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Lo que significa M9

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¿Alguien puede decirme qué? M9 representa en M9 medio?

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Ingenieria Escherichia coli para la conversión de metanol

Las bacterias metilotróficas utilizan metanol y otros compuestos de un carbono reducido como su única fuente de carbono y energía. Para este propósito, estas bacterias desarrollaron una serie de enzimas y vías especializadas. Aquí, usamos un enfoque de biología sintética para seleccionar e introducir un conjunto de "genes de metilotrofia" en Escherichia coli Residencia en en silico consideraciones y análisis de balance de flujo para permitir la disimilación y asimilación del metanol. Determinamos que el enfoque más prometedor que permitió la utilización de metanol fue la implementación de metanol deshidrogenasa dependiente de NAD y el establecimiento del ciclo de ribulosa monofosfato expresando los genes para la hexulosa-6-fosfato sintasa (Hps) y 6-fosfo-3- hexuloisomerasa (Phi). Para probar las enzimas de mejor desempeño en el huésped heterólogo, se seleccionaron varias enzimas candidatas de diferentes organismos donantes y se analizaron sistemáticamente para determinar su eficacia. in vitro y en vivo actividades en E. coli. Entre estos, Mdh2, Hps y Phi procedentes de Bacillus methanolicus resultaron ser los más eficaces. Experimentos de etiquetado utilizando metanol 13 C con E. coli la producción de estas enzimas mostró hasta un 40% de incorporación de metanol en metabolitos centrales. La presencia de la vía de oxidación de formaldehído endógena dependiente de glutatión de E. coli no afectó negativamente a la tasa de conversión de metanol. Tomados en conjunto, los resultados de este estudio representan un gran avance hacia el establecimiento de metilotrofos sintéticos por transferencia de genes.


NUEVO para 2014 y # 8211 Next Generation M Series

Nota del editor: la siguiente información proviene del sitio web del fabricante y nuestra revisión de las máquinas verifica la información.

El NUEVO 2014 M9 Life Ionizer es un rediseño completo que reemplaza su popular LIFE 9100. ¡La "M" en la Serie M significa Máximo & # 8211 y LIFE lo significa! El nuevo M-9 supera a todos los demás ionizadores:

  • Agua alcalina con un pH que se ajusta hasta 11,5
  • Mayor potencial antioxidante que se ajusta hasta -800 ORP
  • SMPS MAX Yield Power ™ & # 8211 ajusta hasta 252 a 504 vatios *

La riqueza de especies de árboles aumenta el almacenamiento de carbono del ecosistema en los bosques subtropicales

Los ecosistemas forestales son un componente integral del ciclo global del carbono, ya que absorben y liberan grandes cantidades de C en períodos cortos de tiempo (flujo de C) o lo acumulan durante períodos de tiempo más largos (existencias de C). Sin embargo, sigue habiendo incertidumbre acerca de si y en qué dirección los flujos de C y, en particular, las existencias de C pueden diferir entre bosques de alta y baja riqueza de especies. Basándonos en un conjunto de datos completo derivado de mediciones de campo, probamos el efecto de la riqueza de especies (3-20 especies de árboles) y la edad del rodal (22-116 años) en seis compartimentos de existencias de C por encima y por debajo del suelo y cuatro componentes de los flujos de C en los bosques subtropicales del sureste de China. En todos los rodales forestales, el stock total de C fue de 149 ± 12 Mg ha -1, la riqueza explica el 28,5% y la edad el 29,4% de la variación en esta medida. Los rodales ricos en especies tenían existencias y flujos de C más altos que los rodales con baja riqueza y, además, los rodales viejos tenían existencias de C más altas que los jóvenes. En general, por cada especie de árbol adicional, la reserva total de C aumentó en un 6,4%. Nuestros resultados proporcionan pruebas exhaustivas del secuestro de C por encima y por debajo del suelo mediado por la diversidad en los bosques subtropicales ricos en especies del sureste de China. Por lo tanto, las políticas de forestación en esta región y en otros lugares deben considerar un cambio del enfoque actual de monocultivos a plantaciones de múltiples especies para aumentar la fijación de C y, por lo tanto, retrasar el aumento de CO2 atmosférico.2 concentraciones y calentamiento global.

Palabras clave: BEF-China ecosistema de almacenamiento de carbono de flujo de carbono en funcionamiento biodiversidad de bosques de hoja ancha de hoja perenne.


Materiales y métodos

Sustancias químicas y reactivos

Todos los productos químicos y disolventes se compraron a Sigma-Aldrich a menos que se indique lo contrario. Las endonucleasas de restricción y las enzimas modificadoras del ADN eran de New England Biolabs. El plásmido de ADN se extrajo usando el kit GeneJET Plasmid Miniprep (Thermo Scientific). La secuenciación del ADN se subcontrató a Eurofins SAS (Ebersberg, Alemania).

