Información

3.4: Reparación del ADN - Biología

3.4: Reparación del ADN - Biología


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Mantener la integridad de la información celular: reparación del ADN

En la última sección consideramos las formas en que las células enfrentan los desafíos asociados con la replicación de su ADN, un proceso vital para todas las células. Aunque la corrección de pruebas mediante ADN polimerasas aumenta en gran medida la precisión de la replicación, existen mecanismos adicionales en las células para garantizar aún más que el ADN recién replicado sea una copia fiel del original, y también para reparar el daño al ADN durante la vida normal de una célula.

Todo el ADN sufre daños con el tiempo, debido a la exposición a la radiación ultravioleta y a otras radiaciones, así como a varios productos químicos del medio ambiente. Incluso las reacciones químicas que ocurren naturalmente dentro de las células pueden dar lugar a compuestos que pueden dañar el ADN. Como ya sabe, incluso los cambios menores en la secuencia del ADN, como las mutaciones puntuales, a veces pueden tener consecuencias de gran alcance. Del mismo modo, el daño irreparable causado por la radiación, los productos químicos ambientales o incluso la química celular normal puede interferir con la transmisión precisa de información en el ADN. Mantener la integridad del "plano" de la célula es de vital importancia y esto se refleja en los numerosos mecanismos que existen para reparar errores y daños en el ADN.

Reparación de desajustes posteriores a la replicación

Anteriormente discutimos la corrección de pruebas mediante ADN polimerasas durante la replicación. ¿La corrección de pruebas elimina todos los errores cometidos durante la replicación? No. Si bien la corrección de pruebas reduce significativamente la tasa de error, las ADN polimerasas no corrigen todos los errores sobre la marcha. ¿Qué mecanismos existen para corregir los errores de replicación que se pasan por alto en la función de corrección de pruebas de las ADN polimerasas?

Los errores que se deslizan mediante la corrección de pruebas durante la replicación pueden corregirse mediante un mecanismo llamado reparación de desajustes. Si bien la tasa de error de la replicación del ADN es de aproximadamente uno en (10 ​​^ 7 ) nucleótidos en ausencia de reparación de desajustes, esto se reduce aún más de cien veces a uno en ) 10 ^ 9 ) nucleótidos cuando la reparación de desajustes es funcional .

¿Cuáles son las tareas a las que se enfrenta un sistema de reparación de desajustes? Debería:

  • Escanee el ADN recién creado para ver si hay bases mal emparejadas (por ejemplo, una G emparejada con una T)
  • Identifique y corte la región del desajuste.
  • Rellene correctamente el espacio creado por la escisión de la región de desajuste.

Es importante destacar que el sistema de reparación de desajustes debe tener un medio para distinguir la hebra de ADN recién creada de la hebra molde, si los errores de replicación se van a corregir correctamente. En otras palabras, cuando el sistema de reparación de desajustes encuentra un desajuste A-G, por ejemplo, debe saber si la A debe ser removida y reemplazada por una C o si la G debe ser removida y reemplazada por una T.

La reparación de desajustes ha sido bien estudiada en bacterias y se han identificado las proteínas involucradas. Los eucariotas tienen un sistema de reparación de desajustes que repara no solo los desajustes de una sola base, sino también las inserciones y deleciones. En las bacterias, las proteínas de reparación de errores de apareamiento están codificadas por un grupo de genes conocidos colectivamente como genes mut. Algunos de los componentes más importantes de la maquinaria de reparación de desajustes son las proteínas MutS, L y H. MutS actúa para reconocer el desajuste, mientras que MutL y MutH se reclutan en el sitio de desajuste mediante la unión de Mut S, para ayudar a cortar la región. que contiene el desajuste. Una ADN polimerasa y una ligasa llenan el espacio y unen los extremos, respectivamente.

Pero, ¿cómo distingue el sistema de reparación de desajustes entre la hebra original y la nueva de ADN? En las bacterias, la existencia de un sistema que metila el ADN en las secuencias GATC es la solución a este problema. E. coli tiene una enzima que agrega grupos metilo a las adeninas en las secuencias GATC. El ADN recién replicado carece de esta metilación y, por tanto, se puede distinguir de la hebra molde, que está metilada. En la Figura ( PageIndex {2} ), la hebra plantilla que se muestra en amarillo está metilada en las secuencias GATC. Las proteínas de reparación de desajustes reemplazan selectivamente la hebra que carece de metilación, que se muestra en azul en la figura, asegurando así que sean errores en la hebra recién creada los que se eliminen y reemplacen. Debido a que la metilación es el criterio que permite que el sistema de reparación de errores de emparejamiento elija la hebra que se repara, el sistema de reparación de errores de emparejamiento bacteriano se describe como dirigido por metilo.

Las células eucariotas no utilizan este mecanismo para distinguir la nueva hebra de la plantilla, y aún no se comprende cómo el sistema de reparación de errores de apareamiento en eucariotas "sabe" qué hebra reparar.

Sistemas para reparar daños en el ADN

En la sección anterior discutimos los errores que se cometen cuando se copia el ADN, donde se inserta la base incorrecta durante la síntesis de la nueva hebra. Pero incluso el ADN que no se replica puede dañarse o mutarse. Este tipo de daño no está asociado con la replicación del ADN, sino que puede ocurrir en cualquier momento.

¿Qué causa el daño al ADN? Algunas de las principales causas de daño al ADN son:

  • Radiación (por ejemplo, rayos ultravioleta a la luz del sol, en cabinas de bronceado)
  • Exposición a sustancias químicas dañinas (como el benzopireno en el escape de los automóviles y el humo del cigarrillo)
  • Reacciones químicas dentro de la célula (como la desaminación de la citosina para dar uracilo).

Esto significa que el ADN de sus células es vulnerable al daño simplemente por el tipo de acciones normales, como caminar al aire libre, estar en el tráfico o por las transformaciones químicas que ocurren en cada célula como parte de sus actividades diarias. (Naturalmente, el daño es mucho peor en situaciones en las que la exposición a la radiación o sustancias químicas dañinas es mayor, como cuando las personas usan repetidamente camas solares o fuman).

¿Qué tipo de daño causan estos agentes? La radiación puede causar diferentes tipos de daño al ADN. A veces, como ocurre con gran parte del daño causado por los rayos UV, dos bases de pirimidina adyacentes en el ADN se reticularán para formar dímeros de pirimidina (tenga en cuenta que estamos hablando de dos bases de pirimidina vecinas en la misma hebra de ADN). Esto se ilustra en la figura de la página anterior donde dos timinas adyacentes en una sola hebra de ADN se entrecruzan para formar un dímero de timina. La radiación también puede causar roturas en la columna vertebral del ADN.

Las sustancias químicas como el benzopireno pueden unirse a bases, formando abultados aductos de ADN en los que grandes grupos químicos se unen a bases en el ADN. La formación de aductos químicos puede distorsionar físicamente la hélice del ADN, lo que dificulta que las polimerasas de ADN y ARN copien esas regiones del ADN.

Las reacciones químicas que ocurren dentro de las células pueden hacer que las citosinas en el ADN se desaminen a uracilo, como se muestra en la Figura ( PageIndex {3} ).

Otros tipos de daño en esta categoría incluyen la formación de bases oxidadas como la 8-oxo-guanina. En realidad, estos no cambian la estructura física de la hélice de ADN, pero pueden causar problemas porque el uracilo y la 8-oxo-guanina se emparejan con bases diferentes que la citosina o guanina original, lo que lleva a mutaciones en la siguiente ronda de replicación.

¿Cómo reparan las células tal daño? Las células tienen varias formas de eliminar los tipos de daño descritos anteriormente, siendo la reparación por escisión una estrategia común. La reparación por escisión es un término general para el corte y la resíntesis de la región dañada del ADN. Hay un par de variedades de reparación por escisión:

Reparación por escisión de nucleótidos (NER)

Este sistema repara los daños causados ​​por productos químicos y los rayos UV. Como se muestra en la figura de la página anterior, en la reparación por escisión de nucleótidos, se reconoce el daño y se hace un corte a cada lado de la región dañada por una enzima llamada excinucleasa (que se muestra en verde). Luego se elimina una pequeña porción de la hebra de ADN que contiene el daño y una ADN polimerasa llena el espacio con los nucleótidos apropiados. El ADN recién creado se une al resto de la columna vertebral del ADN mediante la enzima ADN ligasa. En E. coli, la NER es realizada por un grupo de proteínas codificadas por los genes uvrABC. Como puede ver, NER es similar, en principio, a la reparación de desajustes. Sin embargo, en NER, la distorsión de la hélice, causada por el daño del ADN, indica claramente qué hebra del ADN necesita ser removida y reemplazada.

Reparación de escisión de base (BER)

BER se ocupa de situaciones como la desaminación de citosina a uracilo. Como se señaló anteriormente, las citosinas en el ADN a veces se desaminan para formar la base uracilo.

Debido a que las citosinas se emparejan con guaninas y los uracilos se emparejan con adenina, la conversión de citosina en uracilo en el ADN conduciría a la inserción de una A en la hebra recién replicada en lugar de la G que debería haber pasado frente a una C. Para evitar esto de suceder, los uracilos se eliminan del ADN mediante la reparación por escisión de bases.

En la reparación por escisión de bases, primero se elimina una sola base del ADN, seguido de la eliminación de una región del ADN que rodea la base faltante. Luego se repara la brecha.

La eliminación del uracilo del ADN se logra mediante la enzima uracilo ADN glicosilasa, que rompe el enlace entre el uracilo y el azúcar en el nucleótido.

La eliminación de la base de uracilo crea un espacio llamado sitio apirimidínico (sitio AP). La presencia del sitio AP desencadena la actividad de una endonucleasa AP que corta la columna vertebral del ADN.

Luego, se extrae y reemplaza una pequeña región del ADN que rodea el sitio del uracilo original.


Biología celular molecular

S. Sharma, S.C. Raghavan, en Enciclopedia de Biología Celular, 2016

Abstracto

Mantener la integridad genómica es imperativo para la supervivencia de un organismo. Entre los diferentes daños en el ADN, las roturas de doble hebra (DSB) se consideran las más perjudiciales, ya que pueden provocar la muerte celular si no se reparan o reordenamientos cromosómicos cuando se reparan incorrectamente, lo que lleva al cáncer. La unión de extremos de ADN no homólogo (NHEJ) y la recombinación homóloga (HR) son las principales vías de reparación de DSB en eucariotas superiores. El HR es un mecanismo preciso que utiliza una amplia homología, mientras que el NHEJ es propenso a errores, ya que utiliza una homología limitada o nula. NHEJ es un mecanismo de solución rápida y opera durante todo el ciclo celular. Durante NHEJ, el heterodímero de la proteína KU se recluta en los extremos del ADN seguido de ADN-PKcs en asociación con ARTEMIS, que procesa los DSB. Pol μ y / o λ llenan estos extremos, cuando es necesario, seguido de ligación con el complejo XLF-XRCC4-DNA Ligase IV. Otra vía de reparación conocida como NHEJ alternativo (A-NHEJ) o NHEJ de respaldo repara los DSB cuando las proteínas clave responsables del NHEJ clásico están ausentes o son defectuosas. La elección de la vía de reparación de DSB entre NHEJ y HR depende del ciclo celular, la resección del extremo y la estructura del extremo de DSB, que activan aún más varios sensores de daño del ADN. Recientemente se ha demostrado que la desregulación de la reparación de DSB representa una amenaza para la integridad genómica y, por tanto, puede utilizarse como diana terapéutica en el tratamiento del cáncer.


El cGAS nuclear suprime la reparación del ADN y promueve la tumorigénesis

La reparación precisa de las roturas de doble hebra del ADN mediante recombinación homóloga preserva la integridad del genoma e inhibe la tumorigénesis. La GMP-AMP sintasa cíclica (cGAS) es un sensor de ADN citosólico que activa la inmunidad innata al iniciar la cascada de señalización de IFN de tipo I STING-IRF3 1,2. El reconocimiento de micronúcleos rotos por cGAS vincula la inestabilidad del genoma con la respuesta inmune innata 3,4, pero se desconoce la posible participación de cGAS en la reparación del ADN. Aquí demostramos que cGAS inhibe la recombinación homóloga en modelos de ratón y humanos. El daño del ADN induce la translocación nuclear de cGAS de una manera que depende de la importina-α, y la fosforilación de cGAS en la tirosina 215 mediada por la tirosina quinasa linfoide B facilita la retención citosólica de cGAS. En el núcleo, cGAS se recluta para rupturas bicatenarias e interactúa con PARP1 a través de poli (ADP-ribosa). La interacción cGAS-PARP1 impide la formación del complejo PARP1-Timeless y, por lo tanto, suprime la recombinación homóloga. Demostramos que la eliminación de cGAS suprime el daño del ADN e inhibe el crecimiento tumoral tanto in vitro como in vivo. Concluimos que el cGAS nuclear suprime la reparación mediada por recombinación homóloga y promueve el crecimiento tumoral, y que cGAS, por lo tanto, representa un objetivo potencial para la prevención y la terapia del cáncer.


Replicación del ADN: notas sobre la replicación, reparación y recombinación del ADN

La replicación del ADN es una función autocatalítica del ADN. Por lo general, ocurre durante la fase S del ciclo celular cuando los cromosomas están en forma muy extendida. Como propusieron Watson y Crick, la replicación del ADN es semi-conservadora.

En la replicación semiconservativa, las dos hebras se separarían una de la otra, mantendrían su integridad y cada una sintetizaría, a partir del conjunto de nucleótidos, su hebra complementaria. El resultado sería que la molécula recién sintetizada llevaría o conservaría una de las dos cadenas de la molécula madre y la otra cadena se ensamblaría nuevamente. Existe evidencia suficiente para demostrar que el ADN de doble hebra realmente se replica mediante un método semiconservador.

Experimento de Meselson y Stahl & # 8217s (1958):

Estos trabajadores cultivaron Escherichia coli en un medio que contenía isótopos de 15 N. Después de que estos se hubieran replicado durante algunas generaciones en ese medio, ambas cadenas de este ADN contenían 15 N como constituyentes de purinas y pirimidinas. Cuando estas bacterias con 15 N se transfirieron a un medio de cultivo que contenía 14 N, se encontró que el ADN separado de la generación reciente de bacterias posee una hebra más pesada que la otra.

La hebra más pesada representa la hebra parental y la más ligera es la nueva sintetizada a partir del medio de cultivo, lo que indica un método semiconservador de replicación del ADN y excluye y rechaza los modelos conservadores y dispersivos de síntesis y replicación del ADN.

La réplica conservadora y la timidez no producirían moléculas de ADN con una constitución & # 8220híbrida & # 8221. Si la replicación fuera dispersa, se habría producido un desplazamiento del ADN de & # 8220 pesado a & # 8220 ligero & # 8221 a través de cada generación.

Estudios posteriores han verificado la conclusión de Meselson y Stahl & # 8217 de que la replicación del ADN es semiconservadora y la han extendido a muchos otros organismos, incluidas plantas y animales superiores.

Experimento de autorradiografía de Cairn & # 8217s:

Usó timina radiactiva o timidina tritiada. Cultivando E. coli en un medio de cultivo que contiene timidina tritiada, la radiactividad se incorporó a las moléculas de ADN hijas.

En la autorradiografía, la molécula de ADN duplicada muestra una horquilla de replicación y oscilación, el punto en el que dos cadenas se convierten en cuatro. Después de la primera replicación, se ve que la radiactividad se incorpora en solo una de las cadenas de ADN y se encuentra que ambas cadenas están marcadas después de la segunda replicación. Esto es compatible con los modos semiconservadores y conservadores de replicación del ADN.

J H. Taylor & # 8217s Los experimentos con las puntas de las raíces de Viciafaba (1957) también confirman el método semiconservador de replicación del ADN.

I. Replicación discontinua del ADN:

Okazaki sugirió que la síntesis de ADN procede simultáneamente en ambas cadenas de ADN utilizando la misma enzima ADN poli y timimerasa en forma de pequeños fragmentos aislados. Estos segmentos se conocen como piezas de Okazaki y constan de 1000-2000 nucleótidos. Estos se unen mediante la enzima polinucleótido ligasa, completando la formación de polinucleótidos y cadenas tímidas.

La síntesis discontinua de ADN está respaldada por un experimento autoradiográfico.

ii. Replicación unidireccional y bidireccional del ADN:

J. Cairns a partir de sus experimentos concluyó que la síntesis de ADN comienza en un punto fijo en los cromosomas y avanza en una dirección, pero experimentos recientes sugieren una réplica y timidez bidireccionales.

Levinthal y Cairns propusieron que durante la replicación, las dos cadenas no se separen completamente antes de la replicación. En su lugar, comienzan a descomprimirse en un extremo y simultáneamente los segmentos sin cremallera comienzan a atraer sus pares de nucleótidos. De esta manera, la descompresión de las hebras de ADN originales y la síntesis de hebras de ADN frescas van de la mano.

ADN polimerasa:

La ADN polimerasa es la principal enzima de la replicación del ADN. Su actividad fue demostrada por primera vez por Kornberg en 1956. Cataliza la adición covalente de desoxirribonucleótidos al 3 & # 8242-OH de un nucleótido preexistente llamado como cebador.

La enzima ADN polimerasa-1 ahora se considera una enzima reparadora del ADN en lugar de una enzima de replicación. Se sabe que esta enzima tiene cinco sitios activos, a saber, sitio de plantilla, sitio de cebador, sitio de escisión 5 & # 8217— & gt3 & # 8242 o exonucleasa, sitio de trifosfato de nucleósido y sitio de escisión 3 & # 8217— & gt5 & # 8242 (o 3 & # 8217— & gt5 & # 8242 sitio de exonucleasa).

ADN polimerasa I:

Interviene principalmente en la eliminación de cebadores de ARN de Okazaki o fragmentos precursores y en el llenado de los huecos resultantes debido a su capacidad de polimerización 5 & # 8217— & gt3 & # 8242. La enzima ADN polimerasa I también puede eliminar los dímeros de timina producidos debido a la irradiación UV y llenar el espacio debido a la escisión. A esto se le llama función de corrección o edición de esta enzima.

ADN polimerasa-II:

Esta enzima se parece a la ADN polimerasa-I en su actividad, pero es una enzima reparadora del ADN y provoca el crecimiento en la dirección 5 & # 8217— & gt 3 & # 8242, utilizando grupos 3 & # 8242-OH libres.

ADN polimerasa III:

Desempeña un papel esencial en la replicación del ADN. Es una enzima multimérica u holoenzima que tiene diez subunidades tales como α, β, ε, θ, г, y, δ, δ & # 8217, x y Ψ. Sin embargo, todas estas diez subunidades son necesarias para la replicación del ADN in vitro, y todas tienen funciones diferentes. Por ejemplo, la subunidad α tiene 3 & # 8217— & gt5 & # 8242 actividad de corrección o edición de exonucleasas. La enzima central comprende tres subunidades: α, β y θ. Las siete subunidades restantes aumentan la procesividad (procesividad significa rapidez y eficiencia con la que una ADN polimerasa extiende la cadena de crecimiento).

ADN polimerasa eucariota:

Se encuentra que Eukai yotes (por ejemplo, levadura, hígado de rata, células tumorales humanas) contienen los siguientes cinco tipos de ADN polimerasas:

(i) ADN polimerasa α:

Esta enzima de peso molecular relativamente alto también se denomina polimerasa citoplásmica o polimerasa grande. Se encuentra tanto en el núcleo como en el citoplasma.

Esta enzima también se llama polimerasa nuclear o polimerasa pequeña y se encuentra solo en vertebrados.

