteína especificada por el inserto de ADN, se denomina vector de expresión.

Pregunta 25.
¿Qué son los biorreactores? Dibuja los dos tipos de biorreactores. ¿Cuál es la utilidad? ¿Cuál es el tipo común de biorreactores? (CBSE Delhi 2013)
O
¿Cómo ayudan los biorreactores en la producción de proteínas recombinantes? (CBSE fuera de Delhi 2009)
O
(i) ¿Cómo ha ayudado el desarrollo del biorreactor en biotecnología?
(ii) Nombre el biorreactor más utilizado y describa su funcionamiento. (CBSE Delhi 2018, 2019 C)
Respuesta:
Los cultivos de pequeño volumen no pueden producir cantidades apreciables de productos. Para producir estos productos en grandes cantidades, se requirió el desarrollo de "biorreactores" donde se pueden procesar grandes volúmenes (100-1000 litros) de cultivo. Por tanto, los biorreactores pueden considerarse recipientes en los que las materias primas se convierten biológicamente en productos específicos, utilizando células microbianas, vegetales, animales o humanas o enzimas individuales.

Papel. Un biorreactor proporciona las condiciones óptimas para lograr el producto deseado al proporcionar condiciones óptimas de crecimiento (temperatura, pH, sustrato, sales, vitaminas, oxígeno).

Uno de los biorreactores más utilizados es el del tipo de agitación.

Un reactor de tanque agitado es cilíndrico o un recipiente con una base curva que facilita la mezcla del contenido del reactor. El agitador facilita la mezcla uniforme y la disponibilidad de oxígeno en todo el biorreactor. Alternativamente, se puede hacer pasar aire a través del reactor. Consiste en un sistema agitador, un sistema de suministro de oxígeno, un sistema de control de espuma, un sistema de control de temperatura, un sistema de control de pH y puertos de muestreo para que pequeños volúmenes del cultivo puedan extraerse periódicamente.

(a) Biorreactor de tanque agitado simple (b) Biorreactor de tanque agitado burbujeado a través del cual se burbujean burbujas de aire estéril

Pregunta 26.
Describe brevemente lo siguiente:
(i) Origen de la replicación (Ori).
Respuesta:
(a) Es una secuencia específica de bases de ADN, que es responsable de iniciar la replicación.
(b) Un ADN extraño para la replicación debe estar vinculado al origen de la replicación.
(c) Un ADN procariota tiene normalmente un solo origen de replicación, mientras que el ADN eucariota puede tener más de un origen de replicación.
(d) La secuencia es responsable de controlar el número de copias del ADN enlazado.

(ii) Biorreactor.
Respuesta:
a) Son recipientes en los que las materias primas se convierten biológicamente en productos específicos utilizando células microbianas, vegetales o humanas.
(b) Un biorreactor proporciona las condiciones óptimas para lograr el producto deseado al proporcionar condiciones óptimas de crecimiento, pH, sales de sustrato, vitaminas, oxígeno, etc.
(c) Los biorreactores comúnmente usados ​​son del tipo de agitación.
(d) Un reactor de tanque agitado suele ser cilíndrico o con una base curva para facilitar la mezcla de los contenidos.
(e) El agitador facilita la mezcla uniforme y la disponibilidad de oxígeno en todo el biorreactor.
(f) El biorreactor tiene los siguientes componentes:

  • Un sistema agitador.
  • Un sistema de suministro de oxígeno.
  • Un sistema de control de espuma.
  • Un sistema de control de temperatura.
  • sistema de control de pH y
  • Puertos de muestreo.

(iii) Procesamiento posterior.
Respuesta:
(a) Se refiere a la serie de procesos a los que debe someterse un producto modificado genéticamente antes de que esté listo para su comercialización.
(b) Los procesos incluyen dos procesos:

(c) El producto debe estar formulado con conservantes adecuados.
(d) Dicha formulación debe ser sometida a exhaustivos ensayos clínicos en el caso de los medicamentos. También se requieren pruebas de control de calidad estrictas.
(e) También se requiere una prueba de control de calidad adecuada de cada producto.

Pregunta 27.
Además de mejores propiedades de aireación y mezcla, ¿qué otras ventajas tienen los biorreactores de tanque agitado sobre los matraces agitados?
Respuesta:
Los matraces de agitación son los matraces convencionales para estudios de fermentación durante el cribado secundario o el desarrollo de procesos de laboratorio. Por lo tanto, los biorreactores de tanque agitado se utilizan para producir el producto en grandes cantidades.

Además de aireación y mezcla:

  1. también ayuda a proporcionar condiciones óptimas de crecimiento (temperatura, pH, sustrato, sales, vitaminas, oxígeno) para lograr el producto deseado.
  2. económico
  3. debido a los deflectores, la tasa de transferencia de oxígeno es muy alta
  4. la capacidad de los fermentadores es mayor.

Pregunta 28.
Explique brevemente lo siguiente
(i) PCR
(ii) ADN y enzimas de restricción
(iii) quitinasa. (CBSE 2012)
O
Explica los tres pasos involucrados en una reacción en cadena de la polimerasa. (CBSE Delhi 2018C)
Respuesta:
(i) Reacción en cadena de la polimerasa-PCR Es el proceso en el que se sintetizan in vitro múltiples copias del gen o segmento de ADN de interés utilizando cebadores y ADN polimerasa.

Mecanismo de trabajo de la PCR: Un solo ciclo de amplificación por PCR implica tres pasos básicos: desnaturalización, hibridación y extensión (polimerización).
(a) Desnaturalización. En la etapa de desnaturalización, el ADN diana se calienta a una temperatura alta (generalmente 94 ° C), lo que resulta en la separación de las dos cadenas. Cada hebra del ADN diana actúa como plantilla para la síntesis de ADN.

(b) Recocido (Recocido = Unir). En este paso, los dos cebadores de oligonucleótidos se aparean (hibridan) con cada uno de los ADN molde monocatenarios, ya que la secuencia de los cebadores es complementaria a los extremos 3 'del ADN molde. Este paso se lleva a cabo a una temperatura más baja dependiendo de la longitud y secuencia de los cebadores.

(c) Extensión del cebador (polimerización): el paso final es una extensión, en la que la ADN polimerasa Taq (de una bacteria termófila Thermus aquatics) provoca la síntesis de la región del ADN entre los cebadores, utilizando dNTP (desoxinucleósidos trifosfatos) y Mg 2+. Significa que los cebadores se extienden entre sí de modo que se copia el segmento de ADN que se encuentra entre los dos cebadores.

La temperatura óptima para esta etapa de polimerización es 72 ° C. Para comenzar el segundo ciclo, el ADN se vuelve a calentar para convertir todo el ADN recién sintetizado en cadenas simples, cada una de las cuales ahora puede servir como plantilla para la síntesis de más ADN nuevo. Por lo tanto, el producto de extensión de un ciclo puede servir como plantilla para los ciclos posteriores y cada ciclo esencialmente duplica la cantidad de ADN del ciclo anterior. Como resultado, a partir de una única molécula molde, es posible generar 2 n moléculas después de n número de ciclos.