Construcción de plásmido

Se utilizaron los vectores pZA23, pZA33, pZE23 y pZS23 de Expressys & # x000AE ya que son inducibles por IPTG y albergan una estructura aligerada del lacI gen que reduce su tamaño (2 358 a 3 764 pb) y son modulables (origen de replicación fácil de cambiar, marcador de resistencia y promotor del vector por restricción / ligación). En este estudio, el promotor PA1lac0-1 en pZA33 ha sido reemplazado por el promotor constitutivo proC y por el promotor inducible Ptac, generando pZA37 y pZA36, respectivamente. Asimismo, el promotor PA1lac0-1 de pZS23 ha sido reemplazado por proD generando pZS28.

La clonación de genes se llevó a cabo usando NEBuilder HIFI DNA Assembly Master Mix (NEB E2621). Este método permite ensamblar varios fragmentos en un solo paso. La mezcla comercial proporcionada por New England Biolabs contiene (a) una exonucleasa, que crea 3 & # x02032 extremos de una sola hebra, lo que facilita el ensamblaje de los fragmentos, que comparten una secuencia complementaria (b) una polimerasa, que llena los espacios vacíos después de los fragmentos se han ensamblado y (c) una ligasa, que une los fragmentos. los E. coli kdsD, fsaA y aldA Los genes fueron amplificados a partir del ADN del genoma extraído de E. coli K12 MG1655 mediante PCR utilizando los cebadores descritos en la Tabla S1. Fragmentos (kdsD & # x0002B fsaA o aldA) se insertaron luego mediante ensamblaje HiFi & # x000AE en pZ linealizado de antemano con cebadores hibridando a ambos lados del MCS. Todos los plásmidos se han verificado mediante secuenciación. Los plásmidos resultantes que llevan el kdsD, fsaA y aldA Los genes se informan en la Tabla 2.

Tabla 2. Plásmidos utilizados o construidos en este estudio.

Construcción y transformación de deformaciones

los E. coli Las cepas utilizadas en este trabajo se enumeran en la Tabla 3. Eliminación de genes (es decir, glcD, fucA, mgsA, pfkA, ptsG) se realizó mediante transducción utilizando el fago P1vir. La preparación de los lisados ​​P1vir y los procedimientos de transducción se llevaron a cabo como se describe en Bremer et al. (1984) con ligeras modificaciones. Se inocularon cepas (cepa donante) de la colección KEIO (Murakami et al., 2007) con una sola deleción y un casete de resistencia a antibióticos de kanamicina (200 & # x003BCl de un precultivo nocturno hecho en LB) en 5 ml de LB que contenía 0,2% D-glucosa y CaCl 5 mM2 durante 30 min a 37 & # x000B0C. A continuación, se añadieron 100 & # x003BCl de lisado de P1vir (& # x0007E 5 & # x000D7 10 8 fagos / ml) a cada cultivo de donante y se incubaron a 37 & # x000B0C durante 2 a 3 h hasta que el cultivo estuvo claro y las células completamente. lisado (Baba et al., 2006). Los lisados ​​se recuperaron mediante filtración usando filtros de jeringa estériles de 25 mm con una membrana de soporte de 0,2 & # x003BCm (Pall) y se conservaron a 4 & # x000B0C. Para eliminar el gen de interés, la cepa receptora se infectó con P1vir que portaba el casete de eliminación del gen del donante que tenía resistencia a la kanamicina. Para ello, la cepa receptora se cultivó previamente en 5 ml de medio LB a 37 ° C, se recogió por centrifugación a 1500 g durante 10 min y se resuspendió en 1,5 ml de MgSO 10 mM.4 y CaCl 5 mM2. Se añadió (0,1 ml) a la suspensión de la cepa receptora lisado de P1vir que portaba el casete de deleción génica de la cepa donante y se incubó durante 30 min a 37 ° C. Luego, se agregaron 0,1 ml de citrato de sodio 1 M, luego 1 ml de LB, y esta suspensión celular se incubó durante 1 ha 37 ° C, 200 rpm antes de esparcirse sobre un medio sólido LB con el antibiótico apropiado. Las colonias se seleccionaron mediante PCR para aislar los eventos de transducción satisfactorios. La eliminación del casete de antibiótico se llevó a cabo mediante la transformación de las cepas de bacterias con el plásmido pCP20 que porta la recombinasa FLP, seguido de la comprobación por PCR.

Tabla 3. E. coli cepas utilizadas y construidas en este trabajo.

