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14: SDS-PAGE - Biología

14: SDS-PAGE - Biología


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Este laboratorio le presentará SDS-PAGE, un método simple y económico para resolver proteínas en mezclas complejas.
Los geles SDS-PAGE proporcionan los materiales de partida para las transferencias Western y para algunas técnicas proteómicas. En este laboratorio,
utilice SDS-PAGE para analizar los extractos de proteínas que preparó a partir de cepas de levadura que sobreexpresan la fusión de Met y LacZ
proteínas.


Objetivos

Al final de esta práctica de laboratorio, los estudiantes podrán:

  • discutir los principios que gobiernan la separación de proteínas en geles SDS-PAGE discontinuos.
  • moldear y ejecutar geles SDS-PAGE.
  • analizar el patrón de bandas en un gel SDS-PAGE teñido
  • estimar el peso molecular de una proteína a partir de su migración en geles SDS-PAGE

Este laboratorio le presentará SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida y dodecilsulfato de sodio), un método simple y económico para resolver proteínas en mezclas complejas. Utilizará geles SDS-PAGE para analizar los extractos de proteína de levadura que preparó en el último laboratorio. Cada equipo elaborará dos geles. Se teñirá un gel con Simply Blue para visualizar todas las proteínas de los extractos. El segundo gel se utilizará para transferencias Western (Capítulo 15) que detectarán específicamente las proteínas de fusión Met y LacZ en los extractos.


Tamaño de proteína y porcentaje de gel - (26 / Nov / 2009)

Hola a todos & # 33
¿Alguien podría ayudarme amablemente a encontrar una referencia para obtener orientación sobre qué porcentaje de gel usar en relación con los tamaños de proteínas que se resolverán en SDS-PAGE y por qué? En otras palabras, tengo que demostrarle a mi jefe por la referencia respetada que no está bien usar SDS-PAGE en 4-12% para ver una proteína (después de la tinción de anticuerpos y western) con una masa molecular calculada de 14 kDa (aunque generalmente se ejecuta cerca de 16 kDa). Intento persuadirla de que el 15% es mejor y la proteína debe estar en el medio del gel y no al final, mientras ella dice que si dejo de PAGE en un buen momento (antes de que el tinte se agote), entonces es aceptable. . El problema básico es que por algunas razones no conozco, los westerns del 4-12% y el 15% se ven diferentes, mientras que a ella le gusta más el 4-12% ya que encaja con su teoría mientras que el 15% no lo hace.
Muchas gracias por la ayuda & # 33
PD No crea que no intenté encontrarlo yo mismo. Gracias de nuevo & # 33

los westerns se verán diferentes ya que hay un gradiente de tamaño de poro. la molécula viajará más en el 4-12% que en el 15% ya que el tamaño de los poros es mayor al comienzo del gel de resolución & # 33 & # 33 & # 33
pero ya para una proteína de 14 kDa 4-12 no es una buena opción ... de hecho, puedes probar un gradiente de 8-20 o elegir si 15% es mejor ... el punto básico es poder ver las impurezas de HMwt y LMwt Impuriteis con buena resolución & # 33 & # 33 & # 33
Me pregunto por qué su investigador privado es tan terco con este simple hecho científico & # 33 & # 33 & # 33
Buena suerte para ti aunque & # 33 & # 33 & # 33

Hola & # 33
¿Tienes alguna referencia? Ella es inmunóloga (no tiene idea de bioquímica) y del tipo que confía solo en algunas referencias y no solo en mis palabras. Gracias & # 33
No es solo que los westerns se ven diferentes: la banda de interés, que no ve en el 4-12%, aparece en el 15% (se trata de muestras tratadas y no tratadas). Esto último es lo que no le gusta, ya que va en contra de su teoría.

