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¿Qué tan útil es el modelo metabólico humano para predecir la biomasa?

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Para utilizar el modelo metabólico humano para el análisis de equilibrio de flujo de líneas celulares de cáncer específicas, nos gustaría saber qué tipo de valores de flujo se han determinado para el modelo metabólico humano.

Básicamente, ¿qué tan útil es para predecir la producción de biomasa en humanos (hasta cierto punto)? Si no es muy bueno para esto, ¿qué otras opciones hay?

¡Muchas gracias!


En primer lugar, es importante recordar que el análisis de equilibrio de flujo calcula los límites de rendimiento teóricos, es decir, el comportamiento teóricamente óptimo del sistema con respecto al objetivo y las restricciones. Cuando las células bacterianas en crecimiento que crecen en cultivo evolucionan bajo presión de selección para la producción de biomasa, el límite teórico en la producción de biomasa puede acercarse, ver, por ejemplo, Ibarra et al: Naturaleza. 14 de noviembre de 2002; 420 (6912): 186-9. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12432395) y Fong & Palsson: Nat Genet. Octubre de 2004; 36 (10): 1056-8 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15448692).

Se debe considerar en qué medida se puede esperar que otros sistemas se acerquen a la optimización, caso por caso, y las restricciones deben ser realistas. En los seres humanos, por ejemplo, cabría esperar que la fisiología de las personas (niveles de glucosa en sangre, etc.) afectara en gran medida la tasa de crecimiento de las células cancerosas, además de la estructura del tumor (especialmente el suministro de sangre). Para las células que crecen libremente en cultivo, se podría esperar que FBA fuera más fácil de aplicar.

Para las células HeLa que crecen en cultivo, los resultados de al menos un estudio sugieren un acuerdo entre las tasas de crecimiento experimentales y las predichas por FBA: consulte Resendis-Antonio et al: Modelado del metabolismo central en células cancerosas: estudio de la topología subyacente al efecto Warburg. PLoS ONE, 5 (2010), págs. 1-11 (http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0012383)

Si se predice o no la tasa de producción de biomasa precisa, puede que en realidad no sea tan importante, y ha habido un interés considerable en aplicar FBA para estudiar varios aspectos del metabolismo del cáncer. A continuación se muestran algunos trabajos que pueden resultar de interés:

Ashwini Kumar Sharmaa, Rainer König. Enfoques de modelado de redes metabólicas para investigar el "cáncer hambriento". Seminarios en biología del cáncer 23: 4,2013, 227-234 (http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1044579X13000436) (Revisar)

Shlomi et al .: El modelado metabólico a escala genómica aclara el papel de la adaptación proliferativa en la causa del efecto Warburg. PLoS Coputational Biology 2011 (http://www.ploscompbiol.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pcbi.1002018).

Lewis y Abdel-Haleem. La evolución de modelos a escala genómica del metabolismo del cáncer. Parte delantera. Physiol., Septiembre de 2013 (http://www.frontiersin.org/Journal/10.3389/fphys.2013.00237/full). (Revisar)

Y una relevante tesis de maestría: Modelado metabólico computacional del crecimiento celular: de las bacterias al cáncer. http://www.cs.tau.ac.il/thesis/thesis/Benyamini.pdf


Predecir rescates sintéticos en redes metabólicas

*Autor correspondiente. Departamento de Física y Astronomía, Northwestern University, 2145 Sheridan Road, Evanston, IL 60208, EE. UU. Tel .: +1847491 4611 Fax: +1847491 9982 Correo electrónico: [email & # 160protected]