  • Diagnóstico de patógeno
  • Diagnóstico de la mutación específica
  • huella de ADN
  • Detección de patógenos vegetales
  • Clonación de fragmentos de ADN de restos momificados de humanos y animales extintos.

(ii) Enzimas de restricción:
(a) Se llaman "tijeras moleculares" o bisturís químicos.
(b) Las enzimas de restricción, sintetizadas por microorganismos como mecanismo de defensa, son endonucleasas específicas que pueden escindir el ADN de doble hebra.
(c) Las enzimas de restricción pertenecen a una clase de enzimas llamadas nucleasas.
(d) Son de dos tipos:

  • Exonucleasas, que eliminan nucleótidos de los extremos del ADN.
  • Endonucleasas, que cortan el ADN en posiciones específicas en cualquier parte de su longitud (dentro).

(e) La secuencia de reconocimiento es un palíndromo, donde la secuencia de pares de bases se lee igual en ambas cadenas de ADN cuando la orientación de la lectura se mantiene igual, es decir, 5 & # 8242 → 3 & # 8242 dirección o 3 & # 8242 → 5 & # 8242 dirección.
p.ej. 5 y # 8242 y # 8211 GAATTC y # 8211 3 y # 8242
3 & # 8242 & # 8211 CTTAAG & # 8211 5 & # 8242

(f) Cada endonucleasa de restricción funciona inspeccionando la longitud de una secuencia de ADN y se une al ADN en la secuencia de reconocimiento.
(g) Corta las dos hebras de la doble hélice en puntos específicos de sus cadenas principales de azúcar-fosfato, un poco lejos del centro de los sitios palíndromos, pero entre las mismas dos bases en ambas hebras.
(h) Como resultado, se producen porciones monocatenarias llamadas extremos pegajosos en los extremos del ADN. Esta pegajosidad del extremo facilita la acción de la enzima ADN ligasa.

  1. Cuando se cortan con la misma endonucleasa de restricción, los fragmentos de ADN (tanto del donante como del huésped / receptor) producen el mismo tipo de "extremos pegajosos" que se pueden unir de un extremo a otro mediante ligasas de ADN.
  2. Quitinasa. Esta pared celular de los hongos está hecha de quitina. La enzima se usa en hongos para romper la célula y liberar ADN junto con sus macromoléculas como proteínas de ARN, lípidos y polisacáridos.

Pregunta 29.
Discuta con su maestro y descubra cómo distinguir entre
(i) ADN plasmídico y ADN cromosómico
Respuesta:
Diferencias entre el ADN plasmídico y el ADN cromosómico:

ADN plasmídico ADN cromosómico
1. Es una molécula de ADN autorreplicante que se encuentra naturalmente en muchas bacterias y levaduras. 1. ADN cromosómico presente en los cromosomas de todos los organismos.
2. No es esencial para el crecimiento y la división normales. 2. Es fundamental para el crecimiento y la división.
3. Contiene información sobre algunos rasgos. 3. Contiene información para todos los rasgos.

(ii) Exonucleasa y endonucleasa (CBSE, Delhi 2013)
Respuesta:
Diferencias entre exonucleasa y endonucleasa:

Endonucleasa Exonucleasa
Corta el ADN en una posición específica de las bases nitrogenadas en cualquier lugar dentro de la longitud del ADN, excepto en los extremos. Esta enzima elimina los nucleótidos de los terminales de los extremos 5 'o 3' de las moléculas de ADN.

Pregunta 30.
Recopile los ejemplos de secuencias palindrómicas consultando a su maestro. Es mejor intentar crear una secuencia palindrómica siguiendo las reglas de los pares de bases.
Respuesta:

Pregunta 31.
¿Puede enumerar 10 proteínas recombinantes que se utilizan en la práctica médica? Encuentre dónde se utilizan como terapéuticos (utilice Internet).
Respuesta:

Proteína recombinante Uso Terapéutico
1. Insulina Para el tratamiento de la diabetes mellitus.
2. Hormona de crecimiento humano Para el tratamiento del enanismo.
3. Interferones Para el tratamiento de enfermedades virales, cáncer y sida.
4. Estreptoquinasa Para el tratamiento de la trombosis.
5. Factor de necrosis tumoral Para el tratamiento de la sepsis y el cáncer.
6. Interleucinas Para el tratamiento de varios tipos de cáncer.
7. Antígeno de superficie de la hepatitis B La vacuna contra la hepatitis B
8. Factor estimulante de colonias de granulocitos Para el tratamiento del cáncer y el sida y en el trasplante de médula ósea.
9. Factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos Para tratar el cáncer y el sida
10. Hormona del crecimiento bovino Para aumentar la producción de leche.

Pregunta 32.
¿Cómo se aísla el ADN en forma purificada? (CBSE fuera de Delhi 2009)
Respuesta:
Aislamiento de ADN en forma purificada:

  1. El ADN debe aislarse en forma pura para la acción de las enzimas de restricción.
  2. El ADN se puede liberar de las células al digerir la envoltura celular mediante el uso de enzimas como la lisozima para las células bacterianas, la quitinasa para las células fúngicas y la celulasa para las células vegetales.
  3. Dado que el ADN está entrelazado con proteínas histonas y ARN, las proteínas se eliminan mediante tratamiento con proteasas y ARN mediante ribonucleasas.
  4. Otras impurezas se eliminan empleando tratamientos adecuados.
  5. El ADN purificado se precipita mediante la adición de etanol enfriado. Se ve como hilos finos en suspensión.

Pregunta 33.
¿Cómo se lleva a cabo el aislamiento y la fragmentación del ADN de interés en la tecnología del ADN recombinante? (CBSE fuera de Delhi 2009, 2019)
Respuesta:
1. Fragmentación del ADN: la fragmentación del ADN se lleva a cabo incubando las moléculas de ADN purificadas con enzimas de restricción adecuadas en condiciones óptimas de temperatura y pH.

2. Aislamiento de ADN (gen) de interés:
(a) Los fragmentos de ADN se separan mediante una técnica llamada electroforesis en gel.
(b) El ADN se corta en fragmentos mediante endonucleasas de restricción.
(c) Estos fragmentos se separan mediante una técnica llamada electroforesis en gel.
(d) La agarosa, el polímero natural obtenido de las algas marinas, se utiliza como matriz.
(e) Los fragmentos de ADN que están cargados negativamente se separan obligándolos a moverse a través de la matriz hacia el ánodo bajo un campo eléctrico.
(f) Los fragmentos de ADN se separan / resuelven según su tamaño.
(g) Las moléculas separadas se tiñen con bromuro de etidio y se visualizan por exposición a radiación UV, como bandas de color naranja brillante.
(h) Las bandas de ADN separadas (en el gel) se cortan del gel y se extraen de la pieza de gel (elución).
(i) Dichos fragmentos de ADN se purifican y se usan para construir ADN recombinante uniéndolos con vectores de clonación.