Las cepas competentes no comerciales se prepararon de acuerdo con el protocolo de Chung et al. (1989) con modificaciones menores como sigue. Se hizo un precultivo durante la noche en LB durante la noche. A continuación, se inoculó el cultivo de LB fresco con células en una DO600 de 0,1. Cuando HACER600 alcanza aproximadamente 0,5, se recogieron 2 ml de cultivo y el sedimento resultante se resuspendió en tampón TSS 300 & # x003BCl [2,5%(Virginia Occidental) PEG 3350, MgCl 1 M2, 5%(vol / vol) DMSO]. Después de 10 min en hielo, se añadió el plásmido de interés a la suspensión celular, que se incubó adicionalmente durante 30 min en hielo. Este paso fue seguido por un choque térmico a 42 ° C durante 90 s. Las células transformadas se pusieron en hielo durante 10 min, luego se añadieron 400 & # x003BCl LB y el cultivo se incubó a 200 rpm durante 1 ha 30 & # x000B0C. Después de centrifugación a 8 000 rpm durante 2,5 min, el sedimento celular se resuspendió en 600 & # x003BCl de LB y se esparcieron 150 & # x003BCl en placas de LB sólidas con el antibiótico apropiado.

Condiciones de cultivo

Para las técnicas de biología molecular, las cepas de bacterias se cultivaron en medio LB (triptón 10 g / L, extractos de levadura 5 g / L y NaCl 5 g / L), y se añadió agar 5 g / L para medio sólido en placas de Petri. Para la producción de GA se utilizó el medio mineral M9. Salvo que se indique lo contrario, contenía por litro: 18 g de Na2 HPO 4 * 12H2O, 3 g KH2correos4, 0,5 g de NaCl, 2 g de NH4Cl, 0,5 g de MgSO 4 * 7H2O, 0,015 CaCl 2 * 2H2O, 1 ml de FeCl 0,06 M3 de una solución madre 1000 & # x000D7 en HCl concentrado, 2 ml de solución madre de tiamina HCl 10 mM, 20 g de MOPS y 1 ml de solución de oligoelementos (solución 1000 & # x000D7 de 0,5 g de Na2EDTA & # x0002A 2H2O, 0,18 g de CoCl 2 * 6H2O, 0,18 g de ZnSO 4 * 7H2O, 0,4 g de Na2 MoO 4 * 2H2O, 0,1 g H3BO3, 0,12 g de MnSO 4 * H2O, 0,12 g de CuCl2 & # x000D7 H2O). La fuente de carbono D-glucosa, L-arabinosa o D-xilosa se añadió a una concentración final de 10 g / l, el pH se ajustó a 7 con ácido 3- (N-morfolino) propanosulfónico (MOPS) y luego se esterilizó por filtración a través de Membranas de 0,2 & # x003BCm. Los antibióticos ampicilina, kanamicina y cloranfenicol se agregaron cuando fue necesario en concentraciones de 100, 50 y 25 mg / L, respectivamente. Para el E. coli cepas defectuosas en la actividad de la transcetolasa (& # x00394tktA & # x00394tktB), El medio M9 se complementó con 500 & # x003BCM L-fenilalanina, 250 & # x003BCM L-tirosina, 200 & # x003BCM L-triptófano, 6 & # x003BCM p-aminobenzoato, 6 & # x003BCM p-hidroxidenoato y 280 & # x003BCM # x003BCM shikimate y trazas de LB (20% V / V). Para las cepas defectuosas en la actividad gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (& # x00394gapA), el medio M9 se completó con 0,4 g / L de ácido málico ajustado a pH 7 con KOH. Cuando fue necesario, se añadieron los antibióticos apropiados al medio a 100 & # x003BCg / mL para ampicilina, 50 & # x003BCg / mL para kanamicina, o 25 & # x003BCg / mL para cloranfenicol. Los cultivos de bacterias se colocaron en un agitador rotatorio a 200 rpm ya 37 ° C. El crecimiento se controló midiendo la absorbancia a 600 nm con un espectrofotómetro (Biochrom Libra S11).

Producción, purificación y análisis de enzimas

los kdsD, fsaA, y aldA los genes se amplificaron usando cebadores en la Tabla S1 y se clonaron en el vector de expresión pET28a (Novagen). los E. coli La cepa BL21 (DE3) transformada con el plásmido que lleva estos genes se inoculó a partir de un precultivo elaborado en LB-kanamicina (50 mg / L) en 200 ml de LB-Kanamicina a 600 nm (DO600) de 0,1 a 16 & # x000B0C en un agitador rotatorio a 200 rpm. Cuando HACER600 alcanzó 0,6 & # x020130,8, la expresión de la proteína de interés se indujo mediante la adición de IPTG a una concentración final 1 mM de IPTG 1 mM. Después de 16 ha 16 ° C, el cultivo se recogió mediante centrifugación a 4.800 rpm durante 15 minutos a 4 ° C. El sedimento celular se resuspendió en 1,5 ml de tampón de lavado (HEPES 50 mM, pH 7,5, NaCl 0,3 M) y se sonicó cuatro veces (30 s cada una) al 30% de potencia en hielo. Las proteínas marcadas con HIS se purificaron utilizando resina de cobalto según el protocolo descrito en el kit comercial (Clontech). La purificación de la proteína se verificó mediante electroforesis SDS-PAGE y la concentración de proteína se midió mediante el método de Bradford (Bradford, 1976)

Los ensayos de enzimas se realizaron en un Tris-Cl, 100 mM pH 7.5 / 10 mM MgCl2 búfer a 37 & # x000B0C. A menos que se indique lo contrario, la actividad de KdsD se midió en un ensayo acoplado en presencia de NAD & # x0002B 3 mM y D-Ribu-5P 5 mM con 10 & # x003BCg / ml de cada uno de FsaA y AldA. La FSA se midió acoplando GAP producido a partir de la escisión de Ara5P 3 mM con la oxidación de NADH 0,2 mM a 340 nm en presencia de 1 U / ml de triosa isomerasa y glicerol-3-P deshidrogenasa. El AldA se midió en el mismo tampón por reducción de NAD & # x0002B (3 mM) a 340 nm en presencia de glicolaldehído 5 mM.

Métodos analíticos

Los metabolitos extracelulares se determinaron mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) con un cromatógrafo Ultimate 3000 (Dionex, Sunnyvale, EE. UU.). El sistema de HPLC estaba equipado con una columna de intercambio catiónico (Aminex, HPX87H 300 & # x000D7 7,8 mm, 9 & # x003BCm, BioRad), un inyector automático (WPS-3000RS, Dionex), un detector IR (RID 10A, Shimadzu) y un detector de UV (SPD-20A, Shimadzu). El volumen de inyección de la muestra fue 20 & # x003BCL, y los compuestos se separaron en una columna Aminex HPX-87H protegida por una precolumna Micro-Guard Cation H (BioRad, EE. UU.). La separación se realizó a 35 ° C con 1,25 mM de H2ASI QUE4 a 0,5 ml min & # x022121 como fase móvil. Todas las muestras se centrifugaron (2 min a 10.000 g) y se filtraron con jeringa (0,2 & # x003BCm), y el sobrenadante resultante se mantuvo a & # x0221220 & # x000B0C hasta el análisis.

Modelado a escala del genoma y análisis de equilibrio de flujo

La escala del genoma iJO1366 E. coli El modelo (Orth et al., 2011) se ha adaptado para simular la producción de GA a través de la vía glycoptimus. En particular, una modificación fsaA Se añadió reacción al modelo para permitir la conversión de arabinosa-5P en gliceraldehído-3P y glicolaldehído. Se realizaron análisis de balance de flujo parsimoniosos (pFBA) utilizando el software OptFlux (Rocha et al., 2010), utilizando D-glucosa, L-arabinosa o D-xilosa como fuente de carbono. Para cada simulación, la tasa de absorción de la fuente de carbono se fijó arbitrariamente en 10 mmol. g CDW - 1 .h & # x022121. El mantenimiento no asociado al crecimiento se fijó en 3,15 mmol.ATP. g CDW - 1 .h & # x022121, y las reacciones involucradas en el sistema de transporte de electrones se restringieron para simular una relación P / O realista, como se describió anteriormente (Orth et al., 2011). Las simulaciones de pFBA se realizaron utilizando la exportación GA como función objetivo para maximizar.

Métodos de estadística

Los análisis estadísticos se realizaron en Microsoft Excel & # x000AE utilizando el paquete Analysis ToolPak. Un desapareado de dos colas t-prueba iba a utilizar para comparar los niveles de inducción de fluorescencia, en el que un nivel alfa de pag & # x0003C 0,05 se estableció como significancia.


Información del autor

Estos autores contribuyeron igualmente: Yuxin Chen, Yuanyuan Huang.

Afiliaciones

Departamento de Biología Evolutiva y Estudios Ambientales, Universidad de Zúrich, Zúrich, Suiza

Yuxin Chen, Yuanyuan Huang, Pascal A. Niklaus y Nadia Castro-Izaguirre

Laboratorio clave de ecosistemas costeros y de humedales (Ministerio de Educación), Facultad de Medio Ambiente y Ecología, Universidad de Xiamen, Xiamen, China

Facultad de Ciencias de la Vida / Laboratorio Estatal de Biocontrol, Universidad Sun Yat-sen, Guangzhou, China

Departamento de Diversidad Fisiológica, Centro Helmholtz de Investigaciones Ambientales (UFZ), Leipzig, Alemania

Centro Alemán para la Investigación Integrativa de la Biodiversidad (iDiv) Halle — Jena — Leipzig, Leipzig, Alemania

Adam Thomas Clark y Helge Bruelheide

Universidad Martin Luther Halle-