Un objetivo importante de la investigación médica es desarrollar métodos para recuperar la pérdida de función celular debido a mutaciones y otros defectos. Muchos enfoques basados ​​en la terapia génica tienen como objetivo reparar el gen defectuoso o insertar genes con función compensadora. Aquí, proponemos una estrategia alternativa basada en redes que tiene como objetivo restaurar la función biológica obligando a la célula a evitar las funciones afectadas por el gen defectuoso o compensar la función perdida. Centrándonos en el metabolismo de organismos unicelulares, estudiamos computacionalmente mutantes que carecen de una enzima esencial y, por lo tanto, no pueden crecer o tienen una tasa de crecimiento significativamente reducida. Mostramos que varios de estos mutantes pueden convertirse en organismos viables a través de deleciones de genes adicionales que restauran su tasa de crecimiento. De una manera bastante contradictoria, esto se logra mediante un daño adicional a la red metabólica. Utilizando enfoques basados ​​en el balance de flujo, identificamos una serie de pares de genes sintéticamente viables, en los que la eliminación de un gen que codifica una enzima da como resultado un fenotipo no viable, mientras que la eliminación de un segundo gen que codifica una enzima rescata al organismo. La identificación sistemática basada en redes de los efectos de rescate compensatorios puede abrir nuevas vías para las intervenciones genéticas.


Sinopsis

Se desarrollaron modelos metabólicos humanos de cuerpo entero, específicos para el sexo, y se limitaron con datos fisiológicos, dietéticos y metabolómicos. Recapitulan funciones metabólicas conocidas de todo el cuerpo y permiten la exploración mecanicista del co-metabolismo del microbioma del huésped.

  • Las reconstrucciones metabólicas de cuerpo entero específicas del sexo representan la función integrada de 26 órganos y seis tipos de células sanguíneas.
  • Las reconstrucciones estequiométricas del metabolismo se pueden limitar con datos fisiológicos y metabolómicos de todo el cuerpo para generar modelos personalizados.
  • Los modelos metabólicos de cuerpo entero recapitulan los ciclos metabólicos interorgánicos conocidos y el uso de energía, predicen con éxito biomarcadores conocidos de enfermedades metabólicas hereditarias y exploran el potencial co-metabolismo del microbioma del huésped.

Modelado de redes metabólicas con organismos modelo

Un modelo de red metabólica a escala genómica (GSMNM) representa todo el metabolismo.

Los GSMNM en organismos modelo ayudan a la comprensión básica y al desarrollo de métodos.

Recientemente, se desarrollaron dos GSMNM para Caenorhabditis elegans.

Los GSMN de modelos animales son útiles para estudiar enfermedades humanas.

Un marco multitejido de Arabidopsis thaliana inspira el modelado de todo el organismo.

El análisis de equilibrio de flujo (FBA) con modelos de redes metabólicas a escala genómica (GSMNM) permite realizar predicciones del metabolismo a nivel de sistemas en una variedad de organismos. Se pueden realizar diferentes tipos de predicciones con diferentes niveles de precisión dependiendo de las restricciones experimentales aplicadas que van desde la medición de los flujos de intercambio hasta la integración de datos de expresión génica. El modelado de redes metabólicas con organismos modelo ha sido pionero en el desarrollo de métodos en este campo. Además, los GSMNM de organismos modelo son útiles para la comprensión básica del metabolismo y, en el caso de modelos animales, para el estudio de enfermedades metabólicas humanas. Aquí, discutimos GSMNM de los organismos modelo más utilizados con énfasis en las reconstrucciones recientes.