Enzima de restricción HincII (HindII)

Consulte el Certificado de análisis del producto para obtener información sobre las condiciones de almacenamiento, los componentes del producto y las especificaciones técnicas. Consulte la Lista de componentes del kit para determinar los componentes del kit. Los certificados de análisis y las listas de componentes del kit se encuentran en la pestaña Documentos.

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A.P. y W.W. reconocer con gratitud el apoyo de la Deutsche Forschungsgemeinschaft. G.W. agradece a Don Comb y Jim Ellard por años de apoyo a la investigación de enzimas de restricción, a Rich Roberts y Bill Jack por su aliento, ya los miembros de la división de investigación de ER por las numerosas discusiones. Agradecemos a nuestros colegas sus múltiples contribuciones al campo de la restricción y modificación, en particular a aquellos cuyo trabajo no hemos citado por falta de espacio. Agradecemos a los revisores anónimos de las primeras versiones de este artículo cuyos comentarios y sugerencias lo mejoraron enormemente.

& # x02020 Los autores desean que se sepa que, en su opinión, los dos primeros autores deben considerarse como primeros autores conjuntos.


Hoy en día, las enzimas de restricción son una herramienta indispensable para la biotecnología. La ventaja de tales enzimas es que ofrecen los medios para cortar con mucha precisión una doble hebra de ADN. Hasta la fecha, se han identificado más de 19.000 enzimas restrictivas. Cada una de estas enzimas reconoce un patrón específico de nucleótidos en una secuencia de ADN. Hay cuatro tipos principales de enzimas restrictivas. De estas, las enzimas restrictivas de Tipo II han atraído la mayor atención debido a su utilidad como herramientas para la tecnología del ADN recombinante. Comercialmente existen actualmente más de 300 enzimas de restricción de Tipo II, con más de 200 especificidades de secuencia diferentes, disponibles. Se han caracterizado muchas menos enzimas de restricción de tipo I, III y IV, pero los estudios de estas enzimas están proporcionando información rica sobre las interacciones y catálisis ADN-proteína, las relaciones familiares de proteínas, el control de la actividad de restricción y la plasticidad de los dominios proteicos.

En 1952, Salvador Luria y su estudiante graduada Mary Human de la Universidad de Illinois notaron un extraño fenómeno al realizar experimentos para estudiar la ruptura del ADN en bacterias infectadas por fagos. Habían comenzado su trabajo usando Escherichia coli y luego cambiaron al uso de la bacteria Shigella luego de que se rompiera accidentalmente su tubo de ensayo lleno de cultivo de Escherichia coli sensible a los fagos. Para su sorpresa, observaron que la exposición a Shigella impedía el crecimiento de los fagos (virus) en Escherichia coli pero no en otras especies de bacterias. En una serie de experimentos adicionales con otros fagos y una variedad de huéspedes de Escherichia coli y Shigella, observaron que algunos fagos desaparecían y luego reaparecían cuando se cultivaban con diferentes bacterias y que los fagos podían volver a crecer en el huésped original una generación más tarde. Lo que sea que haya causado la modificación en los virus, concluyeron, no había sido una mutación genética porque no era un cambio permanente. Más bien parecía ser causado por la bacteria huésped.Ellos etiquetaron el proceso como una variación genética 'inducida por el huésped', más tarde llamado fenómeno de modificación de restricción. En un año, otros científicos, E S Anderson y A Felix del Laboratorio Central de Referencia Entérica de Londres y Joe Bertani y Jean Weigle de la Universidad de Illinois también informaron sobre observaciones de variaciones controladas por el huésped en los virus bacterianos. En 1962 Werner Arber y su estudiante de doctorado, Daisy Dussoix, basándose en experimentos que habían realizado con el fago lambda, propusieron que el fenómeno podría explicarse por las enzimas de restricción y modificación producidas por las bacterias para defenderse de los virus invasores. Al profundizar en esto, Arber planteó la hipótesis de que las bacterias producían una enzima digestiva que cortaba el ADN viral en trozos más pequeños en sitios específicos y una enzima para catalizar la metilación, o modificación, de su propio ADN para protegerlo de la enzima restrictiva. En 1965, Arber argumentó que si fuera posible aislar y caracterizar las enzimas de restricción, podrían usarse como una herramienta de laboratorio para escindir el ADN. Tres años más tarde, Werber y su estudiante postdoctoral Stuart Linn identificaron la primera enzima de restricción (EcoB) en Escherichia coli y demostraron su acción. El mismo año, Matthew Meselson y su estudiante postdoctoral Robert Yuan, en la Universidad de Harvard, identificaron otra enzima de restricción, EcoK, de Escherichia coli. Poco después, en julio de 1970, Hamilton Smith y Kent Wilcox anunciaron que habían aislado y caracterizado una enzima de restricción (HindII) en una segunda especie bacteriana, Haemophilus influenza, y demostraron que degradaba el ADN de un fago extraño. Poco después, Smith y su estudiante postdoctoral Thomas Kelly determinaron la secuencia de nucleótidos del sitio específico donde HindII escindió el ADN. Esto confirmó la hipótesis de Arber de que las enzimas restrictivas son muy selectivas en el lugar donde hacen sus cortes. En poco tiempo se comprendió la acción básica de las enzimas de restricción y, en 1971, el colega de Smith, Daniel Nathans y su estudiante de posgrado Kathleen Danna demostraron el ADN escindido por HindII del virus SV40 en 11 fragmentos bien definidos y cómo unir estos fragmentos para construir la estructura. mapa genético completo del ADN de SV40. Esto sentó las bases para la adopción de enzimas de restricción para la investigación del ADN.


Todo lo que siempre quiso saber sobre las enzimas de restricción de tipo II

¿Para qué se utilizan las enzimas de restricción de tipo II?

Las enzimas de restricción de tipo II son las conocidas que se utilizan para las aplicaciones de biología molecular cotidianas, como la clonación de genes y la fragmentación y el análisis de ADN. Estas enzimas escinden el ADN en posiciones fijas con respecto a su secuencia de reconocimiento, creando fragmentos reproducibles y distintos patrones de electroforesis en gel. Se han descubierto y caracterizado más de 3500 enzimas de tipo II, reconociendo unas 350 secuencias de ADN diferentes. Se han identificado miles de enzimas tipo II más "putativas" y "rsquo" mediante el análisis de genomas bacterianos y arqueales secuenciados, pero siguen sin caracterizarse.

¿Cómo se denominan las enzimas de restricción de tipo II?