Esta enzima se llama polimerasa mitocondrial y está codificada en el núcleo.

Esta enzima se encuentra en células de mamíferos y es dependiente de PCNA para la procesividad de la síntesis de ADN (PCNA = antígeno nuclear de células en proliferación).

Anteriormente se conocía como ADN polimerasa 5II. Esta enzima es independiente de PCNA y se encuentra en células HeLa de mamíferos y en levaduras en ciernes.

La ADN polimerasa a grande es la enzima predominante de ADN polimerasa en las células eucariotas y durante mucho tiempo se creyó que era la única enzima involucrada en la replicación del ADN. Pero ahora una polimerasa más, a saber, la ADN polimerasa 8, también está involucrada en la replicación del ADN eucariota.

Cebadores de ADN:

Estas enzimas catalizan la síntesis de cebadores de ARN que son un requisito previo para el inicio de la replicación del ADN en la gran mayoría de organismos. Antes de que comience la replicación real del ADN, los segmentos cortos de oligonucleótidos de ARN, llamados cebadores de ARN o simplemente cebadores, deben ser sintetizados por la enzima ADN primasa utilizando ribonucleósidos trifosfatos.

Este cebador de ARN se sintetiza copiando una secuencia de bases particular de una hebra de ADN y se diferencia de una molécula de ARN típica en que, después de la síntesis, el cebador permanece unido por enlaces de hidrógeno a la plantilla de ADN.

Los cebadores tienen aproximadamente 10 nucleótidos de largo en eucariotas y se fabrican a intervalos en la hebra rezagada donde son alargados por la enzima ADN polimerasa para comenzar cada fragmento de okazaki. Estos cebadores de ARN se escinden más tarde y se rellenan con ADN con la ayuda del sistema de reparación de ADN en eucariotas.

En las bacterias, se sabe que dos enzimas diferentes sintetizan oligonucleótidos de ARN cebador y polimerasa de ARN # 8211 (en la cadena principal) y ADN primasa (en la cadena rezagada).

Polinucleótido ligasa:

Esta enzima es una enzima importante tanto en la replicación del ADN como en la reparación del ADN. La ADN ligasa cataliza la formación del enlace fosfodiéster entre el grupo 5 & # 8242-fosforilo de un nucleótido y el grupo 3-OH del vecino inmediato en el lado de una muesca en una hebra de ADN, por lo que sella las muescas en una hebra de ADN.

Las endonucleasas, particularmente las endonucleasas de restricción, también son importantes durante la replicación del ADN así como durante la reparación del ADN. Durante la replicación del ADN, una endouncleasa puede producir un corte en el origen para iniciar la replicación o puede inducir cortes para generar un giro para facilitar el desenrollamiento del ADN.

Enzimas involucradas en la apertura de la hélice de ADN:

Las ADN helicasas son enzimas de desenrollado dependientes de ATP que promueven la separación de las dos hebras parentales y establecen horquillas de replicación que se alejarán progresivamente del origen. El desenrollado de la hélice de ADN molde en una bifurcación de replicación podría, en principio, ser catalizado por dos helicasas de ADN, actuando en concierto, una a lo largo de la hebra principal y la otra a lo largo de la hebra retrasada.

Hebra desestabilizadora de hélice (también llamada proteínas de unión a ADN de hebra única o SSBP):

Detrás de la horquilla de replicación, se evita que las hebras simples de ADN se rebobine una sobre la otra (o que formen bucles de horquilla de doble hebra en cada hebra) por la acción de las proteínas SSB. Las proteínas SSB se unen a las cadenas de ADN expuestas sin cubrir las bases, que, por lo tanto, permanecen disponibles para el proceso de creación de plantillas.

Topoisomerasas (ADN girasas):

La acción de una helicasa introduce un superenrollamiento positivo en el ADN dúplex antes de la horquilla de replicación. Las enzimas, llamadas topoisomerasas, relajan el superenrollamiento al adherirse al dúplex transitoriamente del superenrollamiento, cortando una de las hebras y haciéndola girar a través de la hebra intacta. A continuación, se vuelve a sellar la muesca.

Un tipo de topoisomerasa (es decir, topoisomerasa I) causa una rotura o muesca de una sola hebra que permite que las dos secciones de la hélice de ADN a cada lado de la muesca giren libremente entre sí, utilizando el enlace fosfodiéster en la hebra opuesta a la muesca como un punto giratorio. Un segundo tipo de topoisomerasa (es decir, topoisomerasa II) forma un enlace covalente a ambas hebras de la hélice de ADN al mismo tiempo, lo que hace que la doble hebra transitoria se rompa en la hélice.

Un replicón es la unidad de ADN en la que tienen lugar los actos individuales de replicación, es decir, es capaz de replicar el ADN independientemente de otros segmentos de ADN. Por lo tanto, cada replicón tiene un origen en el que se inicia la replicación y puede tener un término en el que se detiene la replicación.

Los cromosomas bacterianos y virales generalmente contienen un solo replicón / cromosoma. Aunque el fago T tiene dos orígenes, uno primario y otro secundario, pero en presencia de un origen primario, el origen secundario es, por regla general, no funcional. En E. coli, el punto de origen se identifica como locus genético oriC.

Un origen procariótico completo apoya las siguientes tres funciones: (1) inicio de la replicación, (2) control de la frecuencia de los eventos de iniciación y (3) la segregación de los cromosomas replicados en las células hijas.

Se han identificado orígenes en bacterias, levaduras, cloroplastos y mitocondrias, su característica general más importante es que son ricos en A: T, lo que puede ser importante para la facilidad de desenrollado durante la replicación. El origen bacteriano contiene muchos sitios cortos diferentes (& lt 10 pb) que son necesarios para su función. Estos sitios a veces están separados por distancias específicas pero no por secuencias específicas. Estos sitios ubicados específicamente son necesarios para la unión de diferentes proteínas involucradas en la replicación del ADN.

Varios replicones procariotas tienen sitios específicos, llamados terminales, que detienen el movimiento de la horquilla de replicación y, por lo tanto, terminan la replicación del ADN. El cromosoma de E. coli tiene dos extremos, llamados T1 y T2 ubicado a unos 100 Kb a cada lado del punto donde se encontrarían las horquillas de réplicas. Cada término es específico para una dirección de movimiento de la horquilla.

La t1 y T2 están dispuestos de tal manera que cada bifurcación debe pasar por encima de la otra para llegar al final específico de la misma. La terminación de la replicación requiere el producto del gen tus, que probablemente codifica una proteína que reconoce T y T2.

En eucariotas, cada cromosoma tiene varios replicones (p. Ej., Levadura, 500 Drosophila, 3500 de ratón 25000 Viciafaba, 35000). En cualquier punto dado durante la fase S, solo algunos de estos replicones experimentan replicación, cada replicón parece activarse en un momento específico en una secuencia específica. La longitud de un replicón eucariota puede variar desde 40 Kb en levadura y Drosophila hasta aproximadamente 300 Kb en Vicia.

El número de replicones detectables parece variar con la etapa de desarrollo y el tipo de célula o tejido. Esto se explica sobre la base de los orígenes específicos de los tejidos, de modo que algunos orígenes están activos en algunos tejidos, mientras que otros están activos en algunos otros tejidos.

Esto se ejemplifica en Drosophila, donde las células embrionarias tempranas tienen 10 veces más replicones que las de las células somáticas adultas. La evidencia disponible sugiere que los replicones eucariotas no tienen terminales.

Fidelidad de replicación:

La tasa de error de la replicación del ADN es mucho menor que la de la transcripción debido a la necesidad de preservar el significado del mensaje genético de una generación a la siguiente. Por ejemplo, la tasa de mutación espontánea en E. coli es de aproximadamente un error por cada 10 10 bases incorporadas durante la replicación.

Esto se debe principalmente a la presencia de formas tautoméricas menores de las bases que tienen propiedades de apareamiento de bases alteradas. La tasa de error se minimiza mediante una variedad de mecanismos. Las ADN polimerasas solo incorporarán un nucleótido entrante si forma el par de bases correcto con el nucleótido molde en su sitio activo.

El error ocasional es detectado por la exonucleasa de corrección de pruebas 3 & # 8217— & gt5 & # 8242 asociada con la polimerasa. Esto elimina el nucleótido incorrecto del extremo 3 & # 8242 antes de cualquier incorporación adicional, permitiendo que la polimerasa inserte la base correcta. Para que la exonucleasa de corrección de pruebas funcione correctamente, debe poder distinguir un par de bases correcto de uno incorrecto.

La mayor movilidad de los pares de bases & # 8216 no anclados & # 8217 en el extremo 5 & # 8242 de los fragmentos de hebra rezagada de ADN recién iniciados significa que nunca pueden parecer correctos y, por lo tanto, no se pueden corregir. Por lo tanto, los primeros nucleótidos son ribonucleótidos (ARN) de modo que posteriormente puedan identificarse como material de baja fidelidad y reemplazarse con ADN alargado (y corregido) del fragmento adyacente. Los errores que escapan a la corrección de pruebas se corrigen mediante un mecanismo de reparación de discrepancias.

Mecanismo de replicación del ADN en procariotas:

La replicación del ADN in vitro se ha estudiado ampliamente en E. coli y en los fagos y plásmidos de E. coli. En E. coli, el proceso de replicación del ADN implica los siguientes tres pasos principales:

1. Inicio de la replicación del ADN:

Este proceso comprende tres pasos: (i) reconocimiento del origen (O), (ii) apertura del dúplex de ADN para generar una región de ADN monocatenario y (iii) captura de la proteína B del ADN (es decir, 5 & # 8242 3 & # La helicasa 8242 también actúa como activador de la primasa). Por lo tanto, el complejo ATP de ADN-A (o proteína iniciadora) se une a regiones repetidas invertidas de 9 pb (R ,, R ,, Rv R4) de ori C de E. coli y promueve la apertura del dúplex de ADN en una región de tres repeticiones directas de la secuencia de 13 pb (llamadas 13-meros).

La apertura ocurre desde la derecha 13-mer hacia la izquierda y requiere ADN superenrollado negativamente y proteínas iniciadoras HU o IHF. El ADN B (-helicasa) se transfiere al ADN monocatenario expuesto y provoca el desenrollamiento del ADN en presencia de A TP, proteína SSB y ADN girasa (una topoisomerasa).

Esto da como resultado el desenrollamiento del dúplex de ADN y la replicación de ori C procede en ambas direcciones (bidireccional). La unión de SSB se produce en regiones monocatenarias y se cargan dos complejos de ADN B (= primosomas) uno en cada cadena.

2. Alargamiento de la cadena de ADN:

Este paso requiere la presencia de las siguientes enzimas y factores: 1. ADN B o helicasa (también llamado promotor móvil) 2. primasa (ADN G) 3. ADN polimerasa holoenzima (o ADN pol III HE) 4. Proteína SSB 5. ARNasa H que elimina los cebadores de ARN 6. ADN polimerasa I que se utiliza para llenar el espacio creado debido a los cebadores de ARN y 7. ADN ligasa (que convierte fragmentos de okazaki sin cebador en una hebra continua). Durante el inicio de la transición de alargamiento, ocurren los siguientes eventos:

(i) A medida que la helicasa (o ADN B) viaja en la dirección 5 & # 8242 - & gt 3 & # 8242, genera una bifurcación de replicación abriendo el dúplex de ADN.

(ii) La hebra de ADN que tiene helicasa se convierte en la hebra retrasada. La ADN primasa se asocia con la Dna B helicasa, formando el primosoma que sintetiza múltiples cebadores para la hebra rezagada y un cebador de ARN único para la hebra principal.

(iii) Para la síntesis de la hebra rezagada, el ADN pol III HE tiene que trabajar en la misma hebra a la que se une la helicasa de ADN B, pero viaja en dirección opuesta.

(iii) DnaB helicasa, Dna Gprimase y DNA pol III FIE trabajan juntos en el alargamiento de la hebra. El ensamblaje de la helicasa y la ADN polimerasa permanece en proceso, es decir, permanecen fuertemente unidos a la horquilla y permanecen unidos durante toda la reacción.

La síntesis (- alargamiento) de las hebras rezagadas y principales se lleva a cabo mediante métodos algo diferentes; es mucho más complejo para la hebra rezagada que para la hebra principal:

(A) Síntesis discontinua en la hebra rezagada:

1. La primasa se extrae de la solución y es activada por la helicasa (DnaB) para sintetizar un cebador de ARNa (de 10 a 20 nt o nucleótidos de longitud) en la hebra rezagada.

2. Los cebadores de ARN son reconocidos por ADN pol III HE en la hebra rezagada y se utilizan para la síntesis de precursores o fragmentos de okazaki. De hecho, cada nuevo cebador de ARN es reconocido por la subunidad gamma (y) del ADN pol III HE y cargado con la subunidad p de la misma polimerasa. Esta subunidad p precargada puede capturar el núcleo del ADN poli III HE cuando esté disponible después de terminar su trabajo sintético en el fragmento de okazaki anterior.

3. Una vez finalizados los fragmentos de okazaki, los cebadores de ARN son escindidos por la ADN polimerasa 1, que luego llena los huecos resultantes con ADN.

4. Después de que la ADN polimerasa I agrega los desoxirribonucleótidos finales en el espacio dejado por el cebador escindido, la enzima ADN ligasa forma el enlace fosfodiéster que une el extremo libre 3 & # 8242 del reemplazo del cebador al extremo 5 & # 8242 del fragmento okazaki.

(B) Síntesis continua en la hebra principal:

1. En la replicación bidireccional del ADN, la hebra principal se ceba una vez en cada una de las hebras parentales.

2. El cebador de ARN de la cadena principal es sintetizado por la enzima ARN polimerasa.

3. El ADN pol III HE provoca el alargamiento de la hebra principal y finalmente las enzimas ADN pol 1 y ligasa dan el toque final a la hebra principal como en el caso de la hebra rezagada.

Replicación del ADN en eucariotas:

La replicación del ADN eucariota requiere dos enzimas ADN polimerasa diferentes, a saber, ADN polimerasa ay ADN polimerasa δ. La ADN polimerasa δ sintetiza el ADN en la cadena principal (síntesis de ADN continua), mientras que la ADN polimerasa a sintetiza el ADN en la cadena retrasada (síntesis de ADN discontinua). Además de estas dos enzimas, la replicación del ADN: (1) antígeno T (2) factor de replicación A o RF-A (también llamado RP-A o SSB eucariota) (3) topoisomerasa I (4) topoisomerasa II (5) proliferando & # 8211 antígeno nuclear celular (PCNA, también llamado ciclina) y (6) factor de replicación Cor RF-C.

El proceso de replicación del ADN eucariota implica los siguientes pasos:

1. Antes del inicio de la síntesis de ADN, hay una etapa presintética de 8 a 10 minutos de duración para la formación del complejo de ADN desenrollado. Este paso solo necesita tres proteínas purificadas, a saber, el antígeno T (T-ag o antígeno tumoral), RF-A y topiosomerasas I y II.

2. El antígeno T, utilizando su dominio de unión al ADN, forma un complejo de múltiples subunidades con el sitio I y el sitio II en presencia de A TP y provocó el desenrollamiento local.

3. Se produce un desenrollamiento dúplex más extenso debido a la asociación de RF-A y una topoisomerasa con la ayuda del componente helicasa de ADN de T-ago. Las topoisomerasas ayudan a desenrollar el ADN alterando la topología del ADN en la horquilla de replicación.

4. Las proteínas RF-A o SSB se unen al ADN monocatenario desenrollado.

5. La síntesis de ARN del cebador se realiza mediante primasa que está estrechamente asociada con la ADN polimerasa ex.

6. La ADN polimerasa a ayuda en la síntesis de un fragmento de okazaki en la dirección 5 & # 8242 a 3 & # 8242.

7. El factor de replicación C (o RF-C) y el PCNA (ciclina) ayudan a cambiar las ADN polimerasas de modo que pol a se reemplaza por pol 5 que luego sintetiza continuamente el ADN en la cadena principal.

8. A continuación, se sintetiza otro fragmento de okazaki a partir de la horquilla de replicación en la hebra rezagada por el complejo pol a & # 8211 primasa y este paso se repite una y otra vez, hasta que se cubre toda la molécula de ADN.

9. Se eliminan los cebadores de ARN y se rellenan los huecos como en la replicación del ADN procariota.

Recientemente, se ha destacado el papel de la ADN polimerasa e en la replicación del ADN, de modo que ahora se sabe que tres ADN polimerasas (a, δ y ε) están implicadas en la replicación del ADN eucariota. A. Sugino y colaboradores han propuesto que la ADN polimerasa a podría funcionar tanto en las cadenas principales como en las rezagadas (ya que la polimerasa a tiene actividad α primasa), mientras que la polimerasa e y la polimerasa 5 están involucradas en el alargamiento de las cadenas principales y rezagadas, respectivamente.

Mecanismo de reparación y daño del ADN

1. Lesiones de ADN:

Una alteración en la estructura química o física normal del ADN se denomina lesiones de ADN. Muchos agentes exógenos, como los productos químicos y la radiación, pueden provocar cambios en las posiciones de los átomos de nitrógeno y carbono en los sistemas de anillos heterocíclicos de las bases y algunos de los grupos funcionales exocíclicos (es decir, los grupos ceto y amino de las bases).

Esto puede conducir a la pérdida del emparejamiento de bases o al emparejamiento de bases alterado (por ejemplo, una A alterada puede emparejar bases con C en lugar de T). Si se permite que una lesión de este tipo permanezca en el ADN, una mutación puede fijarse en el ADN mediante mutagénesis directa o indirecta.

Alternativamente, el cambio químico puede producir una distorsión física en el ADN que bloquea la replicación y / o transcripción, causando la muerte celular. Por tanto, las lesiones de ADN pueden ser mutagénicas y / o letales. Algunas lesiones son espontáneas y tímidas y ocurren debido a la reactividad química inherente del ADN y la presencia de especies químicas reactivas normales dentro de la célula.

Por ejemplo, la citosina base sufre una desaminación hidrolítica espontánea para dar uracilo. Si no se repara, el uracilo resultante formaría un par de bases con la adenina durante la replicación posterior, dando lugar a una mutación puntual. La depuración es otra reacción hidrolítica espontánea que implica la escisión del enlace N-glicosílico entre N-9 de las bases purínicas A y G y C-I & # 8217 del azúcar desoxirribosa y, por tanto, la pérdida de las bases purínicas del ADN. La columna vertebral de azúcar-fosfato del ADN permanece intacta. El sitio apurínico resultante es una lesión no codificante, ya que se pierde la información codificada en las bases de purina.

2. Daño oxidativo:

Esto ocurre en condiciones normales debido a la presencia de especies reactivas de oxi y shygen (ROS) en todas las células aeróbicas, por ejemplo, superóxido, peróxido de hidrógeno y, lo más importante, el radical hidroxilo (OH). Este radical puede atacar al ADN, I en varios puntos, produciendo una gama de productos de oxidación con propiedades II alteradas, por ejemplo, 8-oxoguanina, 2-oxoadenina y 5-formiluracilo. Los niveles de estos pueden incrementarse por radicales hidroxilo de la radiólisis del agua provocada por la radiación ionizante.

3. Alquilación:

Los agentes alquilantes son productos químicos electrofílicos que añaden fácilmente grupos alquilo (por ejemplo, metilo) a varias posiciones en ácidos nucleicos distintos de los metilados por enzimas metilantes normales. Los ejemplos comunes son metilmetanosulfonato (MMS) y etilnitrosourea (ENU).