Conclusiones

El método propuesto por esta serie de estudios se puede generalizar para identificar todas las proteínas afectadas por la variación en residuos funcionalmente importantes, para determinar la disponibilidad de proteínas de levadura ortólogas para modelar los efectos de dicha variación y, en el futuro, para predecir y cuantificar células y respuestas potencialmente orgánicas a la variación. Los análisis específicos presentados aquí para la demostración del método demuestran además que la variación de un solo nucleótido no sinónimo en el sitio activo debería interrumpir la función enzimática y potencialmente inducir la enfermedad en la levadura. Sin embargo, para extrapolar completa y confiadamente este hallazgo a los seres humanos, la alteración de la función enzimática debe contrastarse con los efectos de la cigosidad. Actualmente, esta es una limitación impuesta por los datos existentes debido a la falta de información de frecuencia relevante para la mayoría de las variaciones estudiadas. Hemos proporcionado 6 conjuntos de pares de ortólogos de enzimas humanas / de levadura para los que se ha demostrado experimentalmente la proteína humana con nsSNV en el sitio activo y se ha verificado que la enzima de levadura comparte importantes propiedades conservadas. Se sabe que cada una de estas enzimas tiene efectos deletéreos sobre la fisiología humana cuando es disfuncional, pero la pérdida de función se ha relacionado directamente en OMIM con solo una de las variantes del sitio activo, la glutatión sintetasa. Por lo tanto, presentamos cinco candidatos viables para el descubrimiento de enfermedades relacionadas con variantes. El modelado preliminar de FBA muestra apoyo predictivo para una de estas enzimas, la ribosa-5-fosfato isomerasa. La validación experimental de estos y otros hallazgos similares continuará aumentando el universo del conocimiento, lo que a su vez facilitará el desarrollo de modelos más potentes y robustos. Los avances en la tecnología empleada por este método pueden permitir la creación a largo plazo de perfiles de metabolitos asociados con la variación del sitio activo para los correspondientes ortólogos humanos y de levadura. Los ensayos bioquímicos simples que comparan las concentraciones de metabolitos humanos y de levadura con los perfiles podrían facilitar la detección de la variación no sinónima del sitio activo. Esto puede sentar aún más las bases para futuros procesos de diagnóstico para predecir resultados desconocidos de nsSNV de sitios activos en estas y otras enzimas.


¿Qué tan útil es el modelo metabólico humano para predecir la biomasa? - biología

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red metabólica humana reconstrucción de la red metabólica dependiente del contexto Modelado basado en restricciones sistemas de simulación biología

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Título: El modelo a escala del genoma revela la base metabólica de la partición de biomasa en una diatomea modelo

Las diatomeas son microalgas eucariotas que contienen genes de diversas fuentes, incluidas las bacterias y el huésped endosimbiótico secundario. Debido a esta combinación única de genes, las diatomeas son taxonómicamente y funcionalmente distintas de otras algas y plantas vasculares y confieren nuevas capacidades metabólicas. Basándonos en la anotación del genoma, realizamos una reconstrucción de la red metabólica a escala del genoma para la diatomea marina. Phaeodactylum tricornutum. Debido a su origen endosimbiótico, las diatomeas poseen una estructura compleja de cloroplasto que complica la predicción de la localización de proteínas subcelulares. Basándonos en trabajos anteriores, implementamos una tubería que explota una serie de herramientas bioinformáticas para predecir la localización de proteínas. La red metabólica reconstruida manualmente iLB1027_lipid representa 1.027 genes asociados con 4.456 reacciones y 2.172 metabolitos distribuidos en seis compartimentos. Para restringir el modelo a escala del genoma, determinamos la composición de la biomasa específica del organismo en términos de lípidos, carbohidratos y proteínas utilizando espectrometría de infrarrojos por transformada de Fourier. Nuestras simulaciones indican la presencia de una derivación glutamina-ornitina aún desconocida que podría usarse para transferir equivalentes reductores generados por la fotosíntesis a las mitocondrias. Además, el modelo refleja la composición bioquímica conocida de P. tricornutum en condiciones de cultivo definidas y permite estrategias de ingeniería metabólica para mejorar el uso de P. tricornutum para aplicaciones biotecnológicas.


Modelado del metabolismo del microbioma intestinal humano

El microbioma intestinal humano es un ecosistema complejo con cientos de especies.

El modelado metabólico puede ayudar a identificar las interferencias metabólicas entre los microbios intestinales.

Se pueden estudiar diversos componentes dietéticos y composiciones de microbiomas.

Se pueden crear modelos personalizados de microbioma intestinal integrando diversos tipos de datos.