Las enzimas de restricción se denominan según el microorganismo en el que se descubrieron. La enzima de restricción & lsquoHindIII & rsquo, por ejemplo, es la tercera de varias actividades de endonucleasa que se encuentran en la bacteria Haemophilus influenzae serotipo d. El prefijo & lsquoR. & Rsquo se agrega a veces para distinguir las enzimas de restricción de las enzimas de modificación con las que se asocian in vivo. Por lo tanto, & lsquoR.HindIII & rsquo se refiere específicamente a la enzima de restricción y & lsquoM.HindIII & rsquo a la enzima de modificación. Cuando no hay ambigüedad, se omite el prefijo & lsquoR. & Rsquo.

Propiedades de las enzimas de restricción de tipo II

Las enzimas de restricción de tipo II son muy diversas en términos de secuencia de aminoácidos, tamaño, organización de dominios, composición de subunidades, requisitos de cofactor y modos de acción. Se clasifican libremente en una docena de subtipos según su comportamiento enzimático. Esta es una clasificación práctica que refleja sus propiedades más que su filogenia. No refleja necesariamente relaciones evolutivas o estructurales, y los subtipos no son mutuamente excluyentes. Una enzima puede pertenecer a varios subtipos si presenta cada una de sus características definitorias. Discutimos estos subtipos en su orden de importancia, los cuatro principales son Tipo IIP, IIS, IIC e IIT.


Aplicaciones de las enzimas de restricción (Importancia y usos de las endonucleasas de restricción en biotecnología)

Las endonucleasas de restricción (también llamadas tijeras moleculares) son una clase de enzimas nucleasas que cortan la cadena de ADN en ubicaciones precisas. Son enzimas endonucleasas específicas en las células que primero reconocen la secuencia específica (llamados sitios de restricción) dentro de la cadena de ADN y escinden la cadena principal del fosfodiéster del ADN en sitios específicos.

El Premio Nobel en 1978 (en Fisiología y Medicina) fue compartido por Werner Arbor, Daniel Nathans y Hamilton Smith por el descubrimiento de las enzimas de restricción y sus aplicaciones en genética molecular. Las enzimas de restricción son ahora una herramienta inevitable para la manipulación del ADN en varios estudios de recombinación tanto in vitro y en vivo. Las principales aplicaciones de las enzimas de restricción son:

(1). Construcción de mapas de restricción

(2). Construcción de huellas dactilares de ADN

(3). Tecnología de ADN recombinante (tecnología de ADNr)

(1). Construcción de mapas de restricción:

Ø Mapa de restricción: un diagrama o mapa de la molécula de ADN de un organismo que muestra sitios específicos de escisión (sitios de restricción).
Ø La construcción de mapas de restricción fue uno de los primeros usos descritos de las enzimas de restricción.
Ø Los mapas de restricción se utilizan para identificar los fragmentos de ADN que contienen genes específicos.
Ø Los datos de muchos digestiones de restricción de una muestra de ADN común se combinan para producir un mapa de restricción completo y preciso.
Ø Los mapas de restricción también diseñan e ingenian vectores y plásmidos de clonación.

¿Cómo construir un mapa de restricción?

& amp Tome la muestra de ADN en "x" número de viales.
& amp 'x' es el número de enzimas de restricción que tenemos (ejemplo 5).
& amp Trate la muestra de ADN con la enzima de restricción específica por separado.
& amp Después de la digestión de restricción, procese la muestra de ADN en un gel de agarosa al 2% junto con un marcador de ADN para la separación de los fragmentos de ADN.

& amp En gel de agarosa, el fragmento más pequeño se mueve más rápido y se encuentra en la parte inferior del gel.

& amp Luego, averigüe el tamaño de cada fragmento y dibuje un mapa de acuerdo con el tamaño de los fragmentos y el tamaño total del ADN intacto como en la siguiente figura.

2. Construcción de huellas dactilares de ADN:

Ø La toma de huellas dactilares de ADN es una técnica forense que se utiliza para identificar a las personas en función de las variaciones en sus secuencias de ADN.
Ø En la actualidad, hay muchos métodos disponibles para la toma de huellas dactilares de ADN y el más preciso son los métodos basados ​​en la secuenciación de ADN.
Ø Las enzimas de restricción también se pueden usar para construir huellas dactilares de ADN.
Ø La toma de huellas dactilares de ADN con enzimas de restricción es en realidad una versión extendida de los mapas de restricción de ADN.

Ø El principio de la toma de huellas dactilares de ADN es que las diferentes cepas o especies de muestra de ADN tendrán mapas de restricción ligeramente diferentes.

Ø Esta diferencia en los mapas de restricción se debe a su diferencia en las secuencias de ADN.

Ø Dado que las enzimas de restricción tienen una acción específica de secuencia, los mapas de restricción obtenidos también mostrarán variaciones considerables dependiendo de la extensión de las diferencias de secuencia de ADN.

Ø Las regiones de ADN en un organismo que son muy variables en la digestión por restricción generan huellas dactilares de ADN únicas.

Ø Esta característica se utiliza en la toma de huellas dactilares de ADN para la identificación de mutaciones o variaciones dentro del genoma de una población.

Ø La variación en las huellas dactilares del ADN se puede utilizar para identificar individuos en una gran población heterogénea.

Ø Dichas huellas dactilares de ADN se utilizan ampliamente para resolver disputas de paternidad, identificación de sospechosos en ciencias forenses, etc.

¿Cómo construir una huella de ADN?

Aquí usamos la muestra de ADN de una investigación forense (un caso de violación)

$ Se aísla ADN de (1) la víctima, (2) la evidencia (como el semen, sangre o cabellos) y (3) el sospechoso (s).

$ Luego, la muestra de ADN se digiere con una enzima de restricción específica.

$ Los fragmentos después de la digestión por restricción se separan en un gel de agarosa.

$ Después de la electroforesis, los fragmentos de ADN se transfieren a una membrana de nailon mediante la técnica de transferencia Southern.

$ El ADN unido se desnaturaliza y luego se trata con sondas marcadas radiactivamente.

$ Las sondas de ADN marcadas se hibridan específicamente con los fragmentos de restricción en la membrana de nailon que se derivan de esta región.

$ Los fragmentos marcados se identifican luego mediante autorradiografía.

$ A continuación se proporciona una representación esquemática del autorradiograma.

$ A partir de los resultados, queda claro que el sospechoso " A ’Es el criminal real en la investigación.

$ Para confirmar los resultados, se pueden utilizar diferentes enzimas de restricción y las correspondientes sondas de ADN.

$ Ventaja de la toma de huellas dactilares de ADN en la ciencia forense:

@ Identificación exacta del culpable con evidencia molecular.

@ Mediante la combinación de técnicas de PCR, incluso la pequeña muestra de ADN obtenida del lugar del crimen puede usarse para generar huellas dactilares de ADN.

3. Tecnología de ADN recombinante (tecnología de ADNr)

Ø La tecnología de recombinación es una técnica artificial en la creación de moléculas de ADN recombinado de diferentes organismos uniendo o recombinando los fragmentos de ADN generados por el tratamiento con enzimas de restricción.

