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ADN polimerasa eucariota en hebra principal y rezagada

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Diferentes libros dicen especificaciones diferentes sobre qué ADN polimerasa eucariota funciona en la hebra principal y qué ADN polimerasa funciona en la hebra retrasada.

TL, DR: ¿Cuál es la realidad? y si hay múltiples posibilidades, entonces cuál es aplicable para qué organismo (como mamíferos humanos, hongos de levadura, Arabidopsis planta, etc.)?

Información muy variable como,

Según el libro The Cell de G.M. Cooper (NCBI), en el sistema eucariota de mamíferos, La ADN polimerasa δ funciona tanto en la hebra principal como en la hebra retrasada.

Según el libro Molecular biology de R. F. Weaver, ed-5; El ADN pol- δ funciona en la hebra rezagada y pol ε funciona en la hebra rezagada y el ADN pol ε funcionan en la cadena principal.

Fundamentos de la biología molecular, Lizabeth Allison (Semantic Scholar) dice otra cosa, dice que pol ε funciona en la hebra rezagada.

El artículo de Stillman B., ADN polimerasas en la bifurcación de replicación en eucariotas. (NCBI) (NCBI-PMC) (FIGURA) dice que en el modelo viral SV40 la δ polimerasa funciona en ambas hebras pero en el cromosoma celular, δ funciona en el retraso y & epsilon funciona en la hebra principal.

Ahora bien, ¿cuál es la verdad? si todos son verdaderos, ¿son aplicables a diferentes organismos?


  • Durante la iniciación, las proteínas se unen al origen de la replicación, mientras que la helicasa desenrolla la hélice del ADN y se forman dos horquillas de replicación en el origen de la replicación.
  • Durante el alargamiento, se agrega una secuencia de cebador con nucleótidos de ARN complementarios, que luego se reemplazan por nucleótidos de ADN.
  • Durante el alargamiento, la hebra delantera se fabrica de forma continua, mientras que la hebra retrasada se fabrica en piezas llamadas fragmentos de Okazaki.
  • Durante la terminación, los cebadores se eliminan y reemplazan con nuevos nucleótidos de ADN y la cadena principal se sella con ADN ligasa.
  • origen de replicación: una secuencia particular en un genoma en la que se inicia la replicación
  • filamento principal: la hebra plantilla de la doble hélice de ADN que está orientada de modo que la horquilla de replicación se mueva a lo largo de ella en la dirección 3 & prime a 5 & prime
  • hebra rezagada: la hebra de la doble hélice de ADN de la plantilla que está orientada de modo que la horquilla de replicación se mueva a lo largo de ella de una manera 5 & prime a 3 & prime

Debido a que los genomas eucariotas son bastante complejos, la replicación del ADN es un proceso muy complicado que involucra varias enzimas y otras proteínas. Ocurre en tres etapas principales: inicio, alargamiento y terminación.


Disposición de las polimerasas de ADN nucleares eucariotas para la replicación: interacciones específicas con proteínas accesorias organizan Pols α, δ y ϵ en el replisoma para la replicación del ADN de la cadena principal y la hebra retrasada

Se acaban de publicar estudios bioquímicos y de microscopía crioelectrónica que revelan interacciones entre proteínas del replisoma de levadura que son importantes para la síntesis altamente coordinada de las dos cadenas de ADN del genoma nuclear. Estos estudios revelan interacciones clave importantes para organizar las ADN polimerasas α, δ y ϵ para la replicación de la cadena principal y retrasada. La helicasa CMG (Mcm2-7, Cdc45, GINS) es fundamental para esta red de interacción. Estos son solo los últimos ejemplos de estudios elegantes realizados en el pasado reciente que conducen a una mejor comprensión de cómo la horquilla de replicación eucariota logra una replicación eficiente del ADN que es lo suficientemente precisa como para prevenir enfermedades pero que permite la evolución.

Palabras clave: ADN polimerasas Replicación de ADN microscopía crioelectrónica inicio del replisoma de replicación.

Empleados del gobierno de EE. UU. Han contribuido a este artículo y su trabajo es de dominio público en EE. UU.


Biología 171

Al final de esta sección, podrá hacer lo siguiente:

  • Discutir las similitudes y diferencias entre la replicación del ADN en eucariotas y procariotas.
  • Indique el papel de la telomerasa en la replicación del ADN.

Los genomas eucariotas son mucho más complejos y de mayor tamaño que los genomas procariotas. Los eucariotas también tienen varios cromosomas lineales diferentes. El genoma humano tiene 3 mil millones de pares de bases por conjunto haploide de cromosomas, y 6 mil millones de pares de bases se replican durante la fase S del ciclo celular. Existen múltiples orígenes de replicación en cada cromosoma eucariota, los humanos pueden tener hasta 100,000 orígenes de replicación en todo el genoma. La tasa de replicación es de aproximadamente 100 nucleótidos por segundo, mucho más lenta que la replicación procariota. En la levadura, que es un eucariota, se encuentran secuencias especiales conocidas como secuencias de replicación autónoma (ARS) en los cromosomas. Estos son equivalentes al origen de la replicación en E. coli.

El número de ADN polimerasas en eucariotas es mucho mayor que en procariotas: se conocen 14, de las cuales se sabe que cinco tienen funciones importantes durante la replicación y han sido bien estudiadas. Se les conoce como pol α, pol β, pol γ, pol δy pol ε.

Los pasos esenciales de la replicación son los mismos que en los procariotas. Antes de que pueda comenzar la replicación, el ADN debe estar disponible como plantilla. El ADN eucariota se une a proteínas básicas conocidas como histonas para formar estructuras llamadas nucleosomas. Las histonas deben eliminarse y luego reemplazarse durante el proceso de replicación, lo que ayuda a explicar la menor tasa de replicación en eucariotas. La cromatina (el complejo entre el ADN y las proteínas) puede sufrir algunas modificaciones químicas, de modo que el ADN puede deslizarse fuera de las proteínas o ser accesible a las enzimas de la maquinaria de replicación del ADN. En el origen de la replicación, se elabora un complejo de prerreplicación con otras proteínas iniciadoras. Luego, se reclutan la helicasa y otras proteínas para iniciar el proceso de replicación ((Figura)).