El microbioma intestinal humano juega un papel importante en la salud humana. La complejidad del microbioma dificulta la determinación de las funciones metabólicas detalladas y se produce una interrelación entre las especies individuales. En silico Los estudios de biología de sistemas del microbioma pueden ayudar a identificar los intercambios de metabolitos entre los microbios intestinales. Los métodos de reconstrucción y análisis basados ​​en restricciones utilizan redes metabólicas de microorganismos a escala del genoma bioquímicamente precisas para simular el metabolismo entre especies en un microbioma dado y ayudar a generar nuevas hipótesis sobre interacciones microbianas. Aquí, revisamos los estudios de modelado metabólico que han investigado las funciones metabólicas del microbioma intestinal.


Biotecnología energética ● Biotecnología ambiental

Sami Ben Said,. Dani Or, en Current Opinion in Biotechnology, 2020

Modelado matemático para diseñar y ensamblar consorcios microbianos

El modelado matemático de consorcios microbianos que interactúan ofrece un medio para desenredar las interacciones tróficas entre especies y proporciona un marco para el diseño de consorcios sintéticos con funciones metabólicas específicas. Aunque se han utilizado una variedad de técnicas y modelos matemáticos para ese propósito [18, 20-24, 28], la creciente disponibilidad y uso de modelos de redes metabólicas a escala genómica [22, 25, 55] ofrecen un gran avance para representar y detectar interacciones en un paisaje SLMC tan complejo y adaptativo. Sobre la base de secuencias de genoma completo, los modelos a escala de genoma combinan todas las reacciones metabólicas codificadas conocidas en redes susceptibles de análisis matemático. Los modelos a escala del genoma, ya sean completos o reducidos, se han utilizado con éxito para predecir funciones microbianas como el crecimiento en varios sustratos y para estudiar los efectos de la eliminación de genes específicos sobre el metabolismo celular [22, 56, 57]. Además, se utilizan modelos a escala reducida, basados ​​en un subconjunto de las reacciones metabólicas, conservando la predictibilidad de las vías de interés, para aumentar la eficiencia computacional [58, 59]. En el contexto de las especies co-cultivadas, las redes metabólicas permiten la predicción de interacciones metabólicas entre especies basándose únicamente en el metabolismo intracelular de cada miembro del consorcio [60]. Un nuevo estudio histórico investigó estratégicamente más de 2 millones de simulaciones de cocultivo (24 especies en combinaciones por pares bajo diversas condiciones ambientales) para identificar interacciones de alimentación cruzada que brindan oportunidades para el ensamblaje estable de múltiples especies [61 ••]. De manera crítica, el estudio enfatizó el papel determinante del entorno de crecimiento (disponibilidad de sustrato y oxígeno) en el intercambio de metabolitos entre especies [61 ••]. Tal marco computacional de alto rendimiento parece particularmente adecuado como paso inicial para informar el diseño de SLMC, es decir, en la elección de los miembros que interactúan. Sin embargo, es posible que se requieran herramientas computacionales adicionales para investigar y optimizar específicamente la organización espacio-temporal de SLMC. Varios desarrollos de modelos recientes han utilizado redes metabólicas a escala genómica en un contexto espacialmente explícito con el objetivo de describir mecánicamente la competencia entre especies y las interacciones tróficas [62, 63, 64 •]. Uno de estos modelos que simula el crecimiento de colonias bacterianas en agar utilizando enfoques basados ​​en poblaciones combinados con análisis de balance de flujo ha demostrado que ciertos procesos interespecies solo son posibles en el contexto del espacio [62]. Un desarrollo actual e innovador ve la combinación de modelos a escala del genoma con una representación individual de células bacterianas (es decir, modelos basados ​​en agentes) [63, 64 •, 65 •]. Usando tal modelo, las diferencias en las actividades metabólicas podrían predecirse dentro de Escherichia coli colonias dependiendo de la localización de las células individuales en relación con los recursos de carbono y oxígeno [63]. Otras extensiones de modelado han permitido incluir múltiples especies [62, 63] y acomodarlas en ambientes más complejos [65 •].