Los ejemplos típicos de bases metiladas son 7-metilguanina, 3-metil-adenina, 3-metilguanina y 0 6 -metilguanina. Algunas de estas lesiones son potencialmente letales, ya que pueden interferir con el desenrollamiento del ADN durante la replicación y la transcripción. La mayoría son también indivisamente mutagénicas; sin embargo, la 0 6 -metilguanina es una lesión directamente mutagénica ya que puede emparejarse con timina durante la replicación.

4. Aductos voluminosos:

Los dímeros de ciclobutano pirimidina se forman por luz ultravioleta de pirimidinas adyacentes en una hebra por ciclación de los átomos de carbono C5 y C6 de doble enlace de cada base para dar un anillo de ciclobutano. La pérdida resultante del emparejamiento de bases con la hebra opuesta provoca la desnaturalización localizada del ADN produciendo una lesión voluminosa que interrumpiría la replicación y la transcripción. Otro tipo de dímero de pirimidina, el fotoproducto 6, 4, resulta de la formación de un enlace entre C6 de una base de pirimidina y C4 de la base adyacente.

Cuando el carcinógeno de alquitrán de hulla benzo [a] pireno es metabolizado por el citocromo P-450 en el hígado, uno de sus metabolitos (un diol epóxido) puede unirse covalentemente al grupo 2-amino de residuos de guanina. Muchos otros agentes arilantes aromáticos forman aductos covalentes con el ADN. El carcinógeno hepático aflatoxina B también se une covalentemente al ADN.

Reparación de ADN:

Los sistemas de reparación reconocen una variedad de cambios en el ADN para iniciar la acción. Una célula puede tener varios sistemas para lidiar con el daño del ADN. Estos sistemas incluyen lo siguiente: (1) Reparación directa, (2) Reparación de escisión (3) Reparación de desajustes, (4) Sistemas tolerantes y (5) Sistemas de recuperación.

1. Reparación directa:

La reversión o simple eliminación del daño al ADN se conoce como reparación directa, por ejemplo, eliminación de los enlaces covalentes entre los dos carbonos 4 y 2 5 de los dos residuos de timina que participan en la formación de dímeros de timina.

Los dímeros de timina se forman generalmente debido a la irradiación UV e interfieren con la replicación y la transcripción. Kelner (1949) observó que un gran número de bacterias podrían sobrevivir a grandes dosis de radiación ultravioleta si estuvieran expuestas a una fuente de luz visible poco intensa.

Este fenómeno se llama fotorreactivación.Más tarde se demostró que durante la irradiación UV una enzima particular se une selectivamente al ADN bacteriano. Durante el proceso de fotorreactivación, la enzima es activada por la luz visible. Escinde los dímeros de timina, devolviéndolos a su forma original. Este proceso de reparación está mediado por enzimas y depende de la luz.

2. Reparación de escisión:

En este mecanismo de reparación, el segmento dañado o alterado de la cadena de ADN se escinde y se sintetiza un nuevo parche de ADN en su lugar. Aunque los sistemas de reparación por escisión y los elementos tímidos varían en su especificidad, la vía principal implica los siguientes tres pasos:

(i) Reconocimiento e Incisión:

La sección dañada / alterada de una hebra de ADN es reconocida por una endonucleasa, esta enzima luego corta la hebra afectada en ambos lados del daño.

Una exonucleasa 5 & # 8242 & # 8211 & gt 3 & # 8242 (ADN polimerasa I) digiere la sección dañada / alterada, lo que genera una región monocatenaria en la doble hélice del ADN.

En este paso, la región monocatenaria producida por escisión sirve como molde para una ADN polimerasa que sintetiza el reemplazo del segmento extirpado. La ADN ligasa luego sella la muesca que queda después de la síntesis del reemplazo para la sección extirpada.

En E. coli, lo más probable es que la escisión se deba a la actividad exonucleasa 3 & # 8242 & # 8211 & gt 5 & # 8242 de la ADN polimerasa I, mientras que la síntesis se realiza mediante la actividad polimerasa 5 & # 8242 & # 8211 & gt 3 & # 8242 de la misma enzima. Los sistemas de reparación por escisión son bastante comunes tanto en procariotas como en eucariotas. Algunos de estos sistemas y tímidos reconocen el daño general al ADN, mientras que otros son muy específicos, por ejemplo, las endonucleasas AP eliminan los residuos de ribosa de los sitios de depurinación. La reparación por escisión involucra diferentes longitudes de ADN y se agrupa en las siguientes tres clases:

(a) Reparación de parche muy corto (VSP):

Este sistema se ocupa de la reparación de desajustes entre bases específicas.

En este sistema se escinde una hebra de ADN de aproximadamente 20 bases de longitud y los daños se reparan mediante genes uvr (uvr, A, B, C, de E. coli), que codifican componentes de una endonucleasa reparadora. También se necesita otra enzima uvr D para la actividad helicasa.

Este sistema implica la escisión de segmentos de aproximadamente 1500 bases de longitud, pero a veces el segmento extirpado puede tener & gt 9000 bases. Es mucho menos común y tiene que ser inducido por un daño que bloquea la replicación. En E. coli, este sistema también involucra los genes uvr y la ADN polimerasa I.

3. Reparación de desajustes:

Implica la corrección de desajustes o emparejamientos entre bases que no son complementarias. Los desajustes pueden surgir (a) durante la replicación o (b) debido a alteraciones de bases (por ejemplo, desaminación de citosina a uracilo) y dan como resultado distorsiones estructurales en la doble hélice del ADN. Estas alteraciones se manejan en E. coli mediante el sistema de reparación por escisión de parche muy corto que se describe a continuación.

Sistema de reparación de desajustes en E. coli:

Cuando hay un desajuste en un par de bases como en GC - & gt GT, entonces teóricamente puede repararse para dar lugar a un tipo salvaje (GC) o un tipo mutante (AT). Por lo tanto, el sistema de reparación tiene que distinguir entre hebras nuevas y viejas y reparar solo la hebra nueva para restaurar el tipo salvaje.

Esto se realiza mediante un sistema de reparación por escisión de parche muy corto y requiere cuatro proteínas, a saber, Mut L, Mut S, Mut U y Mut H codificadas en E. coli respectivamente por los genes mut L, mut S, mut U y mut H. Los errores de desajuste producidos durante la replicación se corrigen mediante el sistema de reparación de presas.

El gen madre de E. coli produce una metilasa que metila la adenina de secuencia GATC en ambas cadenas de ADN. La replicación de una secuencia GATC completamente metilada produce una secuencia hemimetilada en la que los residuos A en las hebras recién sintetizadas no están metilados.

El estado no metilado de esta secuencia diana se usa para identificar la nueva hebra, las bases alrededor del sitio de desajuste en la nueva hebra se escinden y se sintetiza un reemplazo. El sistema involucra los productos de los genes mut L, mut S, mut H y uvr D.

Reparaciones de sistemas de recuperación:

Estos sistemas también se conocen como & # 8216 reparación posterior a la replicación & # 8217 o & # 8216 reparación combinada & # 8217. En E. coli, este sistema de reparación se basa en el gen rec A que produce la proteína Rec A. La proteína Rec A funciona en el intercambio de hebras entre moléculas de ADN durante la recombinación genética y también funciona en el intercambio de hebras simples durante la reparación de la recombinación. Parece haber dos vías rec A, una que involucra a los genes rec B, C y la otra a rec F.

Este sistema de reparación opera cuando una distorsión estructural bloquea la replicación en el sitio dañado. Por ejemplo, los mutantes de E. coli deficientes en la reparación por escisión no podrán eliminar los dímeros de timina. En tal situación, la replicación procede normalmente hasta los sitios dañados, la ADN polimerasa detiene la replicación de la hebra afectada y reinicia la replicación saltando más allá del sitio dañado.

La hebra complementaria se replica normalmente en el sitio dañado de la otra hebra. Por lo tanto, la replicación produce una progenie normal de molécula de ADN y una molécula que tiene el dímero de timina en una hebra y un espacio largo en su hebra complementaria. La molécula de ADN de la progenie con dímero de timina se perdería a menos que se repare llenando el espacio en una de sus hebras.

Esto se logra mediante el intercambio de una sola hebra entre las dos moléculas de ADN de la progenie, la región de intercambio llena el espacio y es inducida por la proteína Rec A. Como resultado de este intercambio, la molécula de la progenie normal tiene una región monocatenaria que tiene un hueco. Esta brecha se repara mediante la síntesis de ADN.

Estos sistemas se ocupan de los daños que bloquean la replicación normal en el sitio dañado, posiblemente al permitir la replicación de los sitios dañados con una alta frecuencia de errores. Estos sistemas pueden ser particularmente importantes en los eucariotas, donde el tamaño del genoma es muy grande y, por lo tanto, es bastante improbable una reparación completa del daño.


Biología estructural de la reparación del ADN: organización espacial de los complejos multicomponente de unión de extremos no homólogos

La unión de extremos no homólogos (NHEJ) desempeña un papel importante en la reparación de la rotura del ADN de doble hebra, que implica una serie de pasos mediados por complejos multiproteicos. Un heterodímero Ku70 / Ku80 con forma de anillo se forma primero en los extremos rotos del ADN, la subunidad catalítica de la proteína quinasa dependiente del ADN (ADN-PKcs) se une para mediar en la sinapsis y las nucleasas procesan las protuberancias de ADN. La ADN ligasa IV (LigIV) se recluta como un complejo con XRCC4 para la ligadura, con XLF / Cernunnos, desempeñando un papel en la mejora de la actividad de LigIV. Describimos cómo una combinación de métodos (cristalografía de rayos X, microscopía electrónica y dispersión de rayos X de ángulo pequeño) puede brindar información sobre los complejos multicomponentes transitorios que median el NHEJ. Primero consideramos la organización del complejo DNA-PKcs / Ku70 / Ku80 / DNA (DNA-PK) y luego discutimos la evidencia emergente sobre LigIV / XRCC4 / XLF / DNA y complejos de orden superior. Concluimos discutiendo los roles de los sistemas multiproteicos en el mantenimiento de una alta relación señal-ruido y el valor de los estudios estructurales en el desarrollo de nuevas terapias en oncología y en otros lugares.

1. Introducción

La unión de extremos no homólogos (NHEJ) y la recombinación homóloga (HR) comprenden los dos modos principales de reparación de rotura de doble hebra del ADN (DSB) en células humanas. Aunque la HR es dominante en las fases tardías de S / G2 cuando hay una cromátida hermana disponible [1], NHEJ, que no requiere una plantilla [2], juega un papel importante en la fase G1 / S temprana [1]. Se predice que en los seres humanos pueden ocurrir alrededor de 50 DSB endógenos por célula durante cada ciclo celular [3]. Estos se generan principalmente por radiación ionizante, especies reactivas de oxígeno y replicación del ADN a través de una muesca [2]. Los DSB no reparados pueden causar una pérdida génica catastrófica durante la división celular, lo que da lugar a translocaciones cromosómicas, aumento de las tasas de mutación y carcinogénesis [4]. El sistema NHEJ también es responsable de los DSB programados en la recombinación V (D) J [5] y la recombinación de cambio de clase [6] durante el desarrollo de la diversidad inmunitaria. NHEJ tiene una vía alternativa de unión de extremos, que es principalmente unión de extremos mediada por microhomología [7] y es independiente de los componentes de NHEJ [8]. Aquí NHEJ implica la vía principal NHEJ.

La vía NHEJ comprende tres pasos principales: sinapsis, procesamiento final y ligadura [9]. La sinapsis se lleva a cabo mediante la proteína quinasa dependiente de ADN (ADN-PK) que consta de Ku70, Ku80, subunidad catalítica de ADN-PK (ADN-PKcs) y ADN. Ku70 y Ku80 forman un heterodímero en forma de anillo alrededor de los extremos rotos del ADN y los mantienen cerca [10, 11]. DNA-PKcs, una proteína muy grande que pertenece a la familia de las quinasas relacionadas con la fosfatidilinositol-3-OH quinasa (PI3K) (PIKK) [12], se recluta a través de la interacción con el extremo C-terminal de Ku80 [13, 14], y causa el heterodímero Ku70 / 80 se mueva alrededor de una vuelta helicoidal hacia adentro desde el extremo [15] para dejar espacio para que el ADN-PKcs se una al ADN. Probablemente se requieran dos conjuntos de ADN-PK para mantener juntos los dos extremos del ADN [16]. El ADN-PKcs activado se fosforila a sí mismo y a varias proteínas, incluidos los otros componentes del NHEJ [17, 18]. Synapsis induce la autofosforilación de ADN-PKcs y permite que otras proteínas NHEJ accedan a los extremos del ADN [19, 20].

El procesamiento final involucra nucleasas como Artemis [21], que es capaz de cortar una serie de protuberancias de ADN y se cree que es suficiente como nucleasa, aunque otras nucleasas en particular PNK, aprataxina (APTX) y PNK-APTX-like factor (PALF), a

exonucleasa, no puede descartarse [22]. Artemis interactúa con DNA-PKcs y abre horquillas de DNA en el proceso de recombinación V (D) J [23]. Mutaciones en Artemisa causa genética Inmunodeficiencia combinada grave radiosensible (RS-SCID) [21]. Polimerasas Pol

utilizan sus dominios BRCT para unirse a complejos Ku / ADN y la desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) se expresa exclusivamente en las células linfoides iniciales para participar en el NHEJ del proceso de recombinación V (D) J [24-26]. Además, como se demostró recientemente, Ku en su papel como liasa también participa en el procesamiento final del ADN de corte en sitios abásicos, lo que indica que esta proteína, al igual que su pareja ADN-PKcs, tiene propiedades enzimáticas y, por lo tanto, cumple una serie de funciones en la vía NHEJ [ 27].

El último paso de ligación de la unión está mediado por la ADN ligasa IV (LigIV), que está asociada con el grupo 4 de complementación cruzada de rayos X diméricos (XRCC4) [28]. Estas proteínas forman un complejo muy estable, que se mantiene en NaCl 2 M o urea 7 M [29]. XRCC4 estimula la actividad de adenilación y ligasa [30-32]. Los knockouts de estos genes en ratones dan como resultado la letalidad embrionaria tardía en la forma dependiente de p53 [33-36] mientras que las mutaciones en lig4 El resultado del gen es el síndrome LIG4 caracterizado por radiosensibilidad, rasgos faciales inusuales, microcefalia, retraso en el desarrollo y crecimiento, pancitopenia y anomalías cutáneas [37]. XRCC4-Like Factor (XLF) / Cernunnos (XLF), cuyas mutaciones en humanos causan inmunodeficiencia combinada severa, también interactúa con XRCC4 y mejora la ligadura por LigIV [38, 39].

Aquí revisamos lo que se conoce de las arquitecturas de los complejos multicomponentes transitorios que median la unión final no homóloga. La Figura 1 es un intento de construir un diagrama de interacción que resuma nuestra comprensión actual de las interacciones de la proteína NHEJ y la fosforilación por ADN-PKcs, indicando dónde está disponible la información estructural. Aunque la existencia de DNA-PK (el complejo entre DNA-PKcs, Ku heterodimérico y DNA) está claramente definida, al igual que el complejo estrecho entre XRCC4 y LigIV, la organización temporal y espacial de los complejos de orden superior no está clara. ¿Existen subcomplejos que permiten que Ku se separe del ADN antes de la ligadura, o hay un supercomplejo en el que coexisten ADN-PK, LigIV / XRCC4 y XLF para lograr la ligadura? En este caso, ¿cómo sale Ku cuando se ligan los extremos? En este artículo, primero consideramos lo que se sabe sobre la estructura de las enormes PKcs de ADN de cadena única y cómo esto podría conducir a una mejor comprensión del objetivo para su uso en el descubrimiento de fármacos guiado por la estructura. Luego discutimos la organización del complejo DNA-PKcs / Ku70 / Ku80 / DNA (conocido como DNA-PK), con el fin de arrojar luz sobre los eventos iniciales que tienen lugar en la vía NHEJ. Discutimos la evidencia emergente sobre las estructuras 3D de los complejos LigIV / XRCC4 / XLF / DNA, que deberían dar pistas sobre la unión y el mecanismo funcional de LigIV / XRCC4 y XLF en NHEJ. Finalmente, consideramos la disposición espacial de los complejos de orden superior para dar una imagen del sistema de reparación NHEJ en su conjunto.


Diagrama esquemático de interacciones de la maquinaria NHEJ. Las formas llenas de color indican las proteínas y los complejos con estructuras 3D conocidas. Las flechas sólidas indican confirmado, mientras que las flechas punteadas son interacciones plausibles. Los eventos de fosforilación se indican con la letra "p".

2. Biología estructural de componentes individuales

Se han logrado avances considerables en la biología estructural de componentes individuales y complejos de la maquinaria de reparación NHEJ, pero se requiere más trabajo para comprender la organización espacial de este proceso complicado y dinámico. Aquí discutimos lo que se sabe acerca de cada componente antes de discutir los complejos multiproteicos que median sus funciones en NHEJ.

2.1. Ku70 / 80

La actividad de unión al extremo del ADN bicatenario (ds) de Ku70 y Ku80 requiere su asociación para formar un heterodímero [40]. La estructura cristalina del heterodímero Ku70 / Ku80 revela una topología y organización de dominios similares, que comprende un amino-terminal

dominio, un dominio de barril central, y un brazo C-terminal helicoidal [10]. Estas proteínas, cuando se asocian, forman una estructura pseudosimétrica, en la que los residuos que contribuyen a la interfase del dímero muestran un bajo nivel de identidad de secuencia (aproximadamente 15% Figura 2), favoreciendo la formación de heterodímeros sobre la homodimerización de Ku70-Ku70 o Ku80-Ku80.


Ku70 y Ku80 alinearon secuencias sobre la base de sus estructuras. Muestran una organización de dominio similar a pesar de la baja identidad de secuencia. La alineación se creó con ClustalW2 [41] y se visualizó con ESPript [42]. Se conservan muchos residuos (caja negra) o semiconservados / similares (caja gris).

La estructura cristalina del heterodímero Ku70 / 80 en complejo con un fragmento de ADN en forma de Y de 55 nucleótidos de largo muestra que el heterodímero Ku70 / 80 adopta la forma de un anillo que rodea el ADN dúplex (Figura 3). No se producen grandes cambios conformacionales en la unión del ADN a Ku heterodimérico excepto para los dominios C-terminales de Ku70 y Ku80. De hecho, no se hacen contactos con las bases del ADN y solo se realizan unas pocas interacciones con el esqueleto de azúcar-fosfato. El dúplex de ADN se abraza a través del anillo preformado Ku70 / 80 de tal manera que una cara de ADN es relativamente accesible al disolvente y, por lo tanto, se expone a las enzimas de procesamiento que eliminan los nucleótidos dañados y llenan los espacios antes de la ligadura. Estas características pueden proporcionar soporte estructural a los extremos rotos del ADN y hacer que la hélice del ADN entre en fase a través de la unión durante el procesamiento y la ligadura de los extremos. Aunque el heterodímero Ku70 / 80 muestra una baja afinidad por el ADN circularizado [43] y no se une a ningún sustrato de ADN de menos de 14 pb, se une a fragmentos de ADNds de longitud y estructura similares de una manera independiente de la secuencia de ADN e independientemente de si el ADN termina son romos, con lazos de horquilla, o


(a)
(B)
(a)
(B) La heterodimerización de Ku70 / 80 define una forma de anillo que se une al ADN. Estructuras cristalinas del heterodímero Ku70 / 80 en ausencia de ADN (a) y en forma unida a ADN (b). Adaptado de [10].
2.2. ADN-PKcs

La estructura de DNA-PKcs ha resultado bastante esquiva. Algunos trabajos hermosos realizados mediante la reconstrucción de partículas individuales de ADN-PKcs [44-47] con microscopía crioelectrónica han dado una buena impresión de la estructura general (ver Figura 4 (a)). Esto ahora se ha complementado con el trabajo en nuestro laboratorio. Hemos demostrado que los cristales de ADN-PKcs se pueden cultivar y difractar a una resolución de aproximadamente 8,5 Å, pero la difracción es mejor para los complejos con fragmentos C-terminales de Ku80, presumiblemente debido a una estabilización de los ADN-PKcs en el complejo que conduce a una mejor pedido del embalaje de cristal. Recientemente hemos utilizado la dispersión anómala de longitudes de onda múltiples con el

Clúster de metales pesados ​​[48] para resolver la estructura de ADN-PKcs en un complejo con el dominio C-terminal de Ku80 a una resolución de 6,6 Å (Figura 4 (b)).