Diferencia entre replicación procariota y eucariota
Propiedad Procariotas Eucariotas
Origen de la replicación Soltero Múltiple
Tasa de replicación 1000 nucleótidos / s 50 a 100 nucleótidos / s
Tipos de ADN polimerasa 5 14
Telomerasa No presente Regalo
Eliminación de cebadores de ARN ADN pol I ARNasa H
Elongación de la hebra ADN pol III Pol α, pol δ, pol ε
Pinza deslizante Pinza deslizante PCNA

Una helicasa que utiliza la energía de la hidrólisis de ATP abre la hélice de ADN. Las horquillas de replicación se forman en cada origen de replicación a medida que el ADN se desenrolla. La apertura de la doble hélice provoca un enrollamiento excesivo, o superenrollamiento, en el ADN antes de la horquilla de replicación. Estos se resuelven con la acción de las topoisomerasas. Los cebadores están formados por la enzima primasa y, utilizando el cebador, el ADN pol puede iniciar la síntesis. Entonces están implicadas tres ADN polimerasas principales: α, δ y ε. El ADN pol α agrega un fragmento de ADN corto (de 20 a 30 nucleótidos) al cebador de ARN en ambas hebras y luego pasa a una segunda polimerasa. Mientras que la cadena principal es sintetizada continuamente por la enzima pol δ, la hebra rezagada es sintetizada por pol ε. Una proteína de abrazadera deslizante conocida como PCNA (antígeno nuclear de células en proliferación) mantiene el ADN pol en su lugar para que no se deslice del ADN. A medida que pol δ se encuentra con el ARN del cebador en la hebra rezagada, lo desplaza de la plantilla de ADN. El ARN del cebador desplazado se elimina luego por la ARNasa H (endonucleasa de colgajo AKA) y se reemplaza con nucleótidos de ADN. Los fragmentos de Okazaki en la hebra rezagada se unen después de la sustitución de los cebadores de ARN por ADN. Los espacios que quedan están sellados por ADN ligasa, que forma el enlace fosfodiéster.

Replicación de telómeros

A diferencia de los cromosomas procariotas, los cromosomas eucariotas son lineales. Como ha aprendido, la enzima ADN pol puede agregar nucleótidos solo en la dirección 5 & # 8242 a 3 & # 8242. En la cadena principal, la síntesis continúa hasta que se alcanza el final del cromosoma. En la hebra rezagada, el ADN se sintetiza en tramos cortos, cada uno de los cuales es iniciado por un cebador separado. Cuando la horquilla de replicación llega al final del cromosoma lineal, no hay forma de reemplazar el cebador en el extremo 5 'de la hebra rezagada. El ADN en los extremos del cromosoma, por lo tanto, permanece sin aparear y, con el tiempo, estos extremos, llamados telómeros, puede acortarse progresivamente a medida que las células continúan dividiéndose.

Los telómeros comprenden secuencias repetitivas que no codifican ningún gen en particular. En los seres humanos, una secuencia de seis pares de bases, TTAGGG, se repite de 100 a 1000 veces en las regiones de los telómeros. En cierto modo, estos telómeros protegen a los genes para que no se eliminen a medida que las células continúan dividiéndose. Los telómeros se agregan a los extremos de los cromosomas mediante una enzima separada, la telomerasa ((Figura)), cuyo descubrimiento ayudó a comprender cómo se mantienen estos extremos cromosómicos repetitivos. La enzima telomerasa contiene una parte catalítica y una plantilla de ARN incorporada. Se adhiere al final del cromosoma y se agregan nucleótidos de ADN complementarios a la plantilla de ARN en el extremo 3 & # 8242 de la hebra de ADN. Una vez que el extremo 3 & # 8242 de la plantilla de la hebra rezagada está lo suficientemente alargado, la ADN polimerasa puede agregar los nucleótidos complementarios a los extremos de los cromosomas. Por tanto, se replican los extremos de los cromosomas.


La telomerasa suele estar activa en células germinales y células madre adultas. No es activo en células somáticas adultas. Por su descubrimiento de la telomerasa y su acción, Elizabeth Blackburn, Carol W. Greider y Jack W. Szostak ((Figura)) recibieron el Premio Nobel de Medicina y Fisiología en 2009.


Telomerasa y envejecimiento

Las células que se someten a división celular continúan teniendo sus telómeros acortados porque la mayoría de las células somáticas no producen telomerasa. Esto esencialmente significa que el acortamiento de los telómeros está asociado con el envejecimiento. Con el advenimiento de la medicina moderna, la atención médica preventiva y estilos de vida más saludables, la esperanza de vida humana ha aumentado y existe una demanda creciente de que las personas se vean más jóvenes y tengan una mejor calidad de vida a medida que envejecen.

En 2010, los científicos encontraron que la telomerasa puede revertir algunas condiciones relacionadas con la edad en ratones. Esto puede tener potencial en la medicina regenerativa. 1 En estos estudios se utilizaron ratones con deficiencia de telomerasa, estos ratones tienen atrofia tisular, agotamiento de células madre, falla del sistema de órganos y respuestas dañadas de daño tisular. La reactivación de la telomerasa en estos ratones provocó la extensión de los telómeros, redujo el daño del ADN, invirtió la neurodegeneración y mejoró la función de los testículos, el bazo y los intestinos. Por tanto, la reactivación de los telómeros puede tener potencial para tratar enfermedades relacionadas con la edad en humanos.