Las herramientas computacionales y las estrategias de optimización descritas anteriormente ya se aplican al desarrollo biotecnológico: por ejemplo, se utilizó el modelado a escala del genoma de interacciones de múltiples especies para diseñar consorcios bacterianos más eficientes para la degradación de herbicidas en el suelo [66 •], y in-silico Se utilizaron modelos de ingeniería genética y redes metabólicas espacio-temporales para mejorar el rendimiento de la fermentación del gas de síntesis [67]. En ese segundo estudio, una prueba inicial de eliminación de genes beneficiosos resultó en un menor crecimiento de las especies en fermentación. Clostridium ljungdahlii. El uso de un modelo metabólico espacio-temporal del reactor de columna de burbujas proporcionó nuevos objetivos genéticos potenciales para mejorar la síntesis de productos, un descubrimiento que no es posible sin el contexto del espacio. Aunque los obstáculos técnicos y terminológicos todavía impiden la reconstrucción automatizada de redes a escala del genoma [68], se han delineado algunas soluciones metodológicas [69, 70]. Por lo tanto, desde este punto en adelante, esperamos una variedad de procedimientos y herramientas (semi) automatizados para aumentar rápidamente el número de modelos de redes a escala genómica disponibles para la comunidad de investigadores. Finalmente, la estandarización de las redes metabólicas facilitaría la combinación de múltiples modelos de red requeridos para el modelado de consorcios.


Resultados y discusión

Reconstrucción de la red metabólica

Las reconstrucciones de redes a escala del genoma son bases de conocimiento estructuradas bioquímica, genética y genómicamente que proporcionan un marco para analizar y predecir las relaciones genotipo-fenotipo. El proceso de reconstrucción se divide en cuatro pasos principales [14] y se resumen en la figura 1.

En el paso uno obtuvimos un borrador de reconstrucción basado en PAG. tricornutumAnotación del genoma y reconstrucciones de referencia. Este borrador de la reconstrucción se seleccionó manualmente utilizando varios recursos, como una anotación genómica mejorada, predicciones de localización subcelular y bases de datos externas. Todas las reacciones se equilibraron de forma elemental y de carga, se realizó QC / QA y se definió una función objetivo de biomasa antes de transformar la reconstrucción en un modelo computacional. En un proceso iterativo, el en silico las predicciones se comparan con observaciones experimentales para validar y mejorar el modelo metabólico.