Ø El primer ADN recombinante fue producido por Stanley N. Cohen y Herbert Boyer en 1973.

Ø En su experimento, combinaron dos plásmidos pSC-101 y pSC-102 (cada uno con dos genes separados resistentes a los antibióticos) y el ADN recombinado recién creado se incorporó a E. coli.

Ø El pSC-101 contiene el gen de la resistencia a la tetraciclina.

Ø El pSC-102 contiene el gen de la resistencia a la kanamicina.

Ø Las bacterias transformadas después de la recombinación muestran resistencia a ambos antibióticos.

Ø En la actualidad, se encuentran disponibles muchas técnicas diversas en la tecnología del ADN recombinante.

Ø Sin embargo, la tecnología recombinante básica es muy simple como se explica a continuación:

Pasos en la tecnología del ADN recombinante

$ El primer paso es la extracción del ADN total del organismo que contiene el gen de interés deseado.

$ El siguiente paso es la generación de fragmentos del ADN anterior con una enzima de restricción adecuada.

$ Luego, el fragmento de ADN que contiene el gen de interés se inserta en el vector de clonación para crear un ADN recombinante o quimérico. El vector de clonación puede ser un plásmido, bacteriófago, virus o pequeños cromosomas artificiales como YAS y BAC.

$ Después de la clonación, introduzca el vector recombinado en una célula huésped como una bacteria (E. coli). La mayoría de los vectores de clonación contienen secuencias que les permiten replicarse de forma autónoma dentro de la célula huésped competente.

$ Luego induzca la expresión del gen de interés en la célula huésped para producir el producto deseado.

$ El producto puede extraerse del medio utilizando técnicas de procesamiento posteriores adecuadas.

(fuente de la imagen cc Wikipedia)

Sitio de restricción en los vectores de clonación

Ø Todos los vectores de clonación poseen un sitio de clonación único.

Ø Este sitio de clonación contiene la secuencia diana de endonucleasa de restricción específica para permitir la inserción específica del sitio de ADN extraño.

Ø Los vectores plásmidos comúnmente usados ​​poseen varios sitios de restricción de este tipo en el sitio de clonación y dicho sitio en el vector se denomina sitio de clonación múltiple o poliengarce.

Ø Las endonucleasas de restricción utilizadas en la tecnología de recombinación producen fragmentos de ADN con voladizos monocatenarios en sus extremos 3 'o 5'.

Ø Estos voladizos se denominan extremos pegajosos o extremos escalonados.

Ø Estos voladizos pegajosos pueden emparejarse transitoriamente de bases con extremos pegajosos complementarios de los fragmentos de ADN deseados de manera muy fácil y específica.

Ø Por lo tanto, en el tipo más simple de recombinación, se usa una sola enzima de restricción para cortar el vector de clonación y el gen de interés.

Ø Debido a la similitud en la complementariedad de secuencias, el uso de una sola enzima de restricción puede causar dos problemas: (1). Se invierte la ligadura del vector sin inserción y (2) la orientación del gen de interés insertado.

Ø El uso de dos enzimas de restricción separadas puede solucionar este problema.

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Hay tres grupos principales de endonucleasas de restricción (REasas) llamados Tipos I, II y III (1, 2). Desde 1973, las REasas y las metiltransferasas de ADN (MTasas) se han nombrado basándose en una sugerencia original de Smith y Nathans (3). Propusieron que los nombres de las enzimas deberían comenzar con un acrónimo de tres letras en el que la primera letra era la primera letra del género del que se aisló la enzima y las dos letras siguientes eran las dos primeras letras del nombre de la especie. Se podrían agregar letras o números adicionales para indicar cepas o serotipos individuales. Por tanto, la enzima HindII fue una de las cuatro enzimas aisladas de H Aemophilus en fluenzae serotipo d. Las primeras tres letras del nombre estaban en cursiva. Posteriormente, se adoptó una propuesta formal para nombrar los genes que codifican REasas y MTasas (4). Cuando solo se conocía un puñado de enzimas, estos esquemas eran muy útiles, pero a medida que se han encontrado más enzimas, a menudo de diferentes géneros y especies con nombres cuyos acrónimos de tres letras serían idénticos, ha aparecido una considerable laxitud en las convenciones de nomenclatura. Además, ahora sabemos que cada tipo principal de enzima puede contener subtipos. Esto se aplica especialmente a las enzimas de tipo II, de las cuales se han caracterizado más de 3500 (5). En este artículo revisamos las convenciones de nomenclatura y esbozamos un esquema actualizado que incorpora el conocimiento actual sobre las complejidades de estas enzimas. Describimos un conjunto de convenciones de nomenclatura para REases y sus MTasas asociadas. Dado que las endonucleasas autodirigidas (6) se han denominado de forma análoga, proponemos que se apliquen directrices similares a ese grupo de enzimas. Finalmente, es importante darse cuenta de que el objetivo de este documento es proporcionar una nomenclatura para estas enzimas, no proporcionar una clasificación rigurosa.

Primero, presentamos una serie de cambios generales, abreviaturas estándar y definiciones que se recomiendan para su uso.

1. "Enzima de restricción" y "endonucleasa de restricción" deben considerarse sinónimos y se prefiere la abreviatura REase (o en algunos casos, R). Sin embargo, también se puede utilizar la abreviatura ENase, que se ha utilizado ampliamente. Deben evitarse nombres alternativos como restrictasas. Se debe utilizar la abreviatura R ‐ M para la modificación de la restricción. La endonucleasa homing debe abreviarse HEase.

2. Metiltransferasa es el nombre preferido, ya que describe correctamente la actividad. La metilasa, aunque es de uso común, no es estrictamente precisa y debe evitarse en forma impresa. La abreviatura MTase (o en algunos casos, M) debería ser la estándar.

3. Ya no se utilizarán cursivas para las primeras tres letras del nombre REase o MTase. Muchas revistas ya evitan las cursivas y mantener la convención en cursiva no se traduce fácilmente a las computadoras y no tiene ningún propósito esencial. Continuará la convención de nombrar diferentes enzimas del mismo aislado del mismo organismo con números romanos crecientes.

4. Los nombres de las enzimas de restricción no deben incluir un espacio entre el acrónimo principal y el número romano. Esta práctica, que se ha empleado para evitar el aspecto poco elegante que se produce cuando los caracteres en cursiva se yuxtaponen junto a los caracteres en una fuente normal, es incorrecta. Ahora que las cursivas ya no se utilizarán en los nombres, no hay razón para continuar con esta práctica. Se abandonará el esquema anterior de usar un punto en relieve después del prefijo y se debe usar un punto normal (punto). Además, a excepción del punto único o guión (en endonucleasas homing) que se utiliza para separar el prefijo de la parte principal del nombre, no se deben utilizar signos de puntuación, como paréntesis, puntos, comas o barras, en REase o MTase. nombres. Solo deben aparecer caracteres alfanuméricos. Ya las enzimas de Nostoc las especies C han cambiado de su Nsp (7524) I original a NspI y muchas otras también han cambiado. El más reciente es Bst4.4I, que ha cambiado a Bst44I.