Pradeep Iyer el 26 de noviembre de 2009, 12 & # 5800 PM dijo:

Entiendo ... puedes mostrarle el volumen 3 de clonación molecular de Sambrook ... da los tamaños y porcentajes de geles que se utilizarán. pero me temo que el porcentaje ideal de gradiente no se dará allí y es un hallazgo raro ... aún así, si voy acroos, uno lo publicará. pero el porcentaje homogéneo se puede encontrar en Sambrook y en muchos sitios en línea también & # 33 & # 33 & # 33

Aquí se indica claramente que no se puede utilizar un 4-12 para una molécula de 14 kDa. Supongo que esto será suficiente para cerrar tu IP. Está en el sitio web de fermentas & # 33 & # 33
Protocolos de aplicación - electroforesis y análisis de proteínas - SDS-PAGE

Rango de PM de proteína, kDa Gel recomendado,%

100-400 4 %
Rango de PM de proteína, kDa Gel de gradiente recomendado,%

Muchas gracias por esa información & # 33 & # 39he estado tratando de encontrarla & # 33 & # 33 & # 33
Entonces, he estado haciendo western blot para una proteína de 8.7KDa en un gel Bis-Tris al 4-12% y pude detectarlo.

Pradeep Iyer el 26 de noviembre de 2009, 05 & # 5850 AM dijo:

Aquí se indica claramente que no se puede utilizar un 4-12 para una molécula de 14 kDa. Supongo que esto será suficiente para cerrar tu IP. Está en el sitio web de fermentas & # 33 & # 33
Protocolos de aplicación - electroforesis y análisis de proteínas - SDS-PAGE

Rango de PM de proteína, kDa Gel recomendado,%

100-400 4 %
Rango de PM de proteína, kDa Gel de gradiente recomendado,%


Espectrometría de masas para el control de calidad de anticuerpos biespecíficos después de la digestión en gel con SDS-PAGE

Los anticuerpos biespecíficos recombinantes (bsAbs) se incluyen cada vez más en los regímenes para la terapia del cáncer. Se requieren estrictas medidas de control de calidad que cumplan con las buenas prácticas de fabricación (GMP) para garantizar la calidad y la seguridad de estos productos biológicos innovadores. La electroforesis en gel (electroforesis en gel de poliacrilamida y dodecilsulfato de sodio [SDS-PAGE]) y la cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) son las piedras angulares de los métodos de control de calidad. Los BsAbs suelen ser propensos a la agregación o síntesis incompleta debido a su naturaleza artificial. Además, las proteínas de la célula huésped y el ADN de la célula huésped, así como las impurezas del propio proceso de purificación, constituyen contaminantes potenciales. A continuación, dichas impurezas pueden aparecer como bandas o picos adicionales inesperados en los geles SDS-PAGE y SEC, respectivamente. Aquí describimos un protocolo estandarizado para el análisis rápido de anticuerpos recombinantes por espectrometría de masas (MS) después de la digestión tríptica de bandas escindidas de geles SDS-PAGE. Hemos utilizado este protocolo para caracterizar "bandas contaminantes" inesperadas que se observaron durante el desarrollo clínico de un nuevo bsAb con especificidad de PSMAxCD3, ya sea durante la producción de la proteína en sí o durante el desarrollo de una molécula sustituta para la evaluación en modelos de ratón singénicos. El análisis de MS nos permitió determinar con precisión el origen de estas bandas, que resultaron de artefactos o de una síntesis de proteínas incompleta. Por lo tanto, la utilización combinada de SDS-PAGE y MS puede respaldar sustancialmente la producción de proteínas recombinantes que cumple con las GMP.

Palabras clave: Control de calidad por espectrometría de masas de anticuerpos biespecíficos SDS PAGE.

© 2021 Los Autores. Biotecnología y bioingeniería publicado por Wiley Periodicals LLC.


Geles de poliacrilamida para SDS-PAGE

Se han desarrollado muchos sistemas para la electroforesis de proteínas y los aparatos utilizados para SDS-PAGE varían ampliamente. La metodología utilizada en estas páginas emplea el método Laemmli. La referencia al método Laemmli en una sección de materiales y métodos elimina la necesidad de describir los tampones, la fundición de geles, el aparato, etc. La sección de métodos son el porcentaje de acrilamida total (% T) en un gel, el porcentaje relativo y el tipo de reticulante (% C), y quizás una referencia a las dimensiones del gel. Usamos un sistema de "mini-gel", con casetes de gel de 3 1/4 "x 4".

SDS-PAGE se puede realizar en geles prefabricados, lo que evita el problema y el peligro de trabajar con acrilamida. La siguiente descripción se aplica a los aparatos de fundición y funcionamiento fabricados en taller que son mucho más baratos que los equipos disponibles comercialmente. Además de la rentabilidad, una ventaja de fabricar los propios geles por primera vez es una comprensión más profunda del proceso.

Independientemente del sistema, la preparación requiere la colada de dos capas diferentes de acrilamida entre placas de vidrio. La capa inferior (gel de separación o resolución) es responsable de separar los polipéptidos por tamaño. La capa superior (gel de apilamiento) incluye los pocillos de muestra. Está diseñado para barrer las proteínas en una muestra entre dos límites móviles para que se compriman (apilen) en capas delgadas de un micrómetro cuando llegan al gel de separación.


Transferencia mediante el módulo de transferencia XCell II

El módulo de transferencia XCell II le permite transferir fácilmente proteínas o ácidos nucleicos de mini-geles a membranas. Encaja perfectamente en las mini celdas XCell SureLock y XCell II en lugar del conjunto de núcleo de gel / tampón. Requiere menos de 200 ml de tampón de transferencia para transferencias del oeste, sur y norte. Los resistentes electrodos de titanio platinizado y acero inoxidable crean un campo eléctrico uniforme sin abrazaderas ni soportes de gel con bisagras. El tamaño máximo de la mancha es de 9 cm x 9 cm. Aprende más aquí.


Electroforesis (con diagrama)

El término electroforesis describe la migración de una partícula cargada bajo la influencia de un campo eléctrico. Muchas biomoléculas importantes, como péptidos, proteínas, nucleótidos y ácidos nucleicos, poseen grupos ionizables y, por lo tanto, a cualquier pH dado, existen en solución como especies cargadas eléctricamente como cationes (+) o aniones (-).

Bajo la influencia de un campo eléctrico, estas partículas cargadas migrarán al cátodo o al ánodo, dependiendo de la naturaleza de su carga neta.

El equipo necesario para la electroforesis consta básicamente de dos elementos: una fuente de alimentación y una unidad de electroforesis. Las unidades de electroforesis están disponibles para ejecutar un sistema de gel vertical u horizontal. Un aparato electroforético en gel vertical y horizontal típico se muestra por separado en las Figs. 2.1 y 2.2.

El paquete de energía suministra una corriente continua entre los electrodos en la unidad de elec y timoforesis. Toda la electroforesis se lleva a cabo en un tampón apropiado, que es fundamental para mantener un estado constante de ionización de las moléculas que se separan. Cualquier variación en el pH alteraría la carga global y, por tanto, la movilidad de las moléculas que se separan.

La introducción del uso de geles como medio de soporte condujo a una rápida mejora y desplazamiento de los métodos de análisis de macromoléculas. El primer sistema de gel que se utilizó fue el gel de almidón y, aunque todavía tiene algún uso, la gran mayoría de las técnicas electro y shiforéticas utilizadas hoy en día involucran geles de agarosa o geles de poliacrilamida.

Nuevamente, existen diferentes tipos de electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) que se aplican en la separación de proteínas y ácidos nucleicos. Entre estas técnicas, se utilizó ampliamente la electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE). En la figura 2.3 se muestra una separación típica de proteínas en gel de poliacrilamida SDS. Esta técnica se utiliza a menudo para la purificación de moléculas de proteínas.


Ver el vídeo: SDS-PAGE, Sodium Dodecyl SulfatePolyAcrylamide Gel ElectrophoresisAnimation (Mayo 2022).