Primero, generamos un borrador de reconstrucción basado en el PAG. tricornutum anotación del genoma y homología de proteínas con organismos molde que tienen reconstrucciones [39-41]. Las diatomeas son taxonómica y funcionalmente distintas de otras algas y plantas vasculares; de hecho, muchos contenidos genómicos nucleares están más estrechamente relacionados con los metazoos, lo que demuestra la diversidad del metabolismo de las diatomeas [2]. Aunque la diversidad complicó la generación de un borrador de reconstrucción basado en homología, también hace que las diatomeas, como el organismo modelo PAG. tricornutum, candidatos atractivos para el análisis de procesos celulares a nivel de sistemas, ya que se suman a la diversidad bioquímica de microbios en un entorno biotecnológico, aumentando así los sistemas de producción disponibles. En segundo lugar, el borrador de la reconstrucción se seleccionó y perfeccionó manualmente utilizando recursos adicionales como la anotación del genoma, las predicciones de localización subcelular y las bases de datos externas (consulte Materiales y métodos). Una vez que se completó la curación manual, la reconstrucción se convirtió en un modelo matemático en el tercer paso. Agregamos la función objetivo de la biomasa y definimos los límites del sistema (es decir, la absorción de carbono y nitrógeno) de acuerdo con los resultados experimentales (ver Materiales y métodos). Se realizaron pruebas cualitativas durante la curación manual y el paso final del refinamiento y análisis del modelo. Verificamos que todos los componentes de biomasa y vitaminas para los cuales PAG. tricornutum Este autótrofo podría producirse en condiciones de crecimiento realistas. Las vías bloqueadas podrían resolverse con la adición de una o dos reacciones, en la mayoría de los casos faltaban reacciones de transporte entre compartimentos intracelulares. Además, nos aseguramos de que no se pudiera producir ATP sin insumos. También realizamos varios en silico pruebas para evaluar la consistencia de nuestro modelo y verificar que los comportamientos fisiológicos conocidos se pueden reproducir computacionalmente. Las diatomeas pueden utilizar una variedad de fuentes de nitrógeno, tanto inorgánicas (como nitrato y amonio [54]) como orgánicas (por ejemplo, aminoácidos o urea [55]). Por lo tanto, examinamos la capacidad del modelo para simular la producción de biomasa en diferentes fuentes de nitrógeno. La biomasa no se produjo en presencia de histidina, triptófano, cisteína o metionina como únicas fuentes de nitrógeno en nuestro estudio inicial. en silico modelo, que contradecía los resultados de la literatura [55]. El catabolismo de histidina no se comprende bien en diatomeas o plantas y no se incorporó en el modelo al principio. Dado que no pudimos identificar genes que están involucrados en el catabolismo de histidina en PAG. tricornutum, agregamos el catabolismo de histidina como una reacción agrupada de baja confianza que degrada la histidina y el agua en amonio, formamida y glutamato. La formamida se divide en formiato y amonio y el formiato se acumula durante el catabolismo de histidina. en silico Se añadió una reacción de demanda para permitir que el formiato acumulado abandonara el sistema. La producción de biomasa para el crecimiento en metionina o cisteína como únicas fuentes de nitrógeno se logró mediante la adición de una reacción de demanda de dimetilsulfoniopropionato (DMSP). Se sabe que los niveles de DMSP aumentan con la intensidad de la luz o con la falta de nitrógeno, pero su metabolismo no se comprende bien en las diatomeas y, aunque actualmente se desconoce la vía biosintética [56], un punto de partida sensato sería un aminoácido con un átomo de azufre ya reducido. La acumulación de indol prohibió el crecimiento en triptófano como fuente de nitrógeno. Para tener en cuenta la degradación desconocida del indol, se agregó una reacción de demanda. Con estos cambios, el modelo podría simular la producción de biomasa utilizando las diferentes fuentes de nitrógeno probadas.

Aprovechar un modelo a escala del genoma en la exploración y contextualización del metabolismo de los lípidos requiere una representación precisa de las vías metabólicas y los metabolitos intermedios. Para ello, se desarrolló un módulo lipídico (ILB1027_lipid, ver archivo S3) que abarca la gama completa de metabolitos de lípidos y reacciones metabólicas. Este módulo permite que la incorporación de la caracterización experimental de ácidos grasos y clases de lípidos se refleje en la composición de la biomasa. La incorporación de datos FAME experimentales fue posible a través de un algoritmo de ajuste de datos basado en optimización lineal (ver Materiales y métodos). Después de ajustar el modelo a los datos, la desviación de los valores experimentales al modelo fue 350 veces menor en el módulo de lípidos en comparación con el modelo central. Este resultado demuestra la utilidad del módulo de lípidos cuando se investiga el metabolismo de los ácidos grasos y los lípidos en PAG. tricornutum.

La red metabólica curada a escala del genoma para PAG. tricornutum incluido el módulo de lípidos, ILB1027_lipid, representa 1.027 genes asociados con 4.456 reacciones y 2.172 metabolitos distribuidos en seis compartimentos (Tablas M-O en archivos S2 y S3). En comparación con el borrador de la reconstrucción, el número de genes (446 genes) se duplicó con creces durante la fase de curación manual. Todas las reacciones están asociadas con al menos uno de los 90 subsistemas que se pueden clasificar en diez grupos, por ejemplo, metabolismo de carbono o lípidos (Fig 2). Además, un modelo central con metabolismo de lípidos sustancialmente reducido (ILB1025). El subsistema de metabolismo de lípidos reducido explica 1.029 reacciones en comparación con 3.325 reacciones involucradas en el metabolismo de lípidos en ILB1027_lipid. El modelo central produce distribuciones de flujo comparables y es adecuado, por ejemplo, si faltan datos detallados sobre la composición de lípidos en la condición simulada.