(a) Microscopía crioelectrónica
(b) Cristalografía de rayos X
(a) Microscopía crioelectrónica
(b) Cristalografía de rayos X Vistas equivalentes de DNA-PKcs según lo definido por (a) microscopía crioelectrónica y (b) cristalografía de proteínas de rayos X. Las referencias a las publicaciones y resoluciones de los modelos se dan arriba. La codificación de colores de estas estructuras EM se da en sus respectivas publicaciones [44-47]. El mapa de densidad de electrones experimental cristalográfico de rayos X es el definido por Sibanda et al. [48].

Gran parte de la cadena polipeptídica de DNA-PKcs se construye a partir de unidades de repetición HEAT (Figura 5) para formar varios dominios separados. La estructura terciaria de DNA-PKcs mide 160 Å de alto y 120 Å de ancho, como se ve en la Figura 6 (a). Desde el extremo N-terminal, los motivos de repetición de CALOR que comprenden aproximadamente 66 hélices se pliegan en una estructura circular hueca, que cuando se ve desde un lado se asemeja a una cuna (Figura 6 (b)). La cadena cambia de dirección antes de que se complete el círculo, dejando así un espacio (Figura 6 (a)). Dentro de esta estructura circular, la regularidad de las repeticiones de HEAT se rompe en ciertos puntos, como se indica en la Figura 6 (a) con flechas azules. Estos puntos de irregularidad pueden desempeñar un papel en los cambios conformacionales que se han implicado en la función de esta molécula [16]. Es posible que estos cambios conformacionales puedan influir en el tamaño de la brecha (Figura 6 (a)), que puede tener un papel en la liberación de ADN-PKcs de los extremos del ADN cuando se completa NHEJ. Lo más probable es que la estructura del anillo actúe como una plataforma para las proteínas que se dedican a la reparación del ADN roto y, junto con Ku, mantiene el ADN en su lugar mientras se repara.



Estructura cristalina de DNA-PKcs. Superficie molecular de la estructura de DNA-PKcs que muestra (a) vistas frontal y (b) lateral. También se muestra en (a), el tamaño total de DNA-PKcs con los sitios flexibles potenciales indicados en flechas azules. La molécula está codificada por colores de la siguiente manera: la estructura del anillo que es predominantemente repeticiones de HEAT es verde la frente que es parte de la estructura del anillo es verde claro el dominio de unión al ADN putativo es magenta la parte C-terminal más grande que incluye los dominios FAT y FATC es rojo y el dominio quinasa es amarillo.

En la segunda parte de la estructura, la cadena polipeptídica aprovecha las repeticiones HEAT para plegarse en un pequeño dominio globular de unión al ADN putativo dentro de la estructura circular. Se sabe que DNA-PKcs se une tanto al ADN bicatenario como al monocatenario. Williams y col. (2008) han propuesto que "la protuberancia" en su estructura crio-EM se une al ADN [47], y esta protuberancia es equivalente al pequeño dominio globular ubicado dentro de la región circular de la estructura cristalina. Este sigue siendo el mejor candidato para el reconocimiento de ADN de cadena simple y doble, pero se necesitará más trabajo en cristales de ADN-PK (ADN-PKcs, Ku, complejo de ADN) en una estructura de mayor resolución de ADN-PKcs para confirmar esto. En tercer lugar, la región C-terminal se pliega en la cabeza / corona que se encuentra justo en la parte superior de la estructura circular en forma de cuna y se extiende más hacia atrás. Esta parte contiene la FAT, el dominio quinasa, FATC y varias partes donde otras proteínas, según lo indicado por estudios bioquímicos, pueden unirse para formar complejos con DNA-PKcs (Figura 7).


Diagrama esquemático de las implicaciones de la función de secuencia de DNA-PKcs.Se muestran cuatro regiones altamente conservadas (HCR) [49] Dominios de quinasa, FAT y FATC sitios putativos para señales de localización nuclear (NLS) [49] Sitios de autofosforilación PQR [50], ABCDE [19], S3205 [51], S3821, S4026, T4102 [52] y T3950 [53] sitios de escisión para la proteasa apoptótica caspasa-3 [49, 54-56] sitios de unión para Lyn tirosina quinasa [57], proteína C1D que interactúa en el motivo leucina-cremallera del ADN- PKcs [58], proteína fosfatasa-5 (PP5) que se une, utilizando su repetición tetratricopeptídica (TPR), para desfosforilar el ADN-PKcs en S2056 y T2609 [59], Ku70 / 80 que se une para presentar los extremos de doble hebra de ADN dañados a DNA-PKcs [60], la proteína que interactúa con la quinasa (KIP) [61], y c-Abl que se une mediante su SH3 una unión que se desencadena por daños en el ADN [60].

El núcleo de la estructura de la quinasa de PI (3) K

, uno de los miembros de la familia, se superpuso a esta región de Cabeza / Corona, lo que resultó en un ajuste plausible a las hebras del lóbulo N y las hélices del lóbulo C (Figura 8). En esta ubicación, la quinasa está expuesta y fácilmente accesible a los sustratos (Figura 8). A partir de la ubicación del dominio quinasa, se pueden inferir las posiciones de las regiones FAT y FATC (Figura 7), ya que el dominio quinasa probablemente se "acurruque" entre estas dos regiones [62].


Dominio quinasa de DNA-PKcs. La figura muestra una caricatura de la estructura general de DNA-PKcs que representa la posición del dominio quinasa. La codificación de colores es como se muestra en la Figura 6. El modelado del dominio catalítico de DNA-PKcs se basó en la estructura cristalina de uno de los miembros de su familia, el PI (3) K

quinasa (código PDB: 1E8X). También se muestra un primer plano del dominio catalítico de DNA-PKcs. Las hélices de DNA-PKcs marcadas (a) y (b) podrían estar ocupadas por hélices del lóbulo N de PI (3) K

El tamaño del monómero de DNA-PKcs se predice por dispersión de rayos X de ángulo pequeño (SAXS) en aproximadamente 155 Å [63], en general de acuerdo con el de la estructura cristalográfica. DNA-PKcs se dimeriza sin DNA de una manera dependiente de la concentración. Los datos de SAXS indican un gran cambio conformacional entre las ADN-PKcs autofosforiladas y no fosforiladas; la dimensión y el radio de giro de las ADN-PKcs fosforiladas aumentaron 25 y 2 Å, respectivamente, en comparación con las ADN-PKcs simuladas. Además, la reconstrucción de la forma del ADN-PKcs fosforilado muestra una hendidura más amplia entre los dominios de la cabeza y la palma que en la enzima no fosforilada.

2.3. ADN ligasa IV

El LigIV humano también ha resultado difícil de estudiar de forma aislada debido a la inestabilidad y la flexibilidad, pero se estabiliza mediante la interacción con XRCC4 [28]. En humanos, LigIV es una de las tres ligasas de ADN dependientes de ATP, I, III y IV, y juega un papel central en el NHEJ eucariota. LigIV se puede dividir en las regiones catalítica y de interacción. Hay excelentes revisiones de la comparación de estructuras de ADN y ARN ligasas y enzimas de protección de ARN en otros lugares [64-67].

LigIV pertenece a la superfamilia de nucleotidiltransferasas y lleva a cabo una reacción de transferencia de nucleotidilo de tres pasos: la formación del intermedio covalente enzima-nucleótido monofosfato (NMP) (paso 1), la transformación de la NMP en un -fosfato de polinucleótido (paso 2), y la unión del -fosfato con -hidroxilo para sellar dos polinucleótidos (paso 3) [68]. Estas enzimas tienen cuatro motivos comunes (I, III, IV, V) y además dos motivos más (III y VI), que se conservan entre las enzimas de protección celular y del virus de la PPA y las ADN ligasas eucariotas dependientes de ATP [69]. Un motivo descubierto recientemente, Va, está bien conservado entre las ligasas de ADN humanas [70]. El motivo I KX (D / N) G tiene la lisina catalítica que forma el intermedio covalente NMP. Los motivos I-V se encuentran en el dominio de nucleotidiltransferasa (NTasa) (Figura 9), cuyo núcleo comprende principalmente tres láminas antiparalelas flanqueadas por seis hélices [64]. Los motivos Va y VI pertenecen al dominio de unión de oligonucleótidos / oligosacáridos (OBD) (Figura 9), que tiene el barril de llave griega de cinco cadenas coronado por una hélice [64, 71]. NTasa y OBD se conservan entre las enzimas de protección y las ligasas de ADN [64]. La mayoría de las mutaciones del síndrome de LigIV se encuentran en NTasa y OBD [72] (Figura 9).


Diagrama esquemático de la ADN ligasa IV humana. Los límites de los dominios que se muestran en la figura se basan en la estructura cristalográfica del ADN ligasa I [73] y los dominios BRCT de LigIV [94]. Los motivos conservados (I, III, IIIa, IV, V, Va y VI) se muestran en rectángulos naranjas [69, 70]. La lisina catalítica conservada se indica en línea verde. Los sitios de fosforilación informados están indicados por líneas rojas [81, 99]. Las mutaciones del síndrome de LigIV se muestran en los dominios [72, 100]. Las regiones de interacción Ku y XRCC4 se indican con corchetes negros [29, 84, 94].

Muchas enzimas de la superfamilia de las nucleotidiltrasferasas tienen dominios adicionales además de los dominios centrales catalíticos conservados. N-terminal a la NTasa, por ejemplo, las ADN ligasas humanas tienen dominio de unión al ADN (DBD), cuya estructura tridimensional fue descubierta por primera vez por Pascal et al. (2004) con los dominios catalíticos de la ADN ligasa I humana (LigI) complejados con un fragmento de ADN cortado y no ligable [73]. Este dominio también se encuentra en ADN ligasas de arqueas [74-76] y posiblemente en otras ligasas de ADN eucariotas, poxvirus y arqueales [77]. Pascal y col. (2004) demostraron que DBD es esencial para que LigI se una al ADN y lleve a cabo la ligadura de las muescas del ADN [73]. Sin embargo, este no parece ser el caso de la ADN ligasa III [78], aunque la mayor parte de la afinidad de unión al ADN de LigIV parece provenir de su DBD (T Ochi y TL Blundell, resultados no publicados). Estos resultados sugieren que la DBD de cada ADN ligasa humana tiene diferentes propiedades de unión al ADN, aunque es probable que tengan estructuras similares [79]. Dos mutaciones del síndrome de LigIV son graves sólo cuando se combinan con R278H, y parecen tener poco impacto en la actividad de LigIV [37]. Sobre la base de las similitudes estructurales de las regiones catalíticas de LigI y LigIV, es probable que se unan al ADN de manera similar.

Además de la región catalítica, las ADN ligasas humanas tienen dominios adicionales [79]. LigIV tiene un dominio BRCT en tándem con un enlazador que se predice que está mayormente desordenado. Este enlazador parece ser importante para la actividad catalítica de LigIV [80] y tiene un sitio de fosforilación en T650 por DNA-PKcs, cuya fosforilación estabiliza LigIV [81]. El dominio BRCT, que normalmente tiene cuatro hebras paralelas rodeadas por tres hélices [82], es común en las proteínas del punto de control del ciclo celular que responden al daño del ADN [83]. LigIV interactúa con XRCC4 principalmente a través del enlazador entre los dos BRCT [80]. Como se señaló anteriormente, además de la interacción con XRCC4, se ha demostrado que el primer dominio BRCT (BRCT1) interactúa con Ku70 / 80 [84].

Las estructuras de dominios BRCT en tándem de BRCA1 y MDC1 humanos, levadura Crb2, Nbs1 y Brc1, se han resuelto con diferentes fosfopéptidos. Cuatro residuos clave que forman el bolsillo de unión de fosfo-serina: el motivo (S / T) G al final de la primera hebra (1) y el motivo (S / T) XK al principio de la segunda hélice (2) [85-93] se han identificado los residuos se conservan en el dominio BRCT en tándem de LigIV excepto que el segundo motivo se reemplaza por NXR. Por lo tanto, BRCT1 podría unirse a las fosfoserinas [94], aunque es poco probable que las interacciones con los dos dominios BRCT proximales que se encuentran en BRCA1, MDC1, Crb2, Nbs1 y Brc1 ocurran en LigIV, ya que los dominios BRCT en tándem probablemente estén separados [94, 95]. ]. En efecto, in vitro Los experimentos de unión de fosfopéptidos mostraron que los dominios BRCT de LigIV se unían a fosfopéptidos [96, 97]. Sin embargo, aún no se ha determinado la secuencia precisa de un fosfopéptido que se une a los dominios BRCT.

Dado que los dominios BRCT en tándem tienen una disposición globular común de los dominios BRCT, los dominios LigIV pueden interactuar cuando LigIV está en forma libre. La principal interfaz de dimerización del dominio BRCT en tándem es 2 en BRCT1, y la primera y tercera hélices 1 y 3 en el segundo dominio BRCT (BRCT2) [98]. Curiosamente, la superficie de interacción de esos dominios BRCT y XRCC4 es similar a la de otros dominios BRCT en tándem (como se analiza a continuación). Es posible que un dominio BRCT de otra proteína interactúe con 2 de BRCT1, que está expuesto al solvente. Por tanto, aunque los dominios BRCT en tándem de LigIV tienen un enlazador largo, tienen características en común con otros dominios BRCT en tándem.

2.4. XRCC4

En solución, XRCC4 existe como un equilibrio de dímeros y tetrámeros dependiente de la sal [102] ver Figura 10. Se observó tetramerización de cola a cola en cristales de proteína XRCC4 [103]. Unión de LigIV con el terminal C XRCC4 α-La espiral en espiral estabiliza la formación del dímero XRCC4. La región de unión entre XRCC4 y LigIV se superpone con la región de tetramerización de XRCC4, lo que puede explicar por qué LigIV funciona para cambiar XRCC4 a la forma de dímero en solución [102]. Aún se desconoce si el XRCC4 tetramérico tiene una función durante la vía de reparación del NHEJ.


Dímero, tetrámero de XRCC4 y unión con péptido de ADN ligasa IV. El equilibrio se desplaza a dímero cuando el péptido ADN ligasa IV se une a XRCC4.

La secuencia de proteínas de XRCC4 después del residuo 213 no se incluye en las estructuras cristalinas de XRCC4 debido a la estructura flexible y altamente desordenada esperada del dominio C-terminal de XRCC4 [103]. Sin embargo, los estudios EM han revelado que la estructura C-terminal de XRCC4 de ratón es un dominio globular [104]. Este dominio incluye supuestas secuencias de localización nuclear [105]. Estos autores también sugirieron que un grupo de aminoácidos ácidos 229-238 es importante para la actividad de auto-transcripción. Además, el dominio C-terminal de XRCC4 es el objetivo de las proteínas reguladoras NHEJ. DNA-PKcs fosforila XRCC4 y regula su unión con el ADN [31]. Los residuos S260 y S318 en la región C-terminal de XRCC4 fueron identificados como los principales sitios de fosforilación por DNA-PKcs [106]. XRCC4 también es fosforilado por CK2, residuo T233 y la fosforilación por CK2 recluta PNK, que probablemente participará en NHEJ [107]. De hecho, se ha resuelto la estructura del dominio de PNK asociado a ForkHead (FHA) con un fosfopéptido derivado de XRCC4 [108]. También se informó que el residuo K210 de XRCC4 es importante para la modificación del modificador pequeño de tipo ubiquitina (SUMO), que regula la localización celular de XRCC4 [109]. La región C-terminal de XRCC4, junto con la región N-terminal (residuos 1-28) y la región central (residuos 168-200), pueden facilitar la unión cooperativa del ADN [31]. Por tanto, la definición de la estructura de la región C-terminal contribuirá a comprender cómo XRCC4 se une a LigIV y al ADN para llevar a cabo su función.

2.5. XLF

El XLF se identificó mediante un estudio de clonación de complementación funcional de ADNc del paciente 2BN tras el descubrimiento de un grupo de pacientes con deficiencia de NHEJ (2BN) [38, 110]. También se identificó de forma independiente mediante el cribado de dos híbridos de levadura para los interactuantes XRCC4 [39]. XLF se conserva evolutivamente en una amplia gama de eucariotas como vertebrados, insectos e incluso en hongos filamentosos [111]. El XLF humano de longitud completa contiene 299 residuos. En su extremo C-terminal, un pequeño grupo básico conservado constituye la secuencia de localización nuclear. Utilizando tinción de inmunofluorescencia, se observó que XLF se localizaba en el núcleo de células humanas [39].

La estructura cristalina de XLF con un truncamiento C-terminal, resuelta de forma independiente a una resolución de 2,3 Å por Andres et al. [112] y en nuestro laboratorio [101], existe como un homodímero que contiene un dominio de cabeza N-terminal globular y una cola helicoidal extendida en espiral, que se dobla hacia atrás alrededor de la espiral (Figura 11). El dominio de la cabeza N-terminal comienza con una sola hélice 1, que es seguida por una estructura antiparalela de siete hebras intercalando un motivo hélice-vuelta-hélice entre 4 y 5. La estructura de la cola contiene tres hélices 4, 5 y 6. Mientras que 4 se extiende desde el dominio de la cabeza N-terminal alrededor de 60 Å, 5 y 6 se pliegan hacia atrás y hacen contacto con el dominio de la cabeza. Las 4 hélices de los dos protómeros interactúan como una estructura en espiral que entierra residuos altamente conservados e hidrófobos en la interfaz. Esta dimerización de XLF se mejora aún más a través del plegado de las 5 y 6 hélices para rodear las 4 hélices del otro protómero para formar una abrazadera, lo que lleva al enterramiento de un área de superficie de

6500 Å 2. La filtración en gel, la reticulación de proteínas y la ultracentrifugación analítica también son compatibles con una forma homodímera estable de XLF en solución [101]. Se descubrió que XLF tiene una formación de complejos de orden superior dependiente de la concentración durante los experimentos de filtración en gel [112]. El homodímero de XLF, sin embargo, es la unidad funcional estable más pequeña.


Estructura cristalina de XLF / Cernunnos. Diagrama de cinta del dímero XLF / Cernunnos. Un protómero es el color del arco iris que va desde el extremo N-terminal (azul) al C-terminal (rojo). Adaptado de Li et al. [101].

Debido a la estructura desordenada prevista para la región C-terminal de XLF después del residuo 245, se eliminaron alrededor de 70 residuos del terminal C de XLF en los análisis de estructura cristalina [101, 112]. Sin embargo, se puede predecir que la ubicación aproximada de la región del terminal C de XLF estará cerca de la región del dominio de la cabeza del terminal N según la dirección de la hélice 6.