El cáncer se caracteriza por la división celular descontrolada de células anormales. Las células acumulan mutaciones, proliferan sin control y pueden migrar a diferentes partes del cuerpo a través de un proceso llamado metástasis. Los científicos han observado que las células cancerosas tienen telómeros considerablemente más cortos y que la telomerasa está activa en estas células. Curiosamente, solo después de que los telómeros se acortaron en las células cancerosas, la telomerasa se activó. Si la acción de la telomerasa en estas células puede ser inhibida por fármacos durante la terapia contra el cáncer, entonces las células cancerosas podrían detenerse potencialmente para que no se dividan más.

Resumen de la sección

La replicación en eucariotas comienza en múltiples orígenes de replicación. El mecanismo es bastante similar al de los procariotas. Se requiere un cebador para iniciar la síntesis, que luego se extiende por la ADN polimerasa a medida que agrega nucleótidos uno por uno a la cadena en crecimiento. La cadena principal se sintetiza continuamente, mientras que la cadena rezagada se sintetiza en tramos cortos llamados fragmentos de Okazaki. Los cebadores de ARN se reemplazan con nucleótidos de ADN y los fragmentos de ADN Okazaki se unen en una hebra continua mediante ADN ligasa. Los extremos de los cromosomas plantean un problema, ya que el ARN cebador en los extremos 5 'del ADN no se puede reemplazar con ADN y el cromosoma se acorta progresivamente. La telomerasa, una enzima con una plantilla de ARN incorporada, extiende los extremos copiando la plantilla de ARN y extendiendo una hebra del cromosoma. Luego, la ADN polimerasa puede completar la hebra de ADN complementaria utilizando las enzimas de replicación regulares. De esta forma se protegen los extremos de los cromosomas.

Respuesta libre

¿Cómo se aseguran los cromosomas lineales en eucariotas de que sus extremos se repliquen por completo?

La telomerasa tiene una plantilla de ARN incorporada que extiende el extremo 3 & # 8242, por lo que el cebador se sintetiza y extiende. Por lo tanto, los extremos están protegidos.

Notas al pie

    Jaskelioff et al., "La reactivación de la telomerasa revierte la degeneración del tejido en ratones envejecidos con deficiencia de telomerasa", Naturaleza 469 (2011): 102-7.

Glosario


Diferencias entre la hebra principal y la rezagada

¿Cuál es la diferencia entre la hebra principal y la hebra retrasada? La enzima ADN polimerasa sintetiza una nueva hebra en pieza continua en la dirección 5 & # 8242-3 & # 8242 y se llama hebra principal, solo requiere un cebador para iniciar el crecimiento y no se requiere la enzima ADN ligasa y se formó continuamente como un solo fragmento. Sin embargo, la enzima ADN polimerasa sintetiza una nueva hebra en una pieza discontinua en la dirección 5 & # 8242-3 & # 8242 y se llama hebra rezagada, al principio se forma en forma de un pequeño fragmento llamado fragmentos de okazaki, cada fragmento requiere un cebador de ARN separado para iniciar y requerir la enzima ADN ligasa para unir todos los fragmentos.

Diferencias entre la hebra principal y la rezagada

Ahora explicamos brevemente la diferencia entre la hebra principal y la rezagada de la siguiente manera: -

Filamento principal:-
1) se forma continuamente en la dirección 5 & # 8242-3 & # 8242 en un solo fragmento

2) solo requiere una imprimación para iniciar el crecimiento

3) La enzima ADN ligasa no es necesaria para esta hebra.

4) la dirección de crecimiento de la hebra principal es 5 & # 8242-3 & # 8242.

Hebra rezagada: -
1) al principio se forma en forma de un pequeño fragmento llamado fragmentos de okazaki

2) cada fragmento requiere un cebador de ARN separado para iniciar

3) se requiere la enzima ADN ligasa para unir los fragmentos de ADN

4) de la hebra completa es 3 & # 8242-5 & # 8242 en la dirección, sin embargo, para el fragmento de okazaki está en la dirección 5 & # 8242-3 & # 8242.


4. REPLICACIÓN DE LA LÍNEA PRINCIPAL

4.1. La ADN helicasa de CMG

En los últimos años, los estudios bioquímicos de la replicación del ADN han mostrado un gran progreso. De hecho, en 2015, se informó la reconstitución completa del inicio y elongación de la replicación del ADN con proteínas purificadas de levadura (5). En esta sección, nos centramos en la función de la replicasa de la cadena principal que consiste en la helicasa CMG y Pol & # x003b5. El inicio de la replicación del ADN se asocia con el reordenamiento de la helicasa del núcleo de Mcm2-7 de una forma inactiva que rodea al ADN bicatenario a la de una helicasa activa, que rodea al ADNss y desenrolla el ADN bicatenario parental utilizando la energía de la hidrólisis de trifosfato de adenosina (ATP) (Figura 1) . Varias líneas de evidencia apoyan la localización del núcleo MCM alrededor de la cadena principal. El complejo CMG está asociado con la cadena principal Pol & # x003b5, haciendo plausible su asociación con la hebra principal (13, 14). CMG es una helicasa 3 & # x02032-5 & # x02032 en sustratos de ADN modelo (20), al igual que la helicasa MCM de arqueas homóloga (68, 69). Esta direccionalidad colocaría el complejo en la hebra principal al moverse en la dirección de la bifurcación. Además, la helicasa CMG pasa por alto los obstáculos de la hebra rezagada, pero no los de la hebra principal, lo que sugiere una estrecha asociación con la hebra principal (70).