(A) Reacciones por subsistema. La mayoría de las reacciones están involucradas en el metabolismo de los lípidos. Nuestras mediciones de FTIR subrayan el hecho de que los lípidos constituyen la mayor fracción de biomasa. Debido a la presencia de múltiples compartimentos y al hecho de que muchas vías se dividen entre los compartimentos, muchas reacciones se atribuyen al transporte intracelular. El subsistema de modelado contiene reacciones de mantenimiento, biomasa, demanda, sumidero e intercambio de ATP. (B) Porcentaje de reacciones y metabolitos por compartimento. La mayoría de las reacciones y metabolitos están presentes en el citosol, seguidos por el cloroplasto y las mitocondrias en el caso de las reacciones y las mitocondrias y el cloroplasto para los metabolitos. El peroxisoma, el espacio extracelular y el tilacoide contienen menos del 5% y el 8% de todas las reacciones y metabolitos en la reconstrucción, respectivamente.

Predicción de la localización subcelular enzimática

Un aspecto desafiante de las reconstrucciones eucariotas es la predicción de la localización subcelular de proteínas. Debido a su origen endosimbiótico, los heterocontos fotosintéticos, incluidas las diatomeas, poseen cloroplastos que están rodeados por cuatro membranas. Esta compleja estructura coincide con distintas señales de direccionamiento de plastidios en diatomeas que restringen el uso de herramientas de predicción subcelular disponibles para otros eucariotas. Mejoramos una tubería desarrollada previamente que combinaba diferentes programas de bioinformática para predecir la localización subcelular de proteínas en diatomeas [57] (ver Fig. 3, Materiales y métodos, y Sección A en el archivo S1).

Representación esquemática de la canalización de predicción de localización subcelular implementada para Phaeodactylum tricornutum adaptado de trabajos anteriores [57]. Los compartimentos subcelulares se dan en elipses y los programas de bioinformática se muestran en rectángulos. Nuestros pasos agregados están resaltados en gris. La señal de retención de ER es (K / D) - (D / E) -E-L en la región terminal de la proteína C. Una proteína se clasifica como peroxisomal si la señal (S / A / C) - (K / R / H) - (L / M) o S-S-L se encuentra en la región C-terminal.

Para evaluar la precisión de la tubería mejorada, comparamos nuestras predicciones con Sunaga et al.S resultados y localizaciones de proteínas subcelulares validadas experimentalmente tomadas de [5,12,58-64]. Mediante el uso de la tubería refinada, 15 de las 19 predicciones de localización subcelular coincidieron con los datos experimentales que se resumen en la Tabla 1.

La tabla compara las predicciones de las localizaciones de proteínas con los datos experimentales. Para todas las proteínas consideradas, se dan las ID de Phatr2 y Phatr3 y el estado del modelo génico en Phatr3. Si se modificaron los modelos de genes, se dan las predicciones de la tubería para ambos modelos de genes. Distinguimos entre dos versiones del en silico pipeline original se refiere a la versión publicada por Sunaga et al. [57] y la versión mejorada es la que se presenta en este estudio. Las entradas para las que la canalización mejorada o el uso de modelos de genes Phatr3 mejoraron la predicción están formateadas en cursiva. Las discrepancias entre la predicción y la localización experimental se muestran en negrita. ER: Retículo endoplásmico.

Determinación y modelización de la composición de la biomasa.

Para resolver matemáticamente el modelo a escala del genoma utilizando FBA, el fenotipo celular observado se manifiesta como una función objetivo biológica [51]. Esta función objetivo es una reacción metabólica en el modelo que se maximiza o minimiza para lograr un estado fenotípico deseado. Para simular el crecimiento celular, los constituyentes macromoleculares de la célula se definen como la función objetivo (consulte la Tabla L en el Archivo S2). Esta función objetivo de la biomasa representa todos los componentes celulares conocidos y sus contribuciones fraccionales a la biomasa celular general, define los requisitos anabólicos para la división celular y proporciona un balance de masa.