Aunque XLF y XRCC4 tienen arquitecturas similares, se producen grandes diferencias estructurales de la cabeza a la cola entre estas dos proteínas. Para el dominio de cabeza, ambas proteínas contienen la misma estructura antiparalela de siete hebras intercalando un motivo hélice-vuelta-hélice, pero XLF contiene una hélice adicional en el extremo N-terminal. Como hemos visto, la estructura de la cola de XLF contiene distintas hélices que se pliegan hacia atrás, mientras que la estructura de la cola en espiral extendida de XRCC4 contiene la región de unión de LigIV cerca del extremo C-terminal. Las diferencias en secuencia y estructura entre las colas XLF y XRCC4 explican por qué LigIV no se une a XLF de la misma manera que XRCC4.

Las funciones y mecanismos de acción de XLF en NHEJ aún no se comprenden completamente. XLF no solo estabiliza LigIV / XRCC4 en los extremos rotos del ADN, sino que también mejora el proceso de unión de extremos de LigIV / XRCC4. También se ha descubierto que XLF es esencial para reparar los voladizos no coincidentes y el proceso de llenado de huecos junto con la ADN polimerasa pol y pol [113, 114]. Comprender cómo funciona XLF en NHEJ a través del estudio de su interacción con otras proteínas NHEJ estructuralmente ayudará a desentrañar el papel exacto de XLF. Contribuirá a nuestra comprensión actual de la reparación del ADN en NHEJ y también puede conducir potencialmente a una futura aplicación terapéutica para pacientes con defectos de NHEJ.

3. Biología estructural de complejos

3.1. Complejo ternario DNA-PKcs / Ku70 / Ku80 / DNA (DNA-PK)

La estructura cristalina del heterodímero Ku70 / 80 no incluye el dominio de interacción ADN-PKcs C-terminal de Ku80 (Ku80CTD), que es prescindible para la unión de Ku70 / 80 al ADN, pero es necesario para el reclutamiento de ADN-PK en los sitios de ADN dañado [13, 14]. El análisis de resonancia magnética nuclear de Ku80CTD de 19 kDa (residuos 545-732) define una estructura helicoidal [115, 116]. Se han realizado más estudios estructurales de Ku70 / 80 de longitud completa con y sin ADN utilizando microscopía electrónica (EM) de una sola partícula [117] y SAXS combinados con imágenes de células vivas [63]. Se propuso que la posición de Ku80CTD estuviera bajo el dominio / de Ku70 por EM, pero se encontró que el dominio era flexible en el estudio SAXS. Las simulaciones de dinámica molecular de Ku80CTD produjeron un conjunto de conformaciones, apoyando la idea de que Ku80CTD es una región de alta flexibilidad [63]. Tomados en conjunto, los estudios muestran que la asociación de Ku70 y Ku80 para formar un heterodímero es necesaria para la unión de los extremos del ADN bicatenario, que la unión del ADN dependiente de Ku impulsa el reclutamiento de ADN-PKcs y que la última interacción involucra el dominio helicoidal ubicado en el C- término de Ku80. Aunque Ku80CTD se incluyó en la estructura cristalina de DNA-PKcs, su posición no pudo definirse de manera inequívoca, presumiblemente debido al predominio de estructuras alfa helicoidales similares en el propio DNA-PKcs [48].

Se han obtenido conocimientos sobre las estructuras de las holoenzimas DNA-PKcs / Ku70 / Ku80 y los posibles complejos sinápticos utilizando microscopía crioelectrónica y SAXS. Boskovic y col. (2003) utilizaron microscopía electrónica a baja resolución (30 Å) para demostrar grandes cambios conformacionales en el ADN-PKcs humano cuando el ADN de doble hebra se une, y sugirió que esto puede correlacionarse con la activación de la quinasa [118]. Posteriormente, Spagnolo et al. (2006) han utilizado microscopía electrónica de una sola partícula con una resolución de 25 Å para estudiar la holoenzima de ADN-PKcs / Ku70 / Ku80 humana ensamblada en ADN [16]. Nuevamente encontraron evidencia de cambios conformacionales en la unión de Ku y ADN a ADN-PKcs. Identificaron partículas diméricas que comprenden dos holoenzimas de ADN-PKcs / Ku70 / Ku80, que consideran que probablemente sean complejos sinápticos, que mantienen los extremos rotos y proporcionan una plataforma para otros componentes necesarios para el procesamiento y la ligadura de los extremos. Un estudio SAXS de DNA-PK reveló que tenía dos modos diferentes de dimerización, como se observó previamente con DNA-PKcs [63]. Dependiendo de la presencia de ADN en horquilla de 40 pb o de ADN en forma de Y de 40 pb, el ADN-PK formó el dímero de cabeza a cabeza o de palma a palma. Muy recientemente, Perry et al. (2010) han profundizado en el estudio de la holoenzima DNA-PKcs / Ku70 / Ku80 analizando sus estudios anteriores de SAXS a la luz de la estructura cristalina de DNA-PKcs [119]. Han demostrado de manera impresionante que la fosforilación de ADN-PK causa un gran cambio conformacional, suficiente para abrir la brecha en el anillo y proporcionar acceso o liberación del ADN. Se ha demostrado que Ku80CTD es flexible y se extiende en solución en beneficio del reclutamiento de DNA-PKcs. Es posible que Ku80 interactúe con DNA-PKcs en ambos lados de BSB [63].

3.2. Complejos de ADN ligasa IV / XRCC4

LigIV se estabiliza formando un complejo compacto con XRCC4 [28]. Aproximadamente el 99% de LigIV se preadenila cuando se purifica junto con XRCC4 y es difícil de readenilar después de la ligación de una sola muesca [120], lo que implica que el complejo LigIV / XRCC4 está listo para ligar el ADN. A diferencia de otras ligasas de ADN humanas, LigIV / XRCC4 puede ligar eficazmente una de las muescas de una DSB, aunque la otra no se puede ligar [26], y puede ligar cadenas de ADN a través de huecos y extremos totalmente incompatibles [121]. Además, se ha demostrado que LigIV puede ligar ADN poli-T monocatenario [122]. Curiosamente, la eficiencia de la ligadura es mayor con sustratos de ADN largos.

53 pb [123]. Esto podría estar relacionado con la observación de que un solo LigIV / XRCC4 une dos extremos de ADN [124].

Las estructuras cristalinas del dímero XRCC4 complejado con el dominio BRCT en tándem de LigIV muestra que el enlazador entre los dos dominios BRCT está bien ordenado y forma una abrazadera de hélice-bucle-hélice (HLH) alrededor de la bobina en espiral [29, 94] ( Figuras 12 (a) y 12 (b)). El mismo modo de interacción y disposición de estructura secundaria se observa en el complejo de levadura ortóloga entre XRCC4 (Lif1p) y LigIV (Lig4p) [95] (Figura 12 (c)). Los dos dominios BRCT en los complejos humano y de levadura extienden la pinza, rodeando el dominio en espiral. los

-helix en BRCT1 se encuentra cerca de la región de interacción XRCC4 conservada del enlazador (XIR: residuo 748-784) entre dos dominios BRCT. La correspondiente hélice en BRCT1 de 53BP1 participa en la superficie de interacción de p53 [125, 126]. La interacción de XRCC4 con LigIV produce una torcedura en una hélice de la bobina en espiral del dímero XRCC4 y cambia la repetición de heptada izquierda en una bobina en espiral undecad derecha como resultado, la superficie de interacción LigIV se vuelve plana [29, 94]. La torcedura se dobla en la dirección opuesta en el complejo entre XRCC4 con XIR y con el dominio BRCT en tándem [94]. La primera estructura podría ser un estado intermedio de interacción LigIV / XRCC4.Si es así, este cambio conformacional dinámico podría tener un papel biológico. en vivo. Esta torcedura no aparece en Lif1p / Lig4p a pesar de que se llevó a cabo el refinamiento de la estructura frente a un nuevo conjunto de datos de difracción de 3,5 Å (ver [127], T Ochi y TL Blundell, resultados no publicados). Por lo tanto, la torcedura puede ser exclusiva de los seres humanos y algunos otros organismos superiores.


Estructuras cristalinas de LigIV / XRCC4 y Lif1p-Lig4p. La región de interacción XRCC4 o Lif1 conservada de LigIV (XIR) o Lig4p (LIR) se indican con flechas azules. (a) XRCC4 (residuos 1–213) (azul) y XIR (violeta) (código PDB: 1IK9). (b) XRCC (residuos 1–203) (azul) y dominios BRCT de LigIV (residuos 654–911) (violeta) (código PDB: 3II6) (c) Lif1p (residuos 1–246) (azul) y dominios BRCT de Lig4p (residuos 680–944) (violeta).

La segunda hélice en HLH media una interacción hidrofóbica con el lado opuesto de la superficie plana del XRCC4 donde interactúa XIR [94] y se observa una interacción hidrofóbica extensa similar en Lif1p / Lig4 (residuos 827-839) [95]. Además, LigIV interactúa con la bobina en espiral de XRCC4 a través de 1 y 3 de BRCT2, de una manera que se asemeja a la interacción entre BRCT1 y BRCT2 de otros dominios de BRCT en tándem. La superposición de LigIV / XRCC4 y Lif1p / Lig4p basada en XIR y la región correspondiente de Lig4p (LIR) muestra que, además de la torcedura descrita anteriormente, se produce un cambio adicional en la posición de BRCT1 (Figura 13). Esto puede ser un artefacto cristalográfico porque BRCT1 está estrechamente empacado con BRCT2 que pertenece a otra molécula tanto en estructuras humanas como de levadura. Sin embargo, la estructura de RMN de BRCT1 (código PDB: 2E2W) tiene la misma conformación que la cristalográfica, lo que sugiere al menos BRCT1 humano y es probable que el siguiente enlazador tenga la misma conformación en solución.


Comparación de posiciones de BRCT1 entre LigIV / XRCC4 y Lif1p / Lig4p. Las estructuras de LigIV / XRCC4 (violeta / plateado) y Lifp1 / Lig4p (verde / dorado) se superpusieron en base a XIR y LIR. La figura es una vista de la dirección del terminal C a N de las bobinas en espiral de XRCC4 y Lif1p. Los N-terminales y las hélices de BRCT1 de LigIV y Li4p están marcados con violeta y verde, respectivamente.

Una estructura EM del complejo LigIV / XRCC4 publicada recientemente muestra el N-terminal de LigIV en las proximidades del dominio principal de XRCC4 [128]. Los autores compararon dos construcciones de LigIV / XRCC4, una con las secuencias de longitud completa y la otra con una LigIV de longitud completa y una XRCC4 truncada (residuos 1-213). A partir de las diferencias de las dos imágenes EM, determinaron la posición del C-terminal de XRCC4 y, al marcar la etiqueta de hexahistidina con oro, identificaron el N-terminal de LigIV. Aunque los autores reconstruyeron imágenes promediadas en 2D de LigIV / XRCC4, la reconstrucción en 3D falló parcialmente debido a la heterogeneidad de la conformación LigIV / XRCC4. Por lo tanto, propusieron que la región catalítica de LigIV está conectada a la región C-terminal por un enlazador flexible y esto puede tener importancia funcional (ver también Perry et al. (2010) [119]).

Hemos llevado a cabo estudios SAXS del dominio BRCT en tándem de LigIV / XRCC4 mutado (BmX4) y LigIV / XRCC4 mutado (LmX4) para investigar la conformación de la región catalítica en solución (Figura 14 (a)) [129]. Aquí, XRCC4 mutado es idéntico al utilizado para resolver la estructura de XIR / XRCC4 [29]. La linealidad de los respectivos gráficos de Guinier confirmó que las soluciones de proteínas eran homogéneas y monodispersas (Figura 14 (b)). El radio de giro deducido y la dimensión molecular máxima de LmX4 son 9 Å y 43 Å más grandes, respectivamente, que los de BmX4. El perfil de dispersión simulado utilizando la estructura cristalográfica de BmX4 (código PDB: 3II6) se ajustó bien a la curva SAXS medida (

, datos no mostrados). Además, el ab initio La restauración de la forma 3D de BmX4 reprodujo una conformación general consistente con la estructura cristalina (Figura 14 (c)). los ab initio La reconstrucción de la forma de LmX4 reveló que la región catalítica puede aportar densidad adicional al dominio principal de XRCC4 o al dominio BRCT en tándem de LigIV en comparación con la conformación de BmX4 (Figura 14 (c)). Dado que la conformación abierta extendida de la región catalítica en solución también se ha observado en una ligasa de ADN de arqueas [74], la densidad extra puede corresponder a una conformación similar de la región catalítica de LigIV a la conformación cerrada observada en otras ligasas de ADN de arqueas. [75, 76]. Como las restauraciones de forma de LmX4 produjeron una conformación reproducible (también indicada por el valor de discrepancia espacial normalizada (NSD) después del promedio de forma), este hallazgo podría implicar interacciones entre la región catalítica y BmX4. Sin embargo, el ensayo de cambio de movilidad electroforética y el análisis de proteasa (datos no mostrados) indican que es poco probable que la región catalítica tenga interacciones fuertes con BmX4. Por tanto, aunque la mayoría de LmX4 en solución puede tener la conformación abierta extendida, la región catalítica está unida de forma flexible a BmX4. Nuestras observaciones concuerdan con el estudio EM [128].


. (b) Gráficos de Guinier de LmX4 y BmX4 con ajustes de revestimiento (línea roja)

3.3. Complejos XLF / XRCC4

La interacción entre XLF y XRCC4 es sensible a la sal, no depende del ADN [39, 133] y las interacciones ocurren a través de las regiones de la cabeza, como lo demuestra el estudio de dos híbridos de levadura de varios mutantes [134]. XLF unido a perlas en su C-terminal todavía era capaz de derribar LigIV / XRCC4, lo que implica que el C-terminal de XLF no es importante para la interacción con LigIV / XRCC4 [135].

Los estudios de mutagénesis indican que el residuo XLF L115 estructuralmente expuesto (Figura 16 mostrada en verde) ubicado en el bucle 6-7 es importante para la interacción XLF / XRCC4 [112]. Los residuos K63, K65 y K99 (Figura 15 mostrada en verde) de XRCC4 son esenciales para la interacción y están ubicados en la región del dominio de la cabeza cerca de la cola helicoidal [112]. Los residuos de interacción no esenciales de XLF se encuentran principalmente fuera de la región del dominio de la cabeza, mientras que los residuos de unión no esenciales de XLF / XRCC4 en XRCC4 se encuentran principalmente en la parte superior del dominio de la cabeza N-terminal y en la estructura de la cola helicoidal antes de la región de unión de LigIV (Figuras 15 y 16 en gris) [112]. Estos estudios son consistentes con un modelo de interacción lineal lado a lado, en el que los dominios de la cabeza XLF se deslizan hacia el espacio creado por los dominios de la cabeza XRCC4 y la parte N-terminal de la estructura de la cola [112] (Figura 17). Sin embargo, no podemos excluir un modelo para XLF / XRCC4, que implica que XLF y XRCC4 se unen uno al lado del otro, pero con un grado de torsión que introduce curvatura y posiblemente un complejo circular. Esto tendría la ventaja de formar un complejo finito y discreto. Otros experimentos de dispersión de ángulo pequeño de rayos X pueden ser el mejor enfoque para resolver esto, especialmente si los complejos son dinámicos como sugieren los experimentos de filtración en gel. Sin embargo, algo de estímulo para identificar complejos bien definidos se encuentra en la observación de que los complejos XLF / XRCC4 se han cristalizado y se han recopilado datos de rayos X, aunque a baja resolución (Q Wu, TL Blundell datos no publicados).




3.4. Disposición espacial de complejos de orden superior

Para dar una imagen de la organización espacial y temporal del sistema de reparación NHEJ en su conjunto, una comprensión del orden de interacciones durante el ensamblaje del complejo ternario DNA-PKcs / Ku70 / Ku80 / DNA y el LigIV / XRCC4 / El complejo cuaternario XLF / ADN será esencial.

Ku70 / 80 y DNA-PKcs, que tienen una mayor afinidad de unión al DNA en comparación con LigIV / XRCC4 / XLF, lo más probable es que formen primero el complejo ternario DNA-PKcs / Ku70 / Ku80 / DNA. Para la siguiente formación del complejo LigIV / XRCC4 / XLF / ADN, aún están por determinar el orden y la dinámica del ensamblaje de proteínas. La interacción entre XRCC4 y XLF es relativamente débil en comparación con la fuerte unión entre XRCC4 y LigIV. No está claro si las interacciones del dímero XLF con el dímero XRCC4 se mantienen cuando se recluta la ligasa. Los ensayos de interacción de proteínas han confirmado que el reclutamiento de XLF independiente de XRCC4 en los DSB termina a través de la interacción con Ku70 / 80 solo en la presencia de ADN. Esto puede implicar que XLF puede actuar de forma independiente sin XRCC4.

Las técnicas de formación de imágenes de células vivas han identificado el reclutamiento inmediato de XLF a los DSB inducidos por láser con unión a la proteína Ku70 / 80 [136]. XRCC4 es prescindible para el reclutamiento de XLF a los extremos del ADN, pero su presencia puede estabilizar la interacción XLF / ADN [136]. Los ensayos de interacción de proteínas han confirmado la interacción entre Ku70 / 80 y XLF, y esta interacción solo se produce en presencia de ADN [136].

Tanto XRCC4 como XLF requieren un fragmento largo de ADN para unirse. La forma en que el ADN está involucrado estructuralmente en todos los complejos de proteínas de orden superior es de interés fundamental. La fosforilación de LigIV, XRCC4 y XLF por DNA-PKcs no interfiere en gran medida con las funciones centrales de estas proteínas, pero podría alterar las afinidades de unión relativas de varias interacciones proteína-proteína o proteína-ADN, que son importantes para la correcta disposición espacial. de los complejos de orden superior. Toda esta incertidumbre subraya la necesidad de realizar más estudios para caracterizar los complejos tanto temporal como espacialmente.

4. Discusión

Los desafíos de la caracterización estructural de los sistemas multiproteicos dinámicos exigen claramente una combinación de SAXS, EM, cristalografía de rayos X y otros enfoques. Todos se beneficiarán de los métodos de estabilización y fijación de los complejos. Las construcciones modificadas, por ejemplo, mutación y truncamiento que imitan fosfo, así como posmodificación, por ejemplo, fosforilación y metilación, necesitan explorarse para identificar complejos estables. Para estudios de crio-EM de una sola partícula, GraFix se ha introducido con éxito para estabilizar macromoléculas [137]. Esto aprovecha la centrifugación en gradiente de glicerol en concentraciones crecientes de reactivo de fijación química para estabilizar macromoléculas individuales y prevenir la agregación oportunista. Un enfoque similar podría usarse para otros estudios estructurales, incluida la cristalografía de rayos X, aunque aquí la modificación de la superficie molecular de los complejos puede prevenir la formación de cristales ordenados.

Los cristales de grandes conjuntos multiproteicos adecuados para la difracción de rayos X de alta resolución siguen siendo un desafío. Por tanto, el desarrollo de métodos para analizar datos de difracción de rayos X de baja resolución es fundamental. A este respecto, las fuentes de luz láser de electrones libres (FEL) pueden permitir la obtención de imágenes FEL (XFEL) de rayos X de una sola partícula. La cristalografía de rayos X con nanocristales también es un método prometedor.

La cristalografía de rayos X sigue siendo la única técnica para dar resolución atómica de grandes estructuras y la alta resolución es esencial para estudiar la unión de moléculas pequeñas. De hecho, las herramientas químicas que permiten una intervención específica en NHEJ deberían permitir la disección de las funciones de los diversos componentes. Es probable que estas herramientas también contribuyan al descubrimiento de compuestos principales y candidatos preclínicos para la intervención terapéutica en sitios de interacción alostéricos y otros reguladores en oncología y para pacientes con defectos en la vía NHEJ.