5. Continuará la designación de los tres tipos principales de REases como Tipo I, Tipo II y Tipo III, prefiriéndose la "T" mayúscula. Sin embargo, se dividirán en subtipos como se indica a continuación. Se agregará un nuevo tipo de REase. Este es el Tipo IV, que incluirá aquellos sistemas que escinden solo ADN metilado como su sustrato y muestran solo una especificidad débil, como los sistemas McrA, McrBC y Mrr de Escherichia coli.

6. Las bases de datos de secuencias contienen muchos genes que son excelentes candidatos para codificar ADN MTasas y REasas, según la similitud de secuencias. Estos se nombrarán de acuerdo con las mismas pautas que se utilizan para las enzimas caracterizadas bioquímicamente, pero llevarán el sufijo P para indicar su naturaleza activa. Una vez que se hayan caracterizado bioquímicamente y se demuestre que están activos, la P se eliminará y sus nombres se cambiarán a un nombre normal con el siguiente número romano que sea apropiado.

7. La convención actual de nombrar las enzimas R-M con un prefijo M, R, etc. se ampliará para incluir los productos proteicos de genes relacionados, como las proteínas de control (por ejemplo, C.BamHI) y las enzimas melladoras que escinden G / Desajustes de T (p. Ej., V.HpaII para la enzima similar a vsr asociada con el sistema HpaII) y N.BstNBI para las enzimas de corte regulares. Además, se permitirán hasta dos caracteres en el prefijo. Esto permitirá que las enzimas, como Eco57I, con actividad REasa y actividad MTasa fusionadas en una sola proteína, se denominen RM.Eco57I. Su MTase acompañante permanecería como M.Eco57I. Tenga en cuenta que se mantendrá la convención actual de permitir que REase sea nombrado con o sin el prefijo "R". Por lo tanto, R.EcoRI y EcoRI se considerarán sinónimos, al igual que RM.Eco57I y Eco57I.Para ciertas enzimas de corte que se han obtenido de las enzimas de Tipo IIT, donde una de las dos subunidades heterodiméricas ha sido inactivada, las enzimas de corte mutantes resultantes deben llamarse Nt.BbvCI o Nb.BbvCI, donde la 't' y la 'b' indican la escisión de la hebra superior o inferior de la secuencia de reconocimiento normal.

8. Cuando hay dos genes REase o MTase presentes y asociados con un solo sistema R ‐ M, se debe hacer referencia a ellos con el segundo carácter del prefijo que es un 1 o 2 árabe. Por lo tanto, los dos productos génicos M del HphI R‐ El sistema M sería M1.HphI y M2.HphI.

9. Las abreviaturas estándar para las bases metiladas deben ser 5 ‐ metilcitosina (m5C), N4 ‐ metilcitosina (m4C) y N6 ‐ metiladenina (m6A). No es necesario utilizar un superíndice para el número.

10. Los isosquizómeros son REasas que reconocen la misma secuencia. El primer ejemplo descubierto se llama prototipo y todas las enzimas posteriores que reconocen la misma secuencia son isosquizómeros del prototipo. Los neoesquizómeros son ese subconjunto de isosquizómeros que reconocen la misma secuencia, pero se escinden en diferentes posiciones del prototipo. Así, AatII (secuencia de reconocimiento: GACGT ↓ C) y ZraI (secuencia de reconocimiento: GAC ↓ GTC) son neosquizómeros entre sí, mientras que HpaII (secuencia de reconocimiento: C ↓ CGG) y MspI (secuencia de reconocimiento: C ↓ CGG) son isosquizómeros, pero no neoschizomers. Designaciones análogas no son apropiadas para MTasas, donde las diferencias entre enzimas no se definen tan fácilmente y normalmente no se han caracterizado bien.

11. Las MTasas solitarias (es decir, no asociadas con una REase) como las MTases Dam y Dcm de E. coli y las MTasas eucariotas como Dnmt1 y Dnmt3a se nombrarán sistemáticamente de acuerdo con las reglas generales establecidas para las enzimas procariotas. Por lo tanto, el nombre sistemático de Dam MTase de E. coli K12 será M.EcoKDam y la MTasa de mantenimiento murina será M.MmuDnmt1. Sin embargo, será aceptable referirse a ellos por sus nombres triviales de uso más común, Dam, Dcm, Dnmt1, etc., pero simplificará la búsqueda automatizada y las referencias cruzadas de la literatura si el nombre sistemático, incluido el prefijo M, también aparece al menos inicialmente en una publicación. Las MTasas solitarias que son transmitidas por fagos o virus también se nombran con el prefijo M y el nombre del fago o virus que las porta. Opcionalmente, se puede incluir el nombre de host. Por tanto, la MTasa codificada por el fago SPR de Bacillus subtilis se llama M.SPRI (7) y la MTasa codificada por el virus archaeal ϕCh1 de Natrialba magadii se llama M.NmaPhiCh1I (8).

12. Las reglas para nombrar los genes de los sistemas R ‐ M de Tipo II deben adherirse a las propuestas de Szybalski et al. (4) con las extensiones obvias para acomodar los genes C, V y N. Por lo tanto, el nombre completo debe estar en cursiva, la primera letra será minúscula y las letras mayúsculas utilizadas como prefijo de la proteína se convertirán en el sufijo del gen. El gen de EcoRI se convierte así ecoRIR y que por su MTase es ecoRIM. En el caso de genes con dos prefijos en el nombre de la proteína, el nombre del gen incorporaría ambas letras del prefijo. Por tanto, el gen de RM.Eco57I se convertiría en eco57IRM. En el caso de las enzimas de Tipo I, el acrónimo del organismo de origen debe ir seguido de las designaciones genéticas tradicionales, hsdS, hsdR y hsdM. Por tanto, los tres genes del sistema de restricción EcoKI serían ecoKIhsdM, ecoKIhsdR y ecoKIhsdS. Sin embargo, será aceptable omitir el ecoKI donde corresponda.

13. A veces sucede que se requieren dos genes para una sola actividad enzimática, que codifica efectivamente dos subunidades. En estas situaciones, los dos genes y sus productos deben llevar un sufijo A y B. Por ejemplo, BbvCI es una REasa heterodimérica. Los dos productos génicos se llamarían R.BbvCIA (o simplemente BbvCIA) y R.BbvCIB (o simplemente BbvCIB), y la holoenzima activa sería BbvCI. Tenga en cuenta que los dos MTases separados de este sistema serían M1.BbvCI y M2.BbvCI. Para enzimas como Eco57I, que tienen actividad endonucleasa y MTasa en la misma cadena polipeptídica, la endonucleasa se denominaría RM.Eco57I, pero la segunda actividad MTasa asociada con este sistema se denominaría M.Eco57I. Para las MTasas, un ejemplo es M.AquI, que tiene un gen que codifica la región N-terminal hasta la mitad de la región variable de esta m5C MTasa y un segundo gen que codifica la región C-terminal restante (9). En este caso, las dos partes de esta proteína deben denominarse M.AquIA y M.AquIB y los genes como aquIAM y aquIBM.