La composición de la biomasa utilizada en los modelos heterotróficos a escala del genoma se fija típicamente en base a valores obtenidos experimentalmente en una condición de cultivo dada [65]. Sin embargo, los organismos fototróficos tienen una composición de biomasa dinámica que cambia no solo a lo largo del ciclo diario, sino también a lo largo de la duración del cultivo. En PAG. tricornutum, los cambios de biomasa en el período de luz están dominados por la generación de compuestos de almacenamiento de carbono, mientras que el período de oscuridad está dominado por los procesos anabólicos necesarios para la división celular [66]. También hay una remodelación espectacular de la composición de la biomasa celular que acompaña a la limitación de nutrientes en las diatomeas [67].

High confidence intracellular flux predictions are dependent on the biomass composition being accurately reflected during the simulation. To this end, we determined PAG. tricornutum’s biomass composition over a growth curve that resulted in nitrogen deprivation after the high accumulation of biomass (Fig 4). Selected samples of this growth curve were examined using time consuming biochemical methods for determining lipid, carbohydrate, and protein content of the cells. Parallel samples were used to develop linear models relating FTIR peaks to biomass composition (Fig A in S1 File). These calibrated models were then used to determine the biomass composition for all time points. The linear models are most robust when a large gradient for biomass composition values (i.e., percent lipid, protein, and carbohydrate) are achieved, thus our experiment was designed to maximize the changes in content. Nitrogen starvation, low CO2, and low light all can contribute to high lipid content and all three scenarios were achieved in our engineered culture experiment, resulting in very high lipid values at the end of the experiment (Fig 4C). The lipid values are elevated relative to previous experiments that examined more realistic bioproduction conditions, but this was planned and resulted in the expected fashion. We were able to achieve large changes in the cellular contents for all of these cellular components in smooth gradients.

A typical FTIR spectrum for Phaeodactylum tricornutum is shown in (A). Peaks corresponding to lipids, proteins and carbohydrates are highlighted (see Table A in S1 File for specific wavelengths). Panel (B) shows the growth curve and photosynthetic efficiency of the culture used for model calibrations and the biomass objective function. The decline in Fv/Fmetro indicates the onset of nitrogen starvation (n = 1). Percent dry weight of the cells in terms of carbohydrates, lipids, and proteins according to FTIR spectra and the calibrated linear model (n = 5, error bars represent five independent FTIR scans) is displayed in (C).

Additionally, FAME data at each sample point was incorporated into the biomass composition via a linear optimization based fitting algorithm to ensure changes in fatty acid biosynthesis were taken into consideration during simulations (see Materials and Methods and Section B in S1 File). Interestingly, diatoms store large amounts of nitrogen in the cell in the form of inorganic compounds [30], probably in the vacuole [68]. A demand reaction for NO3 was added to account for cellular nitrate that has not yet been assimilated into other biomass components such as proteins but is included in the dry weight measurements. By defining the cellular composition at each sampling point, differences in the metabolic network usage could be analyzed along the duration of the culture.

Commonly, maximizing the biomass equation is selected as an appropriate objective function for the growth phenotype. Since cell division in PAG. tricornutum is relegated to the dark period when cells are grown in a light-dark regimen, the common biological objective function of maximizing growth is not applicable to simulations during the light period. Thus, maximizing carbon uptake was selected as the biological objective function that best represents the cellular phenotype during the light period. Mass balance was achieved by allowing fixed carbon to accumulate as either carbohydrates or neutral lipids in accordance with previous observations of PAG. tricornutum [66].


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Comentarios:

  1. Parsa

    Me gustaría hablar contigo sobre esta pregunta.

  2. Iseabail

    ¿Y hay otra salida?

  3. Chann

    Quiero decir, permites el error. Ingrese lo discutiremos. Escríbeme en PM, hablaremos.

  4. Zulkinos

    solo en el tema !!!!))))))))))))))))))))))))))))))))))

  5. Arpad

    Este no es el caso))))



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