El interés inmediato, que se desarrolla a partir de la estructura emergente de DNA-PKcs, es la mejora del diseño de inhibidores que se unen al sitio ATP del resto de proteína quinasa. Dichos inhibidores no solo informarían el desarrollo de agentes terapéuticos útiles, sino que también deberían ser de valor inmediato para investigar la posibilidad de mejorar la estabilidad del dominio quinasa y la calidad y resolución de los cristales.

Eventualmente, esperaríamos seguir un enfoque guiado por la estructura para optimizar el diseño de tales inhibidores. Se podrían adoptar enfoques similares con el sitio activo de ligasa. En nuestra opinión, un enfoque más emocionante y aventurero sería diseñar nuevas entidades químicas que se unan en sitios alostéricos, plantillas o sitios de unión de adaptadores, los llamados alo-focalización, que son críticos para la activación, colocalización y / o especificidad de la regulación de NHEJ. El uso de métodos basados ​​en fragmentos [138-140] en este contexto es atractivo. Los objetivos probables serían las interacciones cabeza a cabeza de XRCC4 y XLF, las interacciones de los dominios BRCT y la interacción de Ku70 / 80 y DNA-PKcs.

En conclusión, una comprensión espacial y temporal de NHEJ debería proporcionar información sobre el mecanismo de este proceso celular crítico y también sugerir enfoques para diseñar herramientas químicas útiles. De hecho, el diseño de pequeños agentes químicos que modulan de forma no covalente las interacciones también contribuiría probablemente al descubrimiento de compuestos líderes que permitan la intervención terapéutica en oncología y el tratamiento de pacientes con defectos en la vía NHEJ.

Expresiones de gratitud

Los autores desean agradecer al Dr. J. Günter Grossmann por sus útiles discusiones y comentarios sobre los datos de SAXS. B. L. Sibanda y D. Y. Chirgadze recibieron el apoyo de la subvención del programa Wellcome Trust: 079281 / Z / 06 / Z. T. Ochi fue apoyado por Overseas Research Studentship (ORS). Los gráficos moleculares, excepto las Figuras 4 y 14, se prepararon utilizando PyMOL [141].