CBSE Clase 12 Notas de revisión de biología Capítulo 11 y # 8211 Biotecnología: principios y procesos

Descarga gratuita en PDF del Capítulo 11 de Biología de la Clase 12 - Biotecnología: Principios y procesos Notas de revisión y notas clave breves preparadas por profesores expertos en Biología de la última edición de los libros CBSE (NCERT).

Principios de la biotecnología y herramientas de la tecnología de recombinación del ADN:
1. Biotecnología se puede definir como el uso de microorganismos, células vegetales o animales o sus componentes para producir productos y procesos útiles para los seres humanos. Según la Federación Europea de Biotecnología (EFB), la biotecnología es la integración de las ciencias naturales y los organismos, las células, sus partes y los análogos moleculares de productos y servicios. El término "biotecnología" fue acuñado por Karl Ereky en 1919.
2. Los principios de la biotecnología se basan en el concepto de las siguientes técnicas:
(i) La ingeniería genética es la técnica para alterar la química del material genético (ADN / ARN), para introducirlos en otros organismos y así, cambiar el fenotipo del organismo huésped.
(ii) Mantenimiento adecuado de condiciones estériles para apoyar el crecimiento de solo los microbios / células eucariotas deseados en grandes cantidades para la fabricación de productos biotecnológicos como antibióticos, vacunas, enzimas, etc.
3. Las técnicas de ingeniería genética incluyen las siguientes:
(i) Creación de ADN recombinante mediante la combinación de genes deseados.
(ii) Transferencia de genes.
(iii) Mantenimiento del ADN en el hospedador y clonación de genes.
Los pasos básicos de la ingeniería genética se pueden resumir como:
(i) Identificación de ADN con genes deseables.
(ii) Introducción del ADN identificado en el hospedador.
(iii) Mantenimiento del ADN introducido en el hospedador hrtd transferencia del ADN a su progenie.
4. Construcción del primer ADN recombinante artificial
(i) Se logró uniendo un gen que codifica la resistencia a los antibióticos con un plásmido nativo (un ADN extracromosómico circular de replicación autónoma) de Salmonella typhimurium.
(ii) Stanley Cohen y Herbert Boyer lograron esto en 1972.
(iii) Aislaron el gen de resistencia a los antibióticos cortando un fragmento de ADN de un plásmido.
(iv) El corte de ADN en ubicaciones específicas se llevó a cabo mediante tijeras moleculares, es decir, enzimas de restricción.
(v) El fragmento de ADN cortado se unió luego al ADN plasmídico con la enzima ADN ligasa. El ADN plasmídico actúa como vector para transferir el fragmento de ADN adherido a él.
(vi) Cuando este ADN se transfiere a E. coli, podría replicarse utilizando la enzima ADN polimerasa del nuevo huésped y realizar múltiples copias.
(vii) Esta capacidad de multiplicar copias del gen de resistencia a antibióticos en E. coli se denominó clonación del gen de resistencia a antibióticos en E. coli.
5. Las herramientas de la tecnología del ADN recombinante son las siguientes:
(i) Enzimas de restricción (ii) Enzimas polimerasas
(iii) Ligasas (iv) Vectores
(v) Organismo huésped competente.
6. Se utilizan enzimas de restricción o "tijeras moleculares" para cortar el ADN.
(i) En 1963 se aislaron dos enzimas de E. coli que eran responsables de restringir el crecimiento de bacteriófagos, una de ellas agregó grupo metilo al ADN y la otra cortó el ADN en segmentos. La última se denominó endonucleasa de restricción.
(ii) La primera endonucleasa de restricción Hind II fue aislada por Smith Wilcox y Kelley (1968). Descubrieron que siempre cortaba las moléculas de ADN en un punto particular al reconocer una secuencia específica de seis pares de bases conocida como secuencia de reconocimiento.
(iii) Además de Hind II, ahora se han aislado más de 900 enzimas de restricción, de más de 230 cepas de bacterias, cada una de las cuales reconoce diferentes secuencias de reconocimiento.
(iv) Denominación de las enzimas de restricción
(a) La primera letra se deriva del nombre del género y las dos siguientes letras del nombre de la especie de la célula procariota de la que se extraen las enzimas.
(b) Los números romanos después del nombre muestran el orden en el que se aislaron las enzimas de la cepa bacteriana.
Por ejemplo, Eco RI proviene de Escherichia coli RY13 y Eco RII proviene de E. coli R 245, etc.
(v) Las enzimas de restricción pertenecen a una clase de enzimas llamadas nucleasas.
Las nucleasas son de dos tipos:
Exonucleasas Eliminan nucleótidos de los extremos.
Endonucleasas Cortan en posiciones específicas dentro del ADN.
(a) Cada endonucleasa de restricción reconoce una secuencia de nucleótidos palindrómica específica en el ADN.
(b) El palíndromo en el ADN es a. secuencia de pares de bases que se lee igual en las dos cadenas cuando la orientación de la lectura se mantiene igual.
Por ejemplo, la siguiente secuencia se lee igual en las dos cadenas en la dirección 5 ′ - & gt 3 ′ así como en la dirección 3 ′ - & gt 5 ′.
5 ′ - GAATTC - 3 ′
3 ′ - CTTAAG - 5 ′
(vi) Mecanismo de acción de las enzimas de restricción

(a) Las enzimas de restricción cortan la hebra de ADN un poco lejos del centro de los sitios palíndromos, pero entre las mismas dos bases en las hebras opuestas.
(b) Esto deja porciones monocatenarias en los extremos.
(c) Hay tramos que sobresalen llamados extremos pegajosos en cada hebra como se muestra en la figura anterior. Estos se denominan así porque forman enlaces de hidrógeno con sus contrapartes de corte complementario.
(d) La pegajosidad de los extremos facilita la acción de la enzima ADN ligasa.
(e) Las endonucleasas de restricción se utilizan en ingeniería genética para formar moléculas recombinantes de ADN, que se componen de ADN de diferentes fuentes / genomas.
(f) Estos extremos pegajosos son complementarios entre sí cuando se cortan con la misma enzima de restricción, por lo tanto, se pueden unir (de un extremo a otro) utilizando ligasas de ADN.
7. Separación y aislamiento de fragmentos de ADN
(i) El corte de ADN mediante endonucleasas de restricción da como resultado fragmentos de ADN.
(ii) La técnica, que separa los fragmentos de ADN en función de su tamaño, se denomina electroforesis en gel.
(iii) Los fragmentos de ADN son moléculas cargadas negativamente. Se pueden separar forzándolos a moverse hacia el ánodo bajo un campo eléctrico a través de un medio / matriz.
(iv) El medio más comúnmente utilizado es la agarosa, un polímero natural extraído de las algas marinas.
(v) Los fragmentos de ADN se separan (resuelven) según su tamaño mediante el efecto de tamizado proporcionado por el gel de agarosa. Cuanto más pequeño es el tamaño del fragmento, más se mueve.

