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¿El tampón de muestra requiere EDTA para la separación de proteínas en SDS PAGE?

¿El tampón de muestra requiere EDTA para la separación de proteínas en SDS PAGE?


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En la preparación del tampón de muestra, agregamos EDTA, pero si SDS-PAGE es para proteínas, ¿es necesario agregar EDTA en el tampón de muestra? ¿Cuál es el papel del EDTA en el tampón de muestra para la separación de proteínas para SDS-PAGE?


El EDTA es un agente complejante para los cationes bivalentes y generalmente se usa para inhibir enzimas (proteasas, nucleasas) que necesitan estos iones en su centro activo para funcionar. Sin él no atacan la muestra.

La presencia de EDTA en el tampón de muestra es interesante, ya que el artículo original de Laemmli de 1970 ("Escisión de proteínas estructurales durante el ensamblaje de la cabeza del bacteriófago T4") no lo usa y creo que no es necesario.

La razón de esto es simple: las muestras de proteínas generalmente se generan en tampones que contienen diferentes inhibidores de proteasa, que protegen las muestras. Además, el propósito del tampón de muestra es desnaturalizar (al menos para los geles SDS estándar) la muestra de proteína por completo, para que funcione de manera uniforme. Ambos pasos aseguran que las proteasas estén inhibidas o completamente desnaturalizadas, lo que protegerá la muestra.

La única razón que se me ocurre para usar EDTA es que puede ayudar a desestabilizar la proteína objetivo, cuando un cofactor que es importante para la estructura se compleja con EDTA y, por lo tanto, lo mantiene en solución después de la desnaturalización.

Por supuesto, hay recursos que afirman que el EDTA es necesario para la integridad de las proteínas, pero solo dicen que está ahí para inhibir las proteasas al formar complejos con iones metálicos (ver aquí, por ejemplo).

Como tampón de muestra 2x, utilizo la siguiente receta (esto también se puede hacer 5x si es necesario), que contiene EDTA, pero también se puede prescindir. Si prefiere el β-mercaptoetanol, puede utilizarlo en la misma concentración que el DTT (que tiene la ventaja de ser menos oloroso):

2x tampón de muestra:

  • SDS al 4%
  • 20% de glicerol
  • EDTA 2 mM (ácido etilendiaminotetraacético) - se puede hacer sin
  • Tris-Cl 100 mM, pH 6,8
  • DTT 200 mM (ditiotreitol)
  • Tinte azul de bromofenol al 0,1% (p / v)

Estoy de acuerdo con los otros comentarios pero quiero agregar algo. EDTA actúa como estabilizador de bME. Si tiene bME en su búfer de muestra 5x y desea almacenarlo durante un período prolongado, agregue EDTA; de lo contrario, tendrá una gran pérdida de actividad. https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Product_Information_Sheet/1/m7154pis.pdf


Ver el vídeo: Laboratório em Bioquímica - Eletroforese SDS-PAGE (Mayo 2022).