Referencias

  1. M. Takata, M. S. Sasaki, E. Sonoda et al., "La recombinación homóloga y las vías de unión de extremos no homólogas de la reparación de rotura de doble hebra del ADN tienen funciones superpuestas en el mantenimiento de la integridad cromosómica en células de vertebrados". El diario EMBO, vol. 17, no. 18, págs. 5497–5508, 1998. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  2. M. O'Driscoll y P. A. Jeggo, "El papel de la reparación de roturas de doble hebra & # x2014insights de la genética humana", Nature Reviews Genética, vol. 7, no. 1, págs. 45–54, 2006. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  3. M. M. Vilenchik y A. G. Knudson, "Roturas endógenas de doble hebra del ADN: producción, fidelidad de reparación e inducción de cáncer", Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América, vol. 100, no. 22, págs. 12871–12876, 2003. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  4. K. K. Khanna y S. P. Jackson, "Rupturas de doble hebra del ADN: señalización, reparación y conexión con el cáncer", Genética de la naturaleza, vol. 27, no. 3, págs. 247–254, 2001. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  5. M. Gellert, "V (D) J recombinación: proteínas RAG, factores de reparación y regulación", Revisión anual de bioquímica, vol. 71, págs. 101-132, 2002. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  6. J. Chaudhuri y F. W. Alt, "Recombinación de cambio de clase: interacción de la transcripción, desaminación del ADN y reparación del ADN", Nature Reviews Inmunología, vol. 4, no. 7, págs. 541–552, 2004. Ver en: Google Scholar
  7. C. T. Yan, C. Boboila, E. K. Souza et al., "El cambio y las translocaciones de clase de IgH utilizan una vía de unión de extremos no clásica robusta", Naturaleza, vol. 449, no. 7161, págs. 478–482, 2007. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  8. A. Nussenzweig y M. C. Nussenzweig, "Una vía de reparación del ADN de respaldo se mueve a la vanguardia", Celda, vol. 131, no. 2, págs. 223–225, 2007. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  9. M. R. Lieber, Y. Ma, U. Pannicke y K. Schwarz, "El mecanismo de unión de extremos del ADN no homólogo de vertebrados y su papel en la recombinación V (D) J", Reparación de ADN, vol. 3, no. 8-9, págs. 817–826, 2004. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  10. J. R. Walker, R. A. Corpina y J. Goldberg, "Estructura del heterodímero Ku unido al adn y sus implicaciones para la reparación de roturas de doble hebra", Naturaleza, vol. 412, no. 6847, págs. 607–614, 2001. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  11. J. A. Downs y S. P. Jackson, "Un medio para un fin de ADN: los muchos roles de Ku", Nature Reviews Biología celular molecular, vol. 5, no. 5, págs. 367–378, 2004. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  12. K. O. Hartley, D. Gell, G. C. M. Smith et al., "Subunidad catalítica de la proteína quinasa dependiente del ADN: un pariente de la fosfatidilinositol 3-quinasa y el producto del gen de la ataxia telangiectasia", Celda, vol. 82, no. 5, págs. 849–856, 1995. Ver en: Google Scholar
  13. B. K. Singleton, M. I. Torres-Arzayus, S. T. Rottinghaus, G. E. Taccioli y P. A. Jeggo, "El terminal C de Ku80 activa la subunidad catalítica de la proteína quinasa dependiente del ADN", Biología molecular y celular, vol. 19, no. 5, págs. 3267–3277, 1999. Ver en: Google Scholar
  14. D. Gell y S. P. Jackson, "Mapeo de interacciones proteína-proteína dentro del complejo proteína quinasa dependiente de ADN", Investigación de ácidos nucleicos, vol. 27, no. 17, págs. 3494–3502, 1999. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  15. S. Yoo y W. S. Dynan, "Geometría de un complejo formado por proteínas de reparación de rotura de doble cadena en un solo extremo del ADN: el reclutamiento de ADN-PKcs induce la translocación hacia adentro de la proteína Ku", Investigación de ácidos nucleicos, vol. 27, no. 24, págs. 4679–4686, 1999. Ver en: Google Scholar
  16. L. Spagnolo, A. Rivera-Calzada, L. H. Pearl y O. Llorca, "Estructura tridimensional del complejo ADN-PKcs / Ku70 / Ku80 humano ensamblado en el ADN y sus implicaciones para la reparación de DSB del ADN", Célula molecular, vol. 22, no. 4, págs. 511–519, 2006. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  17. G. C. M. Smith y S. P. Jackson, "La proteína quinasa dependiente del ADN", Genes y desarrollo, vol. 13, no. 8, págs. 916–934, 1999. Ver en: Google Scholar
  18. E. Weterings y D. J. Chen, "La historia interminable de uniones de extremos no homólogos", Investigación celular, vol. 18, no. 1, págs. 114–124, 2008. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  19. Q. Ding, Y. V. R. Reddy, W. Wang et al., "Se requiere autofosforilación de la subunidad catalítica de la proteína quinasa dependiente del ADN para un procesamiento final eficiente durante la reparación de rotura de doble cadena del ADN", Biología molecular y celular, vol. 23, no. 16, págs. 5836–5848, 2003.Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  20. W. D. Block, Y. Yu, D. Merkle et al., "La remodelación dependiente de la autofosforilación de la subunidad catalítica de la proteína quinasa dependiente del ADN regula la ligadura de los extremos del ADN", Investigación de ácidos nucleicos, vol. 32, no. 14, págs. 4351–4357, 2004. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  21. D. Moshous, I. Callebaut, R. de Chasseval et al., "Artemis, una nueva proteína de recombinación V (D) J / reparación de rotura de doble hebra del ADN, está mutada en la inmunodeficiencia combinada grave humana", Celda, vol. 105, no. 2, págs. 177–186, 2001. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  22. M. R. Lieber, "El mecanismo de reparación de la rotura del ADN de doble cadena mediante la vía de unión de extremos del ADN no homólogo", Revisión anual de bioquímica, vol. 79, págs. 181–211, 2010. Ver en: Google Scholar
  23. Y. Ma, U. Pannicke, K. Schwarz y M. R. Lieber, "Apertura de horquilla y procesamiento de voladizo por un complejo de proteína quinasa dependiente de Artemisa / ADN en unión de extremos no homólogos y recombinación V (D) J", Celda, vol. 108, no. 6, págs. 781–794, 2002. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  24. KN Mahajan, SA Nick McElhinny, BS Mitchell y DA Ramsden, “Asociación de ADN polimerasa & # x3bc (pol & # x3bc) con Ku y ligasa IV: papel de pol & # x3bc en la reparación de roturas de doble cadena de unión final, " Biología molecular y celular, vol. 22, no. 14, págs. 5194–5202, 2002. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  25. J. W. Lee, L. Blanco, T. Zhou et al., "Implicación de la ADN polimerasa & # x3bb en el llenado de huecos basado en alineación para la unión de extremos de ADN no homólogo en extractos nucleares humanos", La revista de química biológica, vol. 279, no. 1, págs. 805–811, 2004. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  26. Y. Ma, H. Lu, B. Tippin et al., "Un sistema definido bioquímicamente para la unión de extremos de ADN no homólogo de mamíferos", Célula molecular, vol. 16, no. 5, págs. 701–713, 2004. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  27. S. A. Roberts, N. Strande, M. D. Burkhalter et al., "Ku es una liasa 5 & # x2032 -dRP / AP que elimina el daño de los nucleótidos cerca de los extremos rotos", Naturaleza, vol. 464, no. 7292, págs. 1214–1217, 2010. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  28. M. Bryans, M. C. Valenzano y T. D. Stamato, "Ausencia de proteína ADN ligasa IV en células XR-1: evidencia de estabilización por XRCC4", Investigación de mutaciones / Reparación de ADN, vol. 433, no. 1, págs. 53–58, 1999. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  29. B. L. Sibanda, S. E. Critchlow, J. Begun et al., "Estructura cristalina de un complejo de ligasa IV de ADN Xrcc4", Biología estructural de la naturaleza, vol. 8, no. 12, págs. 1015–1019, 2001. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  30. U. Grawunder, M. Wilm, X. Wu et al., "Actividad de la ADN ligasa IV estimulada por la formación de complejos con la proteína XRCC4 en células de mamíferos", Naturaleza, vol. 388, no. 6641, págs. 492–495, 1997. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  31. M. Modesti, J. E. Hesse y M. Gellert, "La unión al ADN de la proteína Xrcc4 está asociada con la recombinación V (D) J pero no con la estimulación de la actividad de la ADN ligasa IV", El diario EMBO, vol. 18, no. 7, págs. 2008–2018, 1999. Ver en: Google Scholar
  32. Y. Wang, B. J. Lamarche y M.-D. Tsai, "ADN ligasa IV humana y el complejo ligasa IV / XRCC4: análisis de la fidelidad de la ligadura de muescas", Bioquímica, vol. 46, no. 17, págs. 4962–4976, 2007. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  33. Y. Gao, Y. Sun, K. M. Frank et al., "Un papel fundamental para las proteínas de unión de los extremos del ADN tanto en la linfogénesis como en la neurogénesis", Celda, vol. 95, no. 7, págs. 891–902, 1998. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  34. K. M. Frank, J. M. Sekiguchi, K. J. Seidl et al., "Letalidad embrionaria tardía y recombinación V (D) J alterada en ratones que carecen de ADN ligasa IV", Naturaleza, vol. 396, no. 6707, págs. 173-177, 1998. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  35. Y. Gao, D. O. Ferguson, W. Xie et al., "Interacción de p53 y la proteína de reparación del ADN XRCC4 en la tumorigénesis, la estabilidad genómica y el desarrollo", Naturaleza, vol. 404, no. 6780, págs. 897–900, 2000. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  36. K. M. Frank, N. E. Sharpless, Y. Gao et al., "La deficiencia de ADN ligasa IV en ratones conduce a una neurogénesis defectuosa y letalidad embrionaria a través de la vía p53", Célula molecular, vol. 5, no. 6, págs. 993–1002, 2000. Ver en: Google Scholar
  37. M. O'Driscoll, K. M. Cerosaletti, P.-M. Girard et al., "Mutaciones de ADN ligasa IV identificadas en pacientes que presentan retraso en el desarrollo e inmunodeficiencia", Célula molecular, vol. 8, no. 6, págs. 1175–1185, 2001. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  38. D. Buck, L. Malivert, R. de Chasseval et al., "Cernunnos, un nuevo factor de unión de extremos no homólogo, está mutado en inmunodeficiencia humana con microcefalia", Celda, vol. 124, no. 2, págs. 287–299, 2006. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  39. P. Ahnesorg, P. Smith y S. P. Jackson, "XLF interactúa con el complejo XRCC4-DNA Ligase IV para promover la unión de extremos no homólogos del DNA", Celda, vol. 124, no. 2, págs. 301–313, 2006. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  40. E. Feldmann, V. Schmiemann, W. Goedecke, S. Reichenberger y P. Pfeiffer, “Reparación de rotura de doble cadena de ADN en extractos libres de células de células deficientes en Ku80: implicaciones para que Ku sirva como factor de alineación en unión de extremos de ADN homólogo " Investigación de ácidos nucleicos, vol. 28, no. 13, págs. 2585-2596, 2000. Ver en: Google Scholar
  41. M. A. Larkin, G. Blackshields, N. P. Brown et al., "Clustal W y Clustal X versión 2.0", Bioinformática, vol. 23, no. 21, págs. 2947–2948, 2007. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  42. P. Gouet, E. Courcelle, D. I. Stuart y F. M & # xe9toz, "ESPript: análisis de alineaciones de secuencia múltiple en PostScript", Bioinformática, vol. 15, no. 4, págs. 305–308, 1999. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  43. W. S. Dynan y S. Yoo, "Interacción de la subunidad catalítica de proteína Ku y proteína quinasa dependiente de ADN con ácidos nucleicos", Investigación de ácidos nucleicos, vol. 26, no. 7, págs. 1551–1559, 1998. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  44. C. Y. Chiu, R. B. Cary, D. J. Chen, S. R. Peterson y P. L. Stewart, "Imágenes crio-EM de la subunidad catalítica de la proteína quinasa dependiente del ADN", Revista de biología molecular, vol. 284, no. 4, págs. 1075–1081, 1998. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  45. K. K. Leuther, O. Hammarsten, R. D. Kornberg y G. Chu, "Estructura de la proteína quinasa dependiente del ADN: implicaciones para su regulación por el ADN", El diario EMBO, vol. 18, no. 5, págs. 1114–1123, 1999. Ver en: Google Scholar
  46. A. Rivera-Calzada, J. D. Maman, L. Spagnolo, L. H. Pearl y O. Llorca, "Estructura tridimensional y regulación de la subunidad catalítica de la proteína quinasa dependiente del ADN (ADN-PKcs)", Estructura, vol. 13, no. 243, pág. 495, 2005. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  47. D. R. Williams, K .J. Lee, D. J. Chen, J. Shi y P. L. Stewart, "La estructura crio-EM de la subunidad catalítica de la proteína quinasa dependiente de ADN en una resolución subnanométrica revela hélices alfa y una visión de la unión del ADN". Estructura, vol. 16, págs. 468–477, 2008. Ver en: Google Scholar
  48. B. L. Sibanda, D. Y. Chirgadze y T. L. Blundell, "La estructura cristalina de DNA-PKcs revela una gran cuna de anillo abierto compuesta de repeticiones HEAT", Naturaleza, vol. 463, no. 7277, págs. 118–121, 2010. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  49. A. Fujimori, R. Araki, R. Fukumura et al., "Identificación de cuatro regiones altamente conservadas en DNA-PKcs", Inmunogenética, vol. 51, no. 11, págs. 965–973, 2000. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  50. C. Xiaoping, Y. Yaping, S. Gupta, Y.-M. Cho, S. P. Lees-Miller y K. Meek, "La autofosforilación de la proteína quinasa dependiente del ADN regula el procesamiento del extremo del ADN y también puede alterar la elección de la vía de reparación de rotura de doble cadena", Biología molecular y celular, vol. 25, no. 24, págs. 10842–10852, 2005. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  51. P. Douglas, G. P. Sapkota, N. Morrice et al., "Identificación de sitios de fosforilación in vitro e in vivo en la subunidad catalítica de la proteína quinasa dependiente del ADN", El diario bioquímico, vol. 368, no. 1, págs. 243–251, 2002. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  52. Y. Ma, U. Pannicke, H. Lu, D. Niewolik, K. Schwarz y M. R. Lieber, "Los sitios de fosforilación de la subunidad catalítica de la proteína quinasa dependiente del ADN en la artemisa humana", La revista de química biológica, vol. 280, no. 40, págs. 33839–33846, 2005. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  53. P. Douglas, X. Cui, W. D. Block et al., "La subunidad catalítica de la proteína quinasa dependiente de ADN se fosforila in vivo en la treonina 3950, un aminoácido altamente conservado en el dominio de la proteína quinasa", Biología molecular y celular, vol. 27, no. 5, págs. 1581–1591, 2007. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  54. M. Le Romancer, S. C. Cosulich, S. P. Jackson y P. R. Clarke, "Escisión e inactivación de la subunidad catalítica de la proteína quinasa dependiente del ADN durante la apoptosis en extractos de huevo de Xenopus", Revista de ciencia celular, vol. 109, no. 13, págs. 3121–3127, 1996. Ver en: Google Scholar
  55. Q. Song, S. P. Lees-Miller, S. Kumar et al., "Subunidad catalítica de la proteína quinasa dependiente del ADN: un objetivo para una proteasa similar a ICE en la apoptosis", El diario EMBO, vol. 15, no. 13, págs. 3238–3246, 1996. Ver en: Google Scholar
  56. H. Teraoka, Y. Yumoto, F. Watanabe et al., "CPP32 / Yama / apopain escinde el componente catalítico de la proteína quinasa dependiente del ADN en la holoenzima", Las letras FEBS, vol. 393, no. 1, págs. 1–6, 1996. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  57. S. Kumar, P. Pandey, A. Bharti et al., "Regulación de la proteína quinasa dependiente del ADN por la tirosina quinasa Lyn", La revista de química biológica, vol. 273, no. 40, págs. 25654-25658, 1998. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  58. U. Yavuzer, G. C. M. Smith, T. Bliss, D. Werner y S. P. Jackson, "Activación de ADN-PK independiente del extremo del ADN mediada por asociación con la proteína de unión al ADN C1D", Genes y desarrollo, vol. 12, no. 14, págs. 2188–2199, 1998. Ver en: Google Scholar
  59. T. Wechsler, B. P. C. Chen, R. Harper et al., "Función de ADN-PKcs regulada específicamente por la proteína fosfatasa 5", Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América, vol. 101, no. 5, págs. 1247–1252, 2004. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  60. S. Jin, S. Kharbanda, B. Mayer, D. Kufe y D. T. Weaver, "Unión de Ku y c-Abl en la región de homología de quinasa de la subunidad catalítica de proteína quinasa dependiente de ADN", La revista de química biológica, vol. 272, no. 40, págs. 24763–24766, 1997. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  61. X. Wu y M. R. Lieber, "Interacción entre la proteína quinasa dependiente del ADN y una proteína nueva, KIP", Investigación de mutaciones / reparación de ADN, vol. 385, no. 1, págs. 13-20, 1997. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  62. R. Bosotti, A. Isacchi y E. L. L. Sonnhammer, "FAT: a novel domain in PIK-related kinases", Tendencias en ciencias bioquímicas, vol. 25, no. 5, págs. 225–227, 2000. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  63. M. Hammel, Y. Yu, B. L. Mahaney et al., "El ensamblaje y las conformaciones dinámicas de la proteína quinasa Ku y dependientes de ADN regulan la unión del ADN y el complejo de unión de extremos no homólogos inicial", La revista de química biológica, vol. 285, no. 2, págs. 1414–1423, 2010. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  64. A. J. Doherty y S. W. Suh, "Conservación estructural y mecanicista en ligasas de ADN", Investigación de ácidos nucleicos, vol. 28, no. 21, págs. 4051–4058, 2000. Ver en: Google Scholar
  65. T. Ellenberger y A. E. Tomkinson, "Ligasas de ADN eucariotas: conocimientos estructurales y funcionales", Revisión anual de bioquímica, vol. 77, págs. 313–338, 2008. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  66. J. M. Pascal, "Ligasas de ADN y ARN: variaciones estructurales y mecanismos compartidos", Opinión actual en biología estructural, vol. 18, no. 1, págs. 96–105, 2008. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  67. S. Shuman, "ADN ligasas: progreso y perspectivas", La revista de química biológica, vol. 284, no. 26, págs. 17365–17369, 2009. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  68. S. Shuman y C. D. Lima, "La superfamilia de enzimas de recubrimiento de ARN y ligasa de polinucleótidos de nucleotidiltransferasas covalentes", Opinión actual en biología estructural, vol. 14, no. 6, págs. 757–764, 2004. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  69. S. Shuman y B. Schwer, "Enzima de protección de ARN y ADN ligasa: una superfamilia de nucleotidil transferasas covalentes", Microbiología molecular, vol. 17, no. 3, págs. 405–410, 1995. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  70. C. Marchetti, S. A. Walker, F. Odreman, A. Vindigni, A. J. Doherty y P. Jeggo, "Identificación de un motivo novedoso en ADN ligasas ejemplificadas por ADN ligasa IV", Reparación de ADN, vol. 5, no. 7, págs. 788–798, 2006. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  71. A. G. Murzin, "OB (unión de oligonucleótidos / oligosacáridos) -fold: solución estructural y funcional común para secuencias no homólogas", El diario EMBO, vol. 12, no. 3, págs. 861–867, 1993. Ver en: Google Scholar
  72. D. A. Chistiakov, N. V. Voronova y A. P. Chistiakov, "Síndrome de ligasa IV", Revista europea de genética médica, vol. 52, no. 6, págs. 373–378, 2009. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  73. J. M. Pascal, P. J. O'Brien, A. E. Tomkinson y T. Ellenberger, "La ligasa I del ADN humano rodea completamente y desenrolla parcialmente el ADN mellado", Naturaleza, vol. 432, no. 7016, págs. 473–478, 2004. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  74. J. M. Pascal, O. V. Tsodikov, G. L. Hura et al., "Una interfaz flexible entre ADN ligasa y PCNA admite el cambio conformacional y la ligación eficiente del ADN", Célula molecular, vol. 24, no. 2, págs. 279–291, 2006. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  75. H. Nishida, S. Kiyonari, Y. Ishino y K. Morikawa, "La estructura cerrada de una ADN ligasa de arqueas de Pyrococcus furiosus", Revista de biología molecular, vol. 360, no. 5, págs. 956–967, 2006. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  76. D. J. Kim, O. Kim, H.-W. Kim, H. S. Kim, S. J. Lee y S. W. Suh, "La ADN ligasa dependiente de ATP de archaeoglobus fulgidus muestra una conformación muy cerrada", Acta Crystallographica Sección F, vol. 65, no. 6, págs. 544–550, 2009. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  77. I. V. Martin y S. A. MacNeill, "ADN ligasas dependientes de ATP", Biología del genoma, vol. 3, no. 4, artículo 3005, 2002. Ver en: Google Scholar
  78. E. Cotner-Gohara, I.-K. Kim, A. E. Tomkinson y T. Ellenberger, "Dos módulos de reconocimiento de muescas y unión al ADN en la ligasa III del ADN humano", La revista de química biológica, vol. 283, no. 16, págs. 10764–10772, 2008. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  79. A. E. Tomkinson, S. Vijayakumar, J. M. Pascal y T. Ellenberger, "ADN ligasas: estructura, mecanismo de reacción y función", Reseñas de productos químicos, vol. 106, no. 2, págs. 687–699, 2006. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  80. U. Grawunder, D. Zimmer y M. R. Lieber, "La ADN ligasa IV se une a XRCC4 a través de un motivo ubicado entre sus dominios BRCT y no dentro de ellos", Biología actual, vol. 8, no. 15, págs. 873–876, 1998. Ver en: Google Scholar
  81. Y.-G. Wang, C. Nnakwe, W. S. Lane, M. Modesti y K. M. Frank, "Fosforilación y regulación de la estabilidad de la ADN ligasa IV por la proteína quinasa dependiente del ADN", La revista de química biológica, vol. 279, no. 36, págs. 37282–37290, 2004. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  82. X. Zhang, S. Mor & # xe9ra, P. A. Bates et al., "Estructura de un dominio BRCT XRCC1: un nuevo módulo de interacción proteína-proteína", El diario EMBO, vol. 17, no. 21, págs. 6404–6411, 1998. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  83. P. Bork, K. Hofmann, P. Bucher, A. F. Neuwald, S. F. Altschul y E. V. Koonin, "Una superfamilia de dominios conservados en proteínas de puntos de control del ciclo celular que responden al daño del ADN", El diario FASEB, vol. 11, no. 1, págs. 68–76, 1997. Ver en: Google Scholar
  84. S. Costantini, L. Woodbine, L. Andreoli, P. A. Jeggo y A. Vindigni, "Interacción del heterodímero Ku con el complejo ADN ligasa IV / Xrcc4 y su regulación por ADN-PK", Reparación de ADN, vol. 6, no. 6, págs. 712–722, 2007. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  85. E. N. Shiozaki, L. Gu, N. Yan e Y. Shi, "Estructura de las repeticiones BRCT de BRCA1 unidas a un fosfopéptido BACH1: implicaciones para la señalización", Célula molecular, vol. 14, no. 3, págs. 405–412, 2004. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  86. J. A. Clapperton, I. A. Manke, D. M. Lowery et al., "Estructura y mecanismo del reconocimiento del dominio BRCA1 BRCT de BACH1 fosforilado con implicaciones para el cáncer", Biología estructural y molecular de la naturaleza, vol. 11, no. 6, págs. 512–518, 2004. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  87. R. S. Williams, M. S. Lee, D. D. Hau y J. N. M. Glover, "Base estructural del reconocimiento de fosfopéptidos por el dominio BRCT de BRCA1", Biología estructural y molecular de la naturaleza, vol. 11, no. 6, págs. 519–525, 2004. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  88. M. Stucki, J. A. Clapperton, D. Mohammad, M. B. Yaffe, S. J. Smerdon y S. P. Jackson, "MDC1 se une directamente a la histona H2AX fosforilada para regular las respuestas celulares a las roturas de la doble hebra del ADN", Celda, vol. 123, no. 7, págs. 1213–1226, 2005. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  89. A. K. Varma, R. S. Brown, G. Birrane y J. A. A.Ladias, "Base estructural para el control de puntos de control del ciclo celular por el complejo BRCA1-CtIP", Bioquímica, vol. 44, no. 33, págs. 10941–10946, 2005. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  90. M. L. Kilkenny, A. S. Dor & # xe9, S. M. Roe et al., "El análisis estructural y funcional del dominio Crb2-BRCT2 revela roles distintos en la señalización del punto de control y la reparación del daño del ADN", Genes y desarrollo, vol. 22, no. 15, págs. 2034–2047, 2008. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  91. R. S. Williams, G. E. Dodson, O. Limbo et al., "Nbs1 une de manera flexible a Ctp1 y Mre11-Rad50 para coordinar el procesamiento y la reparación de roturas de doble cadena del ADN", Celda, vol. 139, no. 1, págs. 87–99, 2009. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  92. J. Lloyd, J. R. Chapman, J. A. Clapperton et al., "Una arquitectura de repetición FHA / BRCT supramodular media la función del adaptador Nbs1 en respuesta al daño del ADN", Celda, vol. 139, no. 1, págs. 100–111, 2009. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  93. J. S. Williams, R. S. Williams, C. L. Dovey, G. Guenther, J. A. Tainer y P. Russell, “& # x3b3h2A se une a Brc1 para mantener la integridad del genoma durante la fase S ”, El diario EMBO, vol. 29, no. 6, págs. 1136–1148, 2010. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  94. P.-Y. Wu, P. Frit, S. Meesala et al., "Interacción estructural y funcional entre las proteínas de reparación del ADN humano ADN ligasa IV y XRCC4", Biología molecular y celular, vol. 29, no. 11, págs. 3163–3172, 2009. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  95. A. S. Dor & # xe9, N. Furnham, O. R. Davies et al., "La estructura de un complejo ortólogo de levadura Xrcc4-DNA ligasa IV revela un nuevo modo de interacción BRCT", Reparación de ADN, vol. 5, no. 3, págs. 362–368, 2006. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  96. X. Yu, C. C. S. Chini, M. He, G. Mer y J. Chen, "El dominio BRCT es un dominio de unión a fosfoproteínas", Ciencias, vol. 302, no. 5645, págs. 639–642, 2003. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  97. M. Rodríguez, X. Yu, J. Chen y Z. Songyang, "Especificidades de unión de fosfopéptidos de los dominios BRCA1 COOH-terminal (BRCT)", La revista de química biológica, vol. 278, no. 52, págs. 52914–52918, 2003. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  98. J. N. M. Glover, R. S. Williams y M. S. Lee, "Interacciones entre las repeticiones BRCT y las fosfoproteínas: enredadas en dos", Tendencias en ciencias bioquímicas, vol. 29, no. 11, págs. 579–585, 2004. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  99. K. Imami, N. Sugiyama, Y. Kyono, M. Tomita e Y. Ishihama, "Análisis automatizado de fosfoproteomas para células cancerosas cultivadas mediante nanoLC-MS bidimensional utilizando una columna bifásica de titania / C18 calcinada", Ciencias analíticas, vol. 24, no. 1, págs. 161–166, 2008. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  100. S. Unal, K. Cerosaletti, D. Uckan-Cetinkaya, M. Cetin y F. Gumruk, "Una nueva mutación en una familia con síndrome de deficiencia de ADN ligasa IV", Sangre y cáncer pediátricos, vol. 53, no. 3, págs. 482–484, 2009. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  101. Y. Li, D. Y. Chirgadze, V. M. Bolaños-García et al., "La estructura cristalina de XLF / Cernunnos humanos revela diferencias inesperadas de XRCC4 con implicaciones para NHEJ", El diario EMBO, vol. 27, no. 1, págs. 290–300, 2008. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  102. M. Modesti, M. S. Junop, R. Ghirlando et al., "La interacción entre la tetramerización y la ADN ligasa IV de la proteína de reparación de rotura de doble cadena del ADN XRCC4 son mutuamente excluyentes". Revista de biología molecular, vol. 334, no. 2, págs. 215–228, 2003. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  103. M. S. Junop, M. Modesti, A. Guarn & # xe9, R. Ghirlando, M. Gellert y W. Yang, "Estructura cristalina de la proteína de reparación del ADN Xrcc4 e implicaciones para la unión de extremos", El diario EMBO, vol. 19, no. 22, págs. 5962–5970, 2000. Ver en: Google Scholar
  104. M. A. Recuero-Checa, A. S. Dor & # xe9, E. Arias-Palomo et al., "Microscopía electrónica de Xrcc4 y el complejo de reparación de ADN ligasa IV-Xrcc4", Reparación de ADN, vol. 8, no. 12, págs. 1380-1389, 2009. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  105. R. Mizuta, H.-L. Cheng, Y. Gao y F. W. Alt, "Caracterización genética molecular de la función XRCC4", Inmunología internacional, vol. 9, no. 10, págs. 1607–1613, 1997. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  106. Y. Yu, W. Wang, Q. Ding et al., "Los sitios de fosforilación de ADN-PK en XRCC4 no son necesarios para la supervivencia después de la radiación o para la recombinación V (D) J", Reparación de ADN, vol. 2, no. 11, págs. 1239-1252, 2003. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  107. C. A. Koch, R. Agyei, S. Galicia et al., "Xrcc4 une físicamente el procesamiento del extremo del ADN mediante la polinucleótido quinasa a la ligadura del ADN mediante la ligasa IV del ADN", El diario EMBO, vol. 23, no. 19, págs. 3874–3885, 2004. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  108. N. K. Bernstein, R. S. Williams, M. L. Rakovszky et al., "La arquitectura molecular de la enzima reparadora del ADN de mamíferos, polinucleótido quinasa", Célula molecular, vol. 17, no. 5, págs. 657–670, 2005. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  109. V. Yurchenko, Z. Xue y M. J. Sadofsky, "La modificación SUMO de XRCC4 humana regula su localización y función en la reparación de roturas de doble cadena del ADN", Biología molecular y celular, vol. 26, no. 5, págs. 1786–1794, 2006. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  110. Y. Dai, B. Kysela, L. A. Hanakahi et al., "La unión de extremos no homólogos y la recombinación V (D) J requieren un factor adicional" Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América, vol. 100, no. 5, págs. 2462–2467, 2003. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  111. P. Hentges, P. Ahnesorg, R. S. Pitcher et al., "Conservación evolutiva y funcional de la proteína de unión de extremos no homóloga de ADN, XLF / Cernunnos", La revista de química biológica, vol. 281, no. 49, págs. 37517–37526, 2006. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  112. S. N. Andres, M. Modesti, C. J. Tsai, G. Chu y M. S. Junop, "Estructura cristalina de XLF humano: un giro en la unión de extremos de ADN no homólogo", Célula molecular, vol. 28, no. 6, págs. 1093–1101, 2007. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  113. C. J. Tsai, S. A. Kim y G. Chu, "Cernunnos / XLF promueve la ligadura de extremos de ADN no coincidentes y no cohesivos", Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América, vol. 104, no. 19, págs. 7851–7856, 2007. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  114. K. Akopiants, R.-Z. Zhou, S. Mohapatra et al., "Requisito de XLF / Cernunnos en el llenado de huecos basado en alineación mediante ADN polimerasas & # x3bb y & # x3bc para la unión de extremos no homólogos en extractos de células enteras humanas", Investigación de ácidos nucleicos, vol. 37, no. 12, págs. 4055–4062, 2009. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  115. R. Harris, D. Esposito, A. Sankar et al., "La estructura de la solución 3D de la región C-terminal de Ku86 (Ku86CTR)", Revista de biología molecular, vol. 335, no. 2, págs. 573–582, 2004. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  116. Z. Zhang, W. Hu, L. Cano, T. D. Lee, D. J. Chen e Y. Chen, "La estructura de la solución del dominio C-terminal de Ku80 sugiere sitios importantes para las interacciones proteína-proteína", Estructura, vol. 12, no. 3, págs. 495–502, 2004. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  117. A. Rivera-Calzada, L. Spagnolo, L. H. Pearl y O. Llorca, "Modelo estructural del heterodímero Ku70-Ku80 humano de longitud completa y su reconocimiento de ADN y ADN-PKcs", Informes EMBO, vol. 8, no. 1, págs. 56–62, 2007. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  118. J. Boskovic, A. Rivera-Calzada, J. D. Maman et al., "Visualización de cambios conformacionales inducidos por el ADN en la reparación del ADN Quinasa ADN-PKcs", El diario EMBO, vol. 22, no. 21, págs. 5875–5882, 2003. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  119. J. J. Perry, E. Cotner-gohara, T. Ellenberger y J. A. Tainer, "Dinámica estructural en la señalización y reparación de daños en el ADN", Opinión actual en biología estructural, vol. 20, no. 3, págs. 283–294, 2010. Ver en: Google Scholar
  120. X. Chen, JD Ballin, J. Della-Maria et al., “La cinética distintiva de las ligasas I, III y # x3b1, III y # x3b2 y IV del ADN humano revela la capacidad de detección directa del ADN y las funciones fisiológicas diferenciales en la reparación del ADN, " Reparación de ADN, vol. 8, no. 8, págs. 961–968, 2009. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  121. J. Gu, H. Lu, B. Tippin, N. Shimazaki, M. F. Goodman y M. R. Lieber, "XRCC4: ADN ligasa IV puede ligar extremos de ADN incompatibles y puede ligar a través de espacios" El diario EMBO, vol. 26, no. 4, págs. 1010–1023, 2007. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  122. J. Gu, H. Lu, A. G. Tsai, K. Schwarz y M. R. Lieber, "Ligación de ADN monocatenario y ligación de extremos de ADN incompatible estimulada por XLF por el complejo XRCC4-ADN ligasa IV: influencia de la secuencia de ADN terminal", Investigación de ácidos nucleicos, vol. 35, no. 17, págs. 5755–5762, 2007. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  123. B. Kysela, A. J. Doherty, M. Chovanec et al., "La estimulación con Ku de la ligadura dependiente de la ADN ligasa IV requiere un movimiento hacia adentro a lo largo de la molécula de ADN", La revista de química biológica, vol. 278, no. 25, págs. 22466–22474, 2003. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  124. L. Chen, K. Trujillo, P. Sung y A. E. Tomkinson, "Interacciones del complejo ADN ligasa IV-XRCC4 con extremos de ADN y proteína quinasa dependiente de ADN", La revista de química biológica, vol. 275, no. 34, págs. 26196–26205, 2000. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  125. W. S. Joo, P. D. Jeffrey, S. B. Cantor, M. S. Finnin, D. M. Livingston y N. P. Pavletich, "Estructura de la región 53BP1 BRCT unida a p53 y su comparación con la estructura Brca1 BRCT", Genes y desarrollo, vol. 16, no. 5, págs. 583–593, 2002. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  126. D. J. Derbyshire, B. P. Basu, L. C. Serpell et al., "Estructura cristalina de dominios humanos 53BP1 BRCT unidos al supresor tumoral p53", El diario EMBO, vol. 21, no. 14, págs. 3863–3872, 2002. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  127. T. Ochi, V.M. Bolaños-García, V. Stojanoff y A. Moreno, "Perspectives on protein cristalisation", Progreso en biofísica y biología molecular, vol. 101, no. 1 & # x20133, págs. 56–63, 2009. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  128. M. A. Recuero-Checa, A. S. Dor & # xe9, E. Arias-Palomo et al., "Microscopía electrónica de Xrcc4 y el complejo de reparación de ADN ligasa IV-Xrcc4", Reparación de ADN, vol. 8, no. 12, págs. 1380-1389, 2009. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  129. T. Ochi, J. G. Grossmann, V. M. Bolaños-García y T. L. Blundell, Se publicará.
  130. D. I. Svergun, "Restauración de la estructura de baja resolución de macromoléculas biológicas a partir de la dispersión de soluciones mediante recocido simulado", Revista biofísica, vol. 76, págs. 2879–2886, 1999. Ver en: Google Scholar
  131. V. V. Volkov y D. I. Svergun, "Singularidad de la determinación de la forma ab initio en la dispersión de ángulos pequeños", Revista de Cristalografía Aplicada, vol. 36, no. 3 I, págs. 860–864, 2003. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  132. E. F. Pettersen, T. D. Goddard, C. C. Huang et al., "UCSF Chimera & # x2014a sistema de visualización para investigación exploratoria y análisis", Revista de química computacional, vol. 25, no. 13, págs. 1605–1612, 2004. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  133. E. Riballo, L. Woodbine, T. Stiff, S. A. Walker, A. A. Goodarzi y P. A. Jeggo, "XLF-Cernunnos promueve la re-adenilación de la ADN ligasa IV-XRCC4 después de la ligadura", Investigación de ácidos nucleicos, vol. 37, no. 2, págs. 482–492, 2009. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  134. R. A. Deshpande y T. E. Wilson, "Modos de interacción entre las proteínas de levadura Nej1, Lif1 y Dnl4 y comparación con XLF, XRCC4 y Lig4 humanos", Reparación de ADN, vol. 6, no. 10, págs. 1507–1516, 2007. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  135. H. Lu, U. Pannicke, K. Schwarz y M. R. Lieber, “Unión dependiente de la longitud de XLF humano al ADN y estimulación de XRCC4& # xb7Actividad de la ADN ligasa IV " La revista de química biológica, vol. 282, no. 15, págs. 11155–11162, 2007. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  136. K.-I. Yano y D. J. Chen, "Las imágenes de células vivas de XLF y XRCC4 revelan una visión novedosa del ensamblaje de proteínas en la vía de unión de extremos no homóloga", Ciclo celular, vol. 7, no. 10, págs. 1321–1325, 2008. Ver en: Google Scholar
  137. B. Kastner, N. Fischer, M. M. Golas et al., "GraFix: preparación de muestras para criomicroscopía electrónica de una sola partícula", Métodos de la naturaleza, vol. 5, no. 1, págs. 53–55, 2008. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  138. T. L. Blundell, H. Jhoti y C. Abell, "Cristalografía de alto rendimiento para el descubrimiento de plomo en el diseño de fármacos", Nature Reviews Descubrimiento de medicamentos, vol. 1, no. 1, págs. 45–54, 2002. Ver en: Google Scholar
  139. T. L. Blundell, B. L. Sibanda, R. W. Montalv & # xe3o et al., "Biología estructural y bioinformática en el diseño de fármacos: oportunidades y desafíos para la identificación de objetivos y el descubrimiento de clientes potenciales", Transacciones filosóficas de la Royal Society B, vol. 361, no. 1467, págs. 413–423, 2006. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  140. M. Congreve, C. W. Murray y T. L. Blundell, "Revisión principal: biología estructural y descubrimiento de fármacos", Descubrimiento de fármacos hoy, vol. 10, no. 13, págs. 895–907, 2005. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  141. W. L. DeLano, El sistema de gráficos moleculares PyMOL, DeLano Scientific LLC, Palo Alto, California, EE. UU., 2008, http://www.pymol.org.