(vi) Los fragmentos de ADN separados se pueden visualizar solo después de teñir el ADN con un compuesto conocido como bromuro de etidio seguido de exposición a radiación UV.
(vii) Los fragmentos de ADN pueden verse como bandas de color naranja brillante. Estas bandas separadas se cortan del gel de agarosa y se extraen de la pieza de gel. A esto se le llama elución.
(viii) Los fragmentos de ADN purificados se pueden usar para construir ADN recombinante uniéndolos con vectores de clonación.
8. Clonación de vectores son las moléculas de ADN que pueden transportar un segmento de ADN extraño al interior de la célula huésped.
(i) Los vectores utilizados en la tecnología del ADN recombinante pueden ser:
(a) Plásmidos que replican de forma autónoma ADN extracromosómico circular.
(b) Bacteriófagos Virus que infectan bacterias.
(c) Cósmidos Vectores híbridos derivados de plásmidos que contienen el sitio cos del fago X.
(ii) El número de copias se puede definir como el número de copias de vectores presentes en una celda.
(iii) Los bacteriófagos tienen un alto número por célula, por lo que su número de copias también es alto en el genoma.
(iv) Los plásmidos tienen solo una o dos copias por celda.
(v) El número de copias puede variar de 1 a 100 o más de 100 copias por celda.
(vi) Si un fragmento de ADN ajeno está vinculado con un bacteriófago o un plásmido de ADN, su número se puede multiplicar por el número de copias del plásmido o bacteriófago.
(vii) Funciones necesarias para facilitar la clonación en vector
(a) Origen de la replicación (Ori) (b) Marcador seleccionable
(c) Sitios de clonación (d) Vectores para clonar genes en plantas y animales.
(a) El origen de la replicación (Ori) es una secuencia desde donde comienza la replicación.
• Cualquier fragmento de ADN cuando se une a esta secuencia puede replicarse dentro de las células huésped.
La secuencia también es responsable de controlar el número de copias del ADN enlazado.
(ii) El marcador seleccionable ayuda a identificar y eliminar los no transformantes y permite selectivamente el crecimiento de los transformantes.
• La transformación es un proceso mediante el cual se introduce un fragmento de ADN en una bacteria huésped.
• Los genes que codifican la resistencia a antibióticos como ampicilina, cloranfenicol, tetraciclina o kanamicina, etc., son algunos marcadores seleccionables útiles para E. coli.

• La ligadura de ADN ajeno se lleva a cabo en un sitio de restricción presente en uno de los dos genes de resistencia a antibióticos. El ejemplo es ligar un ADN extraño en el sitio Bam HI del gen de resistencia a la tetraciclina en el vector pBR322.
- »Los plásmidos recombinantes perderán la resistencia a la tetraciclina debido a la inserción de ADN extraño. Pero, todavía se puede seleccionar de los no recombinantes colocando los transformantes en medio que contiene ampicilina.
- »Los transformantes que crecen en un medio que contiene ampicilina se transfieren luego a un medio que contiene tetraciclina.
- »Los recombinantes crecerán en un medio que contenga ampicilina, pero no en un medio que contenga tetraciclina.
Los no recombinantes crecerán en el medio que contiene ambos antibióticos.
En este ejemplo, un gen de resistencia a los antibióticos ayuda a seleccionar los transformantes, mientras que el otro gen de resistencia a los antibióticos se "inactiva debido a la inserción" de ADN extraño y ayuda en la selección de los recombinantes.
* La selección de recombinantes debido a la inactivación de antibióticos es un procedimiento engorroso, por lo que se desarrollan marcadores seleccionables alternativos que diferencian los recombinantes de los no recombinantes en función de su capacidad para producir color en presencia de un sustrato cromogénico.
- »En este método, se inserta un ADN recombinante dentro de la secuencia codificante de una enzima J3-galactosidasa.
- »Esto da como resultado la inactivación de la enzima P-galactosidasa (inactivación por inserción).
- & gt Las colonias bacterianas cuyos plásmidos no tienen inserto, producen color azul, pero otras no producen ningún color, cuando se cultivan en un sustrato cromogénico.
(c) Se requieren sitios de clonación para vincular el ADN extraño con el vector.
• El vector requiere muy pocos o únicos sitios de reconocimiento para las enzimas de restricción comúnmente utilizadas.
• La presencia de más de un sitio de reconocimiento dentro del vector generará varios fragmentos que conducirán a complicaciones en la clonación de genes.
(d) Son muchos los vectores para clonar genes en plantas y animales que se utilizan para clonar genes en plantas y animales.
• En plantas, el plásmido inductor de tumores (Ti) de Agrobacterium tumefaciens se utiliza como vector de clonación.
- »Agrobacterium tumefaciens es un patógeno de varias plantas dicotiledóneas.
- »Entrega un fragmento de ADN conocido como T-ADN en el plásmido Ti que 1 transforma las células vegetales normales en células tumorales para producir sustancias químicas
requerido por los patógenos.
• Los retrovirus, adenovirus y papilomavirus también se utilizan ahora como vectores de clonación en animales debido a su capacidad para transformar células normales en células cancerosas.
9. Organismo huésped competente (para la transformación con ADN recombinante) porque el ADN, al ser una molécula hidrófila, no puede atravesar las membranas celulares. Por lo tanto, las bacterias deben ser competentes para aceptar las moléculas de ADN.
(i) La competencia es la capacidad de una célula para absorber ADN extraño.
(ii) Los métodos para hacer que una célula sea competente son los siguientes.
a) Método químico En este método, la célula se trata con una concentración específica de | un catión divalente como el calcio para aumentar el tamaño de los poros en la pared celular.
Luego, las células se incuban con ADN recombinante en hielo, luego se colocan brevemente a 42 ° C y luego se vuelven a colocar en hielo. A esto se le llama tratamiento de choque térmico.
• Esto permite que las bacterias absorban el ADN recombinante.
(b) Métodos físicos En este método, se inyecta directamente un ADN recombinante en el núcleo de una célula animal mediante el método de microinyección.
• En las plantas, las células son bombardeadas con micropartículas de oro o tungsteno de alta velocidad recubiertas con ADN llamado método biolístico o de pistola genética.
(c) Los vectores patógenos desarmados cuando se les permite infectar la célula, transfieren el recombinante
ADN en el anfitrión.


Ver el vídeo: Funcionamiento de las enzimas de restricción (Mayo 2022).