Aunque las estructuras de rayos X y microscopía electrónica criogénica (crio EM) han estado disponibles para cada uno de los tres subconjuntos del CMG durante algún tiempo (véanse las referencias en 71, 72), dos estudios nuevos e interesantes han arrojado resultados criogénicos de alta resolución. Estructuras EM del complejo CMG. Ambos estudios revelan una disposición general similar de los tres subconjuntos & # x02014Mcm2-7, Cdc45 y GINS & # x02014, lo que proporciona nueva información sobre la organización de la réplica de la cadena principal. La estructura de la levadura CMG se obtuvo sin ADN a una resolución de 3,7 & # x020134,8 & # x000c5 (73). Estos datos crio-EM son consistentes con la presencia de dos conformadores diferentes, una forma compacta y una forma extendida. Se propone que la conversión de la forma extendida a la compacta tras la unión de ATP esté asociada con el movimiento de los seis dominios AAA + del núcleo de Mcm2-7, aunque la hidrólisis de ATP invierte este movimiento, lo que permite que la helicasa de CMG se mueva a lo largo de ssDNA en un gusano de pulgada movimiento. Una segunda estructura crio-EM, de la Drosophila El complejo CMG, se obtuvo en presencia de una molécula de dsDNA parcialmente que imita una horquilla de replicación estable (74). De nuevo, se obtuvieron dos conformadores principales, una forma compacta a una resolución de 7,4 & # x000c5 y una forma relajada a una resolución de 9,8 & # x000c5. En la forma compacta, la porción de ssDNA del ADN se puede visualizar para pasar a través del anillo Mcm2-7, apoyando las conclusiones de estudios previos de que CMG rodea la cadena principal. La segunda estructura relajada carece de densidad de ADN en el núcleo y muestra un espacio entre las subunidades Mcm2 y Mcm5. Curiosamente, se propone que tanto la carga inicial del complejo MCM alrededor del dsDNA como la posterior conversión a la de una helicasa activa que rodea el ssDNA estén mediadas a través de una abertura entre las subunidades Mcm2 y Mcm5 (75, 76). La forma compacta de CMG predomina en presencia de adenosina no hidrolizable 5 & # x02032-& # x003b3-tio-trifosfato (ATP& # x003b3S), mientras que la forma relajada predomina en presencia de ATP. La última forma probablemente representa una estructura en la que se ha hidrolizado el ATP, lo que respalda un modelo en el que la hidrólisis del ATP convertiría la forma compacta en una forma relajada. Curiosamente, este cambio conformacional está asociado con un movimiento de estiramiento mínimo de CMG, que se observó con CMG de levadura y formó la base para un modelo de gusano de pulgada para la acción de la helicasa (73). Estas nuevas estructuras del complejo CMG son solo el comienzo de una nueva dirección para la biofísica de los estudios de replicación del ADN con la ayuda de estudios crio-EM.

4.2. ADN polimerasa & # x003b5 y replicación de ADN de cadena principal

Las tres ADN polimerasas replicativas, & # x003b1, & # x003b4, y & # x003b5, son miembros de la familia B de ADN polimerasas. Una revisión exhaustiva de estas enzimas queda fuera del alcance de esta revisión, y se remite al lector a revisiones completas recientes que discuten tanto la estructura como la función de Pol & # x003b1, Pol & # x003b4 y Pol & # x003b5 y sus relaciones evolutivas (77, 78). Otra revisión reciente describe la consecuencia de las mutaciones replicativas de la polimerasa sobre la disposición del cáncer en humanos (79). En esta sección, consideramos brevemente las propiedades que predisponen a estas polimerasas a replicar las dos hebras del genoma nuclear (Figura 3).

Replicas de ADN eucariotas. ADN polimerasa & # x003b1 (Pol & # x003b1, rojo ) y Pol & # x003b5 ( verde) contienen cuatro subunidades, y Saccharomyces cerevisiae Pol & # x003b4 (azul) contiene tres subunidades, mientras que Pol & # x003b4and humano Schizosaccharomyces pombe Pol & # x003b4 tienen una cuarta subunidad pequeña adicional (no mostrada). Los racimos de hierro [4Fe & # x020134S] demostrados y azufre se indican con grandes bolas naranjas y los átomos de zinc ligados con pequeñas bolas grises. Se enumeran las propiedades catalíticas y las interacciones entre proteínas y proteínas. Tenga en cuenta que Pol & # x003b4 tiene una alta fidelidad para los desajustes de base & # x02013base, pero menor fidelidad para las deleciones de un solo nucleótido en secuencias repetitivas. Abreviaturas: GINS, Sld5, Psf1, Psf2 y complejo Psf3 n.d., PCNA no determinado, antígeno nuclear de células proliferantes.

Las propiedades de Pol & # x003b5 se distinguen de los de Pol & # x003b1 y Pol & # x003b4 de varias formas. Pol & # x003b5 tiene una subunidad de alto peso molecular cuyo dominio N-terminal codifica la polimerización del ADN y la actividad exonucleolítica 3 & # x02032 y un dominio C-terminal (CTD) homólogo pero catalíticamente inactivo que se requiere para el ensamblaje del replisoma y la activación del punto de control (55 & # x0201359, 80, 81). La forma holoenzimática de Pol & # x003b5 también contiene una subunidad Dpb2 no catalítica que es esencial y subunidades Dpb3 y Dpb4 que no son esenciales (82). La presencia de un pequeño dominio en la subunidad catalítica permite Pol & # x003b5 para rodear el dsDNA naciente (83), que probablemente sea responsable de la alta procesividad intrínseca de esta enzima. Esta alta procesividad aumenta aún más por las subunidades no esenciales Dpb3 y Dpb4 y por interacciones con la pinza de replicación PCNA. Por el contrario, la procesividad intrínseca muy baja de la síntesis de ADN por Pol & # x003b4 se ve enormemente mejorada por PCNA, de modo que en presencia de PCNA tanto Pol & # x003b5 y Pol & # x003b4 tienen procesividades comparables (84).

La capacidad de síntesis de desplazamiento de la hebra por parte de la ADN polimerasa de hebra rezagada es esencial para la maduración eficiente de los fragmentos de Okazaki en la hebra rezagada. Comparado con Pol & # x003b4, Pol & # x003b5 no realiza una síntesis de desplazamiento de cadena eficiente (85). En gran medida, esto es una consecuencia de su actividad 3 & # x02032-exonucleasa muy activa, ya que la síntesis de desplazamiento de cadena es observable en la enzima deficiente en exonucleasa (86). La actividad intrínseca 3 & # x02032-exonucleasa de Pol & # x003b5 corrige sus propios errores de replicación (87), y lo hace de manera tan eficiente que Pol & # x003b5 sintetiza el ADN con más precisión que Pol & # x003b4, que es competente en la corrección de pruebas, y mucho más exactamente que Pol & # x003b1, que es deficiente en la corrección de pruebas. Afortunadamente, esta menor fidelidad en la hebra rezagada se compensa con una reparación de desajustes más activa en esa hebra (64). Por lo tanto, la falta de capacidad de desplazamiento de los cordones hace que Pol & # x003b5 menos adecuado para servir como replicasa de hebra rezagada. Por el contrario, sus interacciones con varios componentes del complejo CMG provocan su focalización única en la cadena principal de la bifurcación de replicación (Figura 3). Estudios bioquímicos y genéticos previos establecieron una interacción esencial entre la subunidad Dpb2 de Pol & # x003b5 y la subunidad Psf1 de GINS (14). Un estudio crio-EM de baja resolución de la helicasa CMG en un complejo con Pol & # x003b5 es consistente con estas interacciones, y esta estructura reveló interacciones adicionales entre Mcm5 y la mitad C-terminal de Pol2 (88). El significado funcional de estas interacciones con Pol & # x003b5 está respaldado por estudios bioquímicos recientes de O & # x02019Donnell y colaboradores (89, 90). La helicasa CMG, precargada en la cadena principal de una bifurcación de replicación del modelo, reclutó a Pol & # x003b5 a la cadena principal con preferencia a Pol & # x003b4 y de una manera que dependía de Pol & # x003b5& # x02019s Subunidad Dpb2. Además, incluso cuando Pol & # x003b4 estaba preunido a la hebra principal, Pol & # x003b5 lo desplazó fácilmente si los complejos CMG estaban presentes.

La estructura crio-EM del CMG & # x02013Pol & # x003b5 complejo no solo reveló su arquitectura general e interacciones de proteínas, sino que también sugirió un camino para enhebrar el ssDNA líder a través del complejo CMG y Pol & # x003b5 (88) (Figura 4). En estudios bioquímicos previos en el Xenopus extracto de huevo & # x02013 sistema de replicación de ADN basado en el sistema de replicación de ADN, se permitió que la horquilla de replicación se ejecutara en un entrecruzamiento entre cadenas posicionado con precisión (91). Se observó un estancamiento transitorio de la replicación de la cadena principal

40 nt antes de la reticulación, seguido de una pérdida más pronunciada en una posición

20 nt antes de la reticulación. los

La pérdida de 20 nt es consistente con la longitud del ADN ocluido por el hexámero Mcm2-7 (74), mientras que el

Se propone que la parada de 40 nt represente un enhebrado adicional de la hebra principal a través de Cdc45 y GINS antes de ingresar al Pol & # x003b5 sitio activo (88). Estas consideraciones bioquímicas y estructurales sugerirían que la hebra principal se enhebra preferentemente a través de todo el complejo CMG antes de unirse a Pol & # x003b5, pero puede tener la flexibilidad de liberarse fácilmente de Cdc45 & # x02013GINS, quizás para permitir una respuesta más flexible a los desafíos en la replicación de la cadena principal de ADN (Figura 4).

Estructura e interacciones replisome. Dos modelos para la ruta tomada por la cadena principal antes de entrar en la ADN polimerasa. & # x003b5 (Pol & # x003b5) sitio catalítico. Cualquiera (a)

Se ocluyen longitudes de 20 nt de ADN monocatenario. Se ha propuesto que estas dos formas también pueden interconvertirse. La hebra retrasada se muestra en bucle de modo que tanto Pol & # x003b1 como Pol & # x003b5 moverse en la misma dirección mientras se mantiene en un complejo por Ctf4. Abreviaturas: GINS, Sld5, Psf1, Psf2 y complejo Psf3 Mcm2-7, complejo helicasa PCNA, antígeno nuclear de células proliferantes RPA, proteína de replicación A.


ADN polimerasas

Las enzimas que catalizan la síntesis de ADN en una plantilla de ADN son ADN polimerasas. Realizan dos funciones principales en la célula: la síntesis de ADN durante la replicación del genoma y la resíntesis del ADN faltante después del daño de la recombinación y después de la escisión del cebador de la hebra rezagada.

Tanto en procariotas como en eucariotas, las ADN polimerasas especializadas se dedican a funciones de replicación y reparación; la primera a veces se denomina Réplicas de ADN. Todas las ADN polimerasas poseen un 5 & ​​# 8242- & gt3 & # 8242 polimerasa actividad. y pirofosforolisis actividad, que en conjunto facilita la síntesis de ADN.


Mecanismo de ensamblaje asimétrico de polimerasa en la horquilla de replicación eucariota

Los eucariotas utilizan polimerasas distintas para la replicación de la hebra principal y la rezagada, pero no se sabe cómo se dirigen a sus hebras respectivas. Reconstituimos horquillas de replicación de Saccharomyces cerevisiae y encontramos que la helicasa CMG selecciona la polimerasa (Pol) ɛ con exclusión de Pol δ en la cadena principal. Incluso si Pol δ se ensambla en la cadena principal, Pol ɛ la reemplaza rápidamente. Pol δ-PCNA es distributivo con CMG, en contraste con su alta estabilidad en ssDNA cebado. Por lo tanto, CMG no estabilizará Pol δ, sino que dejará la cadena principal accesible para Pol ɛ y estabilizará Pol ɛ. La comparación de Pol ɛ y Pol δ en un modelo de ADN de hebra rezagada revela lo contrario. Pol δ domina sobre el exceso de Pol ɛ en el ssDNA cebado con PCNA. Por lo tanto, PCNA favorece fuertemente a Pol δ sobre Pol ɛ en la hebra rezagada, pero CMG anula e invierte este equilibrio a favor de Pol ɛ en la hebra principal.

Declaracion de conflicto de interes

INTERESES FINANCIEROS COMPETENTES

Los autores declaran no tener intereses económicos en competencia.

Cifras

Reconstitución de un replisome de cadena principal ...

Reconstitución de un replisoma de cadena principal con CMG, Pol ε, RFC, PCNA y RPA.…

Comparación de Pol ε y Pol δ en la replicación de la cadena principal con CMG. Tiempo…

CMG selecciona Pol ε de una mezcla de Pol ε y Pol δ.…

Pol ε funciona de forma estable con ...

Pol ε funciona de manera estable con CMG, mientras que Pol δ no lo hace. ( a…

Pol ε y Pol δ se asocian rápidamente con una plantilla cebada con PCNA. ( a…

Pol δ es dominante sobre Pol ε en una plantilla de modelo de hebra rezagada. (…

Esquema de ensamblaje asimétrico de polimerasa ...

Esquema de ensamblaje de polimerasa asimétrica en una bifurcación de replicación. ( a ) CMG…


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La replicación del ADN se ha estudiado en una amplia variedad de especies. Para nuestros propósitos, nos centraremos en temas comunes de los mecanismos de replicación que se encuentran tanto en procariotas como en eucariotas. En esta sección se examinarán las ADN polimerasas eucariotas y las proteínas accesorias, haciendo hincapié en las propiedades que son comunes a las que se observan en las enzimas bacterianas.

Se han aislado cinco ADN polimerasas, llamadas a, d, b, e y g, de células eucariotas. Siguiendo el paradigma establecido para estudiar la replicación en bacterias, los investigadores han buscado determinar qué proteínas están involucradas en una función particular utilizando tanto el análisis genético como la caracterización bioquímica. Aunque no se pueden realizar exámenes genéticos para las funciones de replicación del ADN en mamíferos, se ha aprendido una cantidad sustancial al estudiar la replicación in vitro de ADN que contiene orígenes de replicación virales, como los que se encuentran en el virus simio 40 (SV40) o el virus del papiloma bovino. Estos virus de mamíferos tienen cromosomas pequeños (alrededor de 5 a 7 kb) y pueden replicarse completamente en sistemas libres de células. El uso de sistemas libres de células que son competentes para la replicación ha permitido un análisis detallado de las proteínas necesarias para este proceso. La capacidad de interferir con la actividad de proteínas designadas en un sistema libre de células, p. Ej. al agregar anticuerpos que los inactivan o inhibidores para bloquear su actividad, proporciona los medios para probar si esa proteína es necesaria para la replicación del ADN. En efecto, esta interferencia con una proteína en vitroimita la información obtenida de los fenotipos de mutaciones con pérdida de función en los genes que codifican la proteína de interés. Además, las proteínas purificadas se pueden combinar para reconstituir las actividades necesarias para la síntesis completa de la plantilla de ADN viral. El éxito de tal reconstitución indica que se han identificado los componentes principales. Además, se han encontrado en levaduras proteínas homólogas a las identificadas en células de mamíferos, y la mutación de esos genes proporciona información adicional sobre la función biológica de las enzimas. Los resultados de este tipo de estudios se presentan en esta sección.

La principal polimerasa para la replicación del ADN nuclear es ADN polimerasa D (Figura 5.27). Se requiere tanto para la síntesis de la hebra principal como de la hebra retrasada, al menos en en vitrosistemas de replicación. Tiene dos subunidades, una polimerasa (125 kDa) y otra subunidad (48 kDa). Cataliza la síntesis de ADN con alta fidelidad y contiene la actividad exonucleasa 3 'a 5' esperada para la corrección de pruebas. Tiene alta procesividad cuando se asocia con un análogo de la pinza deslizante bacteriana (b2), llamado PCNA.

Figura 5.27. ADN polimerasas eucariotas y proteínas de replicación en la horquilla de replicación. La principal ADN polimerasa replicativa en los núcleos es la ADN polimerasa d. La RFA es el equivalente funcional de la SSB bacteriana; esta proteína de unión monocatenaria recubre el ADN monocatenario. Una helicasa cataliza la separación de las dos hebras parentales. La ADN polimerasa a (que se muestra como un círculo alrededor del nuevo cebador) contiene una primasa que hace tramos cortos de ARN y ADN que sirven como cebadores para la síntesis de ADN.

PCNA, o antígeno nuclear de células en proliferación, se identificó inicialmente como un antígeno que aparece solo en las células en replicación y solo en ciertos momentos del ciclo celular (como la fase S). Esta proteína trimérica tiene una estructura de anillo similar a la de la abrazadera deslizante b2 de MI. coliADN polimerasa III (Figura 5.28), a pesar de la ausencia de similitud de secuencia significativa en las proteínas. La unión de PCNA confiere alta procesividad a la polimerasa d. Por tanto, el PCNA es tanto estructural como funcionalmente análogo al E. coli subunidad b. Cada subunidad del PCNA trimérico se pliega en dos dominios, para un total de seis dominios en el anillo. Cada subunidad del dimérico E. coli La subunidad b se pliega en tres dominios, de nuevo formando seis dominios en el anillo. Por tanto, la pinza deslizante tiene una estructura muy similar tanto en bacterias como en mamíferos.

Figura 5.28. Estructuras similares de factores de procesividad para la replicación del ADN. La proteína de mamífero, PCNA (arriba), es un trímero, cada monómero de los cuales tiene dos dominios similares. El trímero forma un círculo que rodea el ADN, por lo que sirve como una abrazadera deslizante. La subunidad b de la ADN polimerasa III de E. coli es un dímero (abajo), cada monómero del cual tiene tres dominios similares. Estos dominios tienen una estructura muy similar a los de PCNA, a pesar de tener solo una similitud de secuencia limitada. Por tanto, las pinzas deslizantes funcionalmente análogas en eucariotas y procariotas tienen estructuras similares.

Las uniones plantilla-cebador son reconocidas por la multisubunidad factor de replicación C o RFC. Como el complejo g en E. coli, esta enzima es una ATPasa y ayuda a cargar el factor de procesividad PCNA. Por tanto, RFC está llevando a cabo una función similar a la del complejo g bacteriano.

Una de las primeras polimerasas eucariotas que se aisló fue ADN polimerasa a, que ahora se reconoce como un catalizador de la síntesis de cebadores. Esta enzima contiene cuatro subunidades polipeptídicas, una con actividad polimerasa (170 kDa), dos que comprenden una actividad primasa (50 y 60 kDa) y otra subunidad de función (actualmente) indeterminada (70 kDa). La ADN polimerasa a tiene baja procesividad pero alta fidelidad. Esta alta fidelidad es sorprendente porque no hay exonucleasa 3 'a 5' asociada con la enzima. La polimerasa a, posiblemente con primasas adicionales, cataliza la síntesis de segmentos cortos de ADN y ARN que sirven como cebadores para las polimerasas replicativas.

ADN polimerasa mi está relacionado con la polimerasa d, y puede desempeñar un papel en la síntesis de hebras rezagadas. También depende de PCNA, en vivo. Sin embargo, no se ha identificado ningún requisito para ello en los sistemas de replicación viral. in vitro.

El compuesto afidicolina bloqueará el crecimiento de células de mamíferos. Lo hace evitando la replicación del ADN, y los objetivos de este fármaco son las ADN polimerasas ayd (así como e). El hecho de que la inhibición de estas ADN polimerasas con afidicolina también detenga la replicación del ADN en las células de mamíferos sostiene que, de hecho, ayd son responsables de la replicación del ADN nuclear en las células eucariotas. Esta conclusión está fuertemente apoyada por el fenotipo de mutaciones condicionales de pérdida de función en los genes que codifican los homólogos de estas polimerasas en levaduras. Such mutants do not grow at the restrictive temperature, indicating that d and a are the replicative polymerases. The biochemical evidence implicates polymerase a in primer formation, and d appears to be the major polymerases used to synthesize the new strands of DNA.


DNA Replication: Eukaryotic Elongation and Termination.

We discussed about the Initiation in the Eukaryotic cells in the last post. In the present post, let’s look into the Alargamiento y el Terminación in Eukaryotic DNA Replication.

During Initiation, a repertoire of proteins bind and unwind the DNA at the origen. To this protein complex the polimerasas are loaded. The polymerases work together with other proteins for the elongation of the daughter strands.

(Just for info: Read more about the eukaryotic origins in the paper titled ‘Making Sense of Eukaryotic DNA Replication Origins‘.)

Elongation:

The first polymerase to initiate the DNA synthesis is the DNA polymerase α, which exists in the form of DNA polymerase α-primase complex. The primase subunit synthesizes the RNA primers (around 7-12 nucleotides) which are then transferred to the polymerase domain and extended with DNA bases (around 20-25 nucleotides). Replication factor C (RFC) initiates a reaction called polymerase switching. The DNA strands are then extended by other polymerases namely the DNA polymerase δ y DNA polymerase ε.

Leading strand synthesis:

Fig 1: Synthesis of leading or continuous strand.

As DNA pol α completes synthesizing RNA primer and adding DNA bases, the RFC causes dissociation of DNA pol α and assembles proliferating cell nuclear antigen (PCNA) in the region of the primer terminus. PCNA is a DNA clamp for DNA polymerases.

Pol ε has been reported as the main leading strand synthesis polymerase (in Saccharomyces cerevisiae). In the leading strand as the replication is continuous and the primer is synthesized only once and the extension is carried out (fig 1).

Lagging strand synthesis:

Fig 2: Synthesis of lagging or discontinuous strand with series of Okazaki fragments.

Polymerases δ is the major polymerase in lagging-strand synthesis. The replication in the lagging strands is discontinuous and takes place with formation of several Okazaki fragments (fig 2).

Okazaki fragments (fig 3) generated in eukaryotes during lagging-strand synthesis are around 200 bases (prokaryotes, around 2000 bases) long. As several Okazaki fragments are made, Polymerase switching during synthesis of Okazaki fragments is of higher importance.

Hence an Okazaki fragment is made up of RNA nucleotides (7-10 nucleotides), then around 10-20 nucleotides of DNA bases are added by the DNA pol α. Following which, the RFC causes polymerase switching and the deoxyribonucleotides are added by DNA pol δ held by the PCNA, the sliding abrazadera (see the figure below). DNA pol δ dissociates after the synthesis of the entire DNA stretch, as it approaches the previous RNA primer.

(Just for info: Know more about PCNA)

The proteins involved in the replication, especially PCNA (Boehm et al., 2016).

RNA primers are removed by RNase H1, such that one ribonucleotide remains still attached to the DNA (3′ end) part of the Okazaki fragment. This left out ribonucleotide is then removed by flap endonuclease 1 (FEN 1). Polymerase δ then fills the gaps formed between Okazaki fragments following the primer removal. los nick formed between the Okazaki fragment and the lagging strand are filled in by DNA ligase I, hence forming single lagging strand.

Fig 4: Removal of RNA primer and linking of individual Okazaki fragments.

Nucleosome Assembly:

During elongation, there is continuous disassembly as reassembly of the nucleosome packaging along the DNA, too. As we know, one of the feature of the eukaryotic DNA is that it is packaged in form of highly compact structures called the Cromosomas. It involves winding of the negatively charged DNA around the basic proteins called histonas to form structures called nucleosomas (fig below). Each nucleosome is composed of 8 histona proteins, two each of H2A, H2B, H3 and H4. Histone H1 forms the linker between two nucleosomes.

The nucleosomes.

During replication, two nucleosomes in front of the replication fork, that is unreplicated DNA, becomes destabilized. Hence the replication fork movement causes DNA packaging to disorganise to allow the replication proteins to interact with the DNA.

En el replicated portion, the leading and lagging strands were nucleosome-free till about 225 bp and 285 bp, respectively. Following this region, the DNA was packaged with histone octomer but some lacked histone H1. After around 450 bp to 650bp from the replication fork, complete nucleosomes with H1 were detected in the daughter strands. Hence there is stepwise assembly of daughter strands into complete nucleosome.

The parental nucleosomes disassociate and randomly bind the daughter DNA strands, such that each strands has mitad de El parental nucleosomes. The remaining nucleosome components required for packaging the two daughter strands, are synthesized de novo and assembled onto the daughter strands.

Termination:

Following the successful elongation, the replication has to be terminated to give two separate copies of the DNA.

Involving two adjacent replication forks:

As the eukaryotic cell have a large number of orígenes, the termination involves merging of two adjacent replication forks. This includes four different steps:

– Dissolution:

The DNA stretch between the two adjacent forks (fig 5.a) is unwound (fig 5.b) and the approaching CMGs pass each other (fig 5.c). The last Okazaki fragment is processed by DNA pol δ and FEN1 (fig 5.d).

los gaps in the daughter strands (as in normal Okazaki fragments) are filled in and two oppositely approaching synthesized strands are ligated.

– Dissociation of replisome:

The replisome complex dismantles after the convergence of the two replication fork. This process involves termination-specific polyubiquitylation of Mcm7 and the p97/VCP/Cdc48 segregase (fig 5.e).

– Decatenation:

If there are any intertwinings in the daughter DNA strands or catenanes, they are removed utilising topoisomerasa II segregating the two strands.

Fig 5: Termination involves merging of the two neighbouring forks (Dewar & Walter, 2017).

Involving the ends of the Chromosomes:

As is known the DNA in eukaryotic chromosomes is a lineal molecule, the termination in eukaryotic DNA also involve completing replication at the termina of chromosomes known as Telomeres (fig 6).

Fig 6: Telomeres form protective end of eukaryotic linear DNA (Aulinas, 2013).

During the synthesis of Okazaki fragments, RNA primer proveer 3′-OH group for 5′ to 3′ replication. On the removal of RNA primer, from the lagging strand en el chromosome end, the end remains unreplicated and the newly synthesized strand is shortened (fig 7).

Fig 7: Shortening of the chromosome ends.

This shortening of the chromosome is prevented by the presence of special repeats of sequences called telómeros (and telomere-associated proteins) at the ends of DNA in chromosomes contain. Por ej. human Chromosomes are protected by telomeres having repeated sequences of (TTAGGG)n of about 15–20 kb at birth. These structures protect the ends of chromosomes from being mistakenly considered as DNA double strand breaks (DSB).

In normal somatic cells, the telomeric region of eukaryotic chromosomes are shortened with each round of DNA replication. After certain number of DNA replications, and hence cell divisions, the telomeres are shortened to an extent that it leads to replicative cell senescence o apoptosis.

(Just for info: Please read about the Nobel prize given to a work on telomeres.)

Sin embargo, en línea germinal y cancer cells, an enzyme called telomerase, extends the ends of the chromosomes, especially the 5′ end of the lagging strands. The ability to maintain the length of the telomeres, make these cells inmortal.

Telomerase is a la transcriptasa inversa which has a ARN template, conocido como template-encoding RNA molecule (TER) for extension of the telomeric DNA (fig 8). Lo básico proteína component of telomerase is known as TERT (TElomerase Reverse Transcriptase).

In humans, the RNA template has the sequence AUCCCAAUC. The newly synthesized telomeric DNA repeats are added to the overhanging single-stranded 3′ end of the DNA (fig 8).

Fig 8: Synthesis of telomeric DNA repeats by Telomerase (Verhoeven et al, 2014).

(Just for info: visit to watch the animation on action of Telomerase and much more.)

After strand extension on the 3′ end by the telomerase is completed, DNA pol α and DNA ligase complete the DNA strand synthesis.

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Read more posts by The Biotech Notes:

Bambara et al. (1997) Enzymes and Reactions at the Eukaryotic DNA Replication Fork. J Biol Chem. 272(8):4647-50.

Abmayr and Workman (2012) Holding on through DNA Replication: Histone Modification or Modifier? Celda. 150(5):875-7.

Verhoeven et al (2014). Cellular aging in depression: Permanent imprint or reversible process?: An overview of the current evidence, mechanistic pathways, and targets for interventions. BioEssays 36(10):968-78.

Bailey et al (2015) Termination of DNA replication forks: “Breaking up is hard to do”.Nucleus 6 (3):187-196.

Dewar & Walter (2017) Mechanisms of DNA replication termination. Nature Reviews Molecular Cell Biology 18:507–516.

Aulinas (2013) Telomeres, aging and Cushing’s syndrome: Are they related? Endocrinology and Nutrition (English Edition) 60(6): 329-335.

Boehm et al. (2016) The Many Roles of PCNA in Eukaryotic DNA Replication. Enzymes 39:231-54.


Ver el vídeo: Replicación del ADN (Julio 2022).


Comentarios:

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