Derechos de autor

Copyright & # xa9 2010 Takashi Ochi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo la licencia de atribución de Creative Commons, que permite el uso, distribución y reproducción sin restricciones en cualquier medio, siempre que el trabajo original se cite correctamente.


Biología de las células madre con respecto a la carcinogénesis Aspectos de la protección radiológica

Cita recomendada
ICRP, 2015. Biología de células madre con respecto a los aspectos de carcinogénesis de la protección radiológica. Publicación 131 de la ICRP. Ann. ICRP 44 (3/4).

Autores en nombre de la ICRP
O. Niwa, M.H. Barcellos-Hoff, R.K. Globus, J.D. Harrison, J.H. Hendry, P. Jacob, M.T. Martín, T.M. Semilla, J.W. Shay, M.D. Story, K. Suzuki, S. Yamashita

Abstracto - Este informe proporciona una revisión de las células madre / células progenitoras y sus respuestas a las radiaciones ionizantes en relación con cuestiones relacionadas con los efectos estocásticos de la radiación que forman una parte importante del sistema de protección radiológica de la Comisión Internacional de Protección Radiológica. La información actual sobre las características, el mantenimiento y la renovación de las células madre, la evolución con la edad, la ubicación en los nichos de las células madre y la radiosensibilidad a exposiciones agudas y prolongadas se presenta en una serie de revisiones sustanciales como anexos sobre tejido hematopoyético, glándula mamaria, tiroides, sistema digestivo. tracto, pulmón, piel y hueso. Esta base de conocimiento de las células madre se utiliza en el texto principal del informe para proporcionar una visión biológica de cuestiones como el modelo lineal sin umbral (LNT), el riesgo de cáncer entre los tejidos, los efectos de la tasa de dosis y los cambios en el riesgo. de la carcinogénesis por radiación según la edad de exposición y la edad alcanzada.
El conocimiento de la biología y la biología de la radiación asociada de las células madre y las células progenitoras está más desarrollado en tejidos que se renuevan con bastante rapidez, como el tejido hematopoyético, la mucosa intestinal y la epidermis, aunque todos los tejidos aquí considerados poseen poblaciones de células madre.
Las características importantes del mantenimiento, la renovación y la respuesta de las células madre son las señales microambientales que operan en el nicho de residencia, para las cuales se ha identificado una ubicación espacial bien definida en algunos tejidos. La identidad de la célula diana para la carcinogénesis continúa apuntando a la población de células madre más primitiva que está en su mayoría inactiva y, por lo tanto, es capaz de acumular la secuencia prolongada de mutaciones necesarias para producir una malignidad. Además, existe cierto potencial para que las células progenitoras hijas sean células diana en casos particulares, como en el tejido hematopoyético y en la piel. Varios procesos biológicos podrían contribuir a proteger a las células madre de la acumulación de mutaciones: (a) reparación precisa del ADN (b) muerte rápidamente inducida de las células madre lesionadas (c) retención de la hebra de la plantilla de ADN durante las divisiones en algunos sistemas de tejidos, de modo que las mutaciones son pasa a las células diferenciadoras hijas y no se retiene en la célula parental y (d) competencia de células madre, por lo que las células madre no dañadas compiten con las células madre dañadas para residir en el nicho. La reparación del ADN ocurre principalmente a los pocos días de la irradiación, mientras que la competencia de células madre requiere semanas o muchos meses, según el tipo de tejido.
Los procesos antes mencionados pueden contribuir a las diferencias en los valores de riesgo de radiación carcinogénica entre tejidos y pueden ayudar a explicar por qué un tejido que se replica rápidamente, como el intestino delgado, es menos propenso a ese riesgo. Los procesos también proporcionan una visión mecanicista relevante para el modelo LNT y los modelos de riesgo relativo y absoluto. El conocimiento radiobiológico también proporciona una visión científica de los debates sobre el factor de eficacia de la dosis y la tasa de dosis que se utilizan actualmente en las directrices de protección radiológica. Además, la información biológica contribuye a las posibles razones de la sensibilidad dependiente de la edad a la carcinogénesis por radiación, incluidos los efectos de la exposición intrauterina.


Apertura de becario de posdoctorado bioquímico en SIBYLS

SIBYLS se complace en anunciar que tenemos la apertura de un becario postdoctoral bioquímico. Esta es una gran oportunidad para trabajar con científicos innovadores y experimentados en el campo de la biología estructural. Buscamos a alguien que quiera desarrollar y aplicar la biología para macromoléculas biológicas multicomponente. Formarás parte de un equipo que diseña, desarrolla y aplica métodos de sincrotrón para caracterizar macromoléculas y los ensamblajes que forman. Además de todo eso, obtendrá una vista increíble y en constante cambio de la bahía, el horizonte de San Francisco y tanto el puente Golden Gate como los puentes de la bahía. Para obtener más información y postularse, vaya aquí.


Los fundamentos tecnológicos de la ingeniería del genoma

La ingeniería del genoma se habilita aprovechando las vías de reparación del ADN de la célula (revisado en [5]). La mayoría de las técnicas de ingeniería del genoma dirigen la reparación de las roturas de doble cadena del ADN (DSB), que se introducen en el genoma en o cerca del sitio donde se desea una modificación de la secuencia de ADN. Los DSB dirigidos se logran utilizando nucleasas específicas de secuencia (SSN), enzimas que reconocen y escinden el locus diana con alta especificidad. La reparación de la rotura se puede dirigir para crear una variedad de modificaciones de la secuencia de ADN dirigida, que van desde deleciones de ADN hasta la inserción de grandes conjuntos de transgenes.

Actualmente, existen cuatro clases principales de SSN: endonucleasas o meganucleasas autodirigidas, nucleasas con dedos de zinc (ZFN), nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción (TALEN) y reactivos de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente intercaladas (CRISPR) / Cas9 (Figura 1). Las meganucleasas son enzimas naturales que se unen y escinden grandes objetivos de secuencias de ADN (de 12 a 40 pb) (Figura 1A) [6], [7]. Las meganucleasas pueden diseñarse para reconocer nuevos sitios; sin embargo, los cambios en la especificidad del sitio objetivo son difíciles de lograr y, a menudo, resultan en una reducción de la actividad catalítica, lo que ha dificultado su uso generalizado [7]. Las ZFN, por el contrario, se unen al ADN a través de una serie de proteínas de dedos de zinc diseñadas, que se fusionan con el dominio catalítico de la endonucleasa FokI (Figura 1B) [8], [9]. FokI funciona como un dímero, por lo que la escisión se produce cuando dos ZFN se unen a sus objetivos y acercan los monómeros FokI. Los TALEN son similares a los ZFN en que tienen un dominio de unión al ADN fusionado a FokI; sin embargo, el reconocimiento del ADN por los TALEN se logra a través de matrices del motivo efector TAL (Figura 1C) [10], [11]. El motivo efector TAL es altamente modular, y virtualmente cualquier secuencia de ADN puede ser dirigida con TALEN con alta eficiencia, lo que los hace más fáciles de diseñar que los ZFN. La adición más reciente al arsenal SSN es el sistema CRISPR / Cas9. Con CRISPR / Cas9, la focalización se logra a través de un ARN guía que se empareja con una secuencia diana cromosómica específica (Figura 1D) [12], [13]. El complejo de ARN / ADN resultante es luego escindido por la nucleasa Cas9. La selección de ADN a través del emparejamiento de bases evita la necesidad de diseñar una matriz de efectores TAL o dedo de zinc de secuencia específica y, en consecuencia, los reactivos CRIPSR / Cas9 están emergiendo rápidamente como el SSN de elección. Mientras que la capacidad de diseñar SSN con la especificidad de ADN requerida fue durante mucho tiempo un cuello de botella para la ingeniería del genoma, ahora se puede lograr la selección de ADN con una eficiencia mucho mayor. Ciertamente, quedan muchos desafíos en términos de la entrega de reactivos de ingeniería del genoma a las células vegetales, pero el progreso en este frente también avanza a un ritmo rápido [14], [15].

(A) La meganucleasa, I-SceI, se muestra unida a su ADN diana. El dominio catalítico, que también determina la especificidad de la secuencia de ADN, se muestra en rojo. (B) Se ilustra un dímero de ZFN unido al ADN. Los objetivos de ZFN están unidos por dos dominios de unión al ADN con dedos de zinc (azul oscuro) separados por una secuencia espaciadora de 5-7 pb. La escisión de FokI se produce dentro del espaciador. Cada dedo de zinc normalmente reconoce 3 pb. (C) Se representa un dímero de TALEN unido al ADN. Los dominios de unión al ADN están en azul oscuro. Los dos sitios objetivo de TALEN suelen estar separados por una secuencia espaciadora de 15 a 20 pb. Al igual que los ZFN, las matrices de repetición del efector TAL se fusionan con FokI. Cada motivo efector TAL reconoce una base. (D) El sistema CRISPR / Cas9 reconoce el ADN a través del emparejamiento de bases entre las secuencias de ADN en el sitio objetivo y un ARN guía basado en CRISPR (ARNg). Cas9 tiene dos dominios de nucleasa (mostrados por puntas de flecha rojas) que cada uno escinde una hebra de ADN de doble hebra.

¿Cómo permiten los DSB dirigidos modificaciones precisas del genoma? Una vez que se introducen las roturas en el cromosoma, un mecanismo para la reparación de la rotura es la unión de extremos no homólogos (NHEJ) (Figura 2A) [16], [17]. Aunque el NHEJ es a menudo preciso, se pueden introducir pequeñas deleciones o, más raramente, inserciones en la unión del cromosoma recién reunido. Si la modificación de la secuencia provoca una mutación de desplazamiento del marco de lectura o altera residuos de aminoácidos clave en el producto del gen diana, se puede crear una mutación knockout (pérdida de función). Los extremos de los cromosomas rotos también se pueden unir a otras moléculas de ADN que se introducen en la célula simultáneamente con el SSN. La captura de secuencias de ADN heterólogas se puede utilizar para lograr un gen objetivo (inserción dirigida) (Figura 2A). Por último, si se introducen dos roturas en el cromosoma simultáneamente, pueden producirse deleciones de genes específicos u otros reordenamientos (Figura 2B). La reparación del ADN a través de NHEJ es claramente un medio poderoso para lograr modificaciones específicas de la secuencia del ADN.

(A) La reparación mediada por NHEJ puede resultar en pequeñas deleciones o inserciones en los sitios objetivo que pueden alterar la función de los genes (knock-outs, izquierda). Los fragmentos de ADN se pueden insertar mediante ligación mediada por NHEJ para crear inserciones dirigidas (knock-ins, derecha). (B) Cuando los SSN hacen dos cortes, la reparación mediada por NHEJ puede resultar en deleciones o inversiones de grandes regiones genómicas (izquierda) o deleciones de genes dirigidos o translocaciones cromosómicas (derecha). (C) La reparación mediada por HR, que involucra una plantilla de ADN homóloga, conduce al reemplazo de genes o la inserción de genes.

La recombinación homóloga (HR) es un medio alternativo para reparar un cromosoma roto. En HR, se utiliza una plantilla de reparación como fuente de información de la secuencia de ADN que se copia en el cromosoma roto para restaurar su integridad (Figura 2C) [18], [19]. La HR se puede aprovechar para lograr modificaciones de la secuencia de ADN específicas introduciendo en la célula un SSN y una plantilla de reparación de ADN con una secuencia similar al sitio de ruptura (este proceso se conoce como orientación genética). La variación de secuencia que lleva la plantilla de reparación es copiada por HR en el cromosoma, logrando así la modificación de la secuencia de ADN dirigida. Debido a que el usuario especifica el tipo de variación de secuencia en las plantillas de reparación, HR ofrece numerosas posibilidades para manipular genomas de plantas. Por ejemplo, se pueden conseguir genes knock-ins dirigidos usando moldes de reparación de ADN con uno o más transgenes flanqueados por secuencias homólogas al sitio diana. También se pueden lograr modificaciones más sutiles de la secuencia de ADN, incluidas las alteraciones de los residuos de aminoácidos clave dentro de la secuencia codificante de un gen, o cambios en los elementos promotores u otros motivos que actúan en cis que controlan la expresión génica. Por lo tanto, la reparación del ADN por HR proporciona una capacidad sin precedentes para manipular el genotipo de una planta y, en consecuencia, su fenotipo.


3.4: Reparación del ADN - Biología

El propósito de este lugar es convertirse en un punto de encuentro abierto para aquellos interesados ​​en estudios que involucren la función y dinámica de los genomas. Es atendido por los Laboratorios y Unidades de Investigación de CABIMER trabajando sobre los factores y mecanismos que conforman la Biología del Genoma. Cubre temas de investigación como la replicación del ADN, la reparación del ADN, la recombinación del ADN, la segregación cromosómica, la transcripción, la epigenética, la genómica funcional y estructural, el control del ciclo celular y la respuesta al daño del ADN, con énfasis en los enfoques dedicados a comprender el envejecimiento, el cáncer y las enfermedades genéticas.

Todo aquel interesado en el campo, con especial atención a Estudiantes de Licenciaturas en Ciencias de la Vida (Biología, Biomedicina, Biotecnología, Bioquímica, Medicina, Farmacia, Química, Veterinaria, etc.) y Profesionales que quieran ampliar o actualizar sus conocimientos o planeen iniciar o Si siguen una carrera científica en Biología del Genoma, son bienvenidos a formar parte de este proyecto.

-2014. Junio. II Encuentro de Biología del Genoma de CABIMER. CABIMER, Sevilla, ES


¿Cómo funciona el ADN?

El ADN transporta la información para producir todas las proteínas de la célula. Estas proteínas implementan todas las funciones de un organismo vivo y determinan las características del organismo. Cuando la célula se reproduce, tiene que transmitir toda esta información a las células hijas.

Antes de que una célula pueda reproducirse, primero debe reproducir exactamenteo hacer una copia de su ADN. El lugar donde se produce la replicación del ADN depende de si las células son procariotas o eucariotas (consulte la barra lateral de ARN en la página anterior para obtener más información sobre los tipos de células). La replicación del ADN ocurre en el citoplasma de procariotas y en el núcleo de eucariotas. Independientemente de dónde se produzca la replicación del ADN, el proceso básico es el mismo.

La estructura del ADN se presta fácilmente a la replicación del ADN. Cada lado de la doble hélice corre en sentido opuesto (antiparalelo) direcciones. La belleza de esta estructura es que se puede abrir por la mitad y cada lado puede servir como patrón o plantilla para el otro lado (llamado replicación semiconservativa). Sin embargo, el ADN no se descomprime por completo. Se abre en un área pequeña llamada horquilla de replicación, que luego se mueve a lo largo de toda la molécula.

  1. Una enzima llamada ADN girasa hace un corte en la doble hélice y cada lado se separa
  2. Una enzima llamada helicasa desenrolla el ADN de doble hebra
  3. Varias proteínas pequeñas llamadas proteínas de unión de una sola hebra (SSB) se unen temporalmente a cada lado y los mantienen separados
  4. Un complejo enzimático llamado ADN polimerasa "camina" por las hebras de ADN y agrega nuevos nucleótidos a cada hebra. Los nucleótidos se emparejan con los nucleótidos complementarios en el soporte existente (A con T, G con C).
  5. Una subunidad de la ADN polimerasa. correcciones el nuevo ADN
  6. Una enzima llamada ADN ligasa sella los fragmentos en una hebra larga y continua
  7. Las nuevas copias terminan automáticamente de nuevo

Los diferentes tipos de células replicaron su ADN a diferentes velocidades. Algunas células se dividen constantemente, como las del cabello, las uñas y las células de la médula ósea. Otras células pasan por varias rondas de división celular y se detienen (incluidas las células especializadas, como las del cerebro, los músculos y el corazón). Finalmente, algunas células dejan de dividirse, pero se puede inducir a que se dividan para reparar lesiones (como las células de la piel y las células del hígado). En las células que no se dividen constantemente, las señales para la replicación / división celular del ADN vienen en forma de sustancias químicas. Estos químicos pueden provenir de otras partes del cuerpo (hormonas) o del medio ambiente.

El ADN de todos los organismos vivos tiene la misma estructura y código, aunque algunos virus usan ARN como portador de información en lugar de ADN. La mayoría de los animales tienen dos copias de cada cromosoma. Por el contrario, las plantas pueden tener más de dos copias de varios cromosomas, que generalmente surgen de errores en la distribución de los cromosomas durante la reproducción celular. En los animales, este tipo de error suele provocar enfermedades genéticas que suelen ser fatales. Por algunas razones desconocidas, este tipo de error no es tan devastador para las plantas.


Ver el vídeo: REPLICACIÓN DE ADN, REPARACIÓN Y MUTACIONES (Julio 2022).


Comentarios:

  1. Alhrik

    Por supuesto. Y me encontré con esto. Discutamos este tema.

  2. Tarif

    ¡¡¡Realmente me gustó mucho!!!

  3. Deverel

    Le recomiendo que vaya al sitio donde hay muchos artículos sobre el tema que le interesan.

  4. Marmion

    ¡Qué audacia!

  5. Votaur

    Creo que no tienes razón. Puedo probarlo. Escríbeme en PM, hablamos.



Escribe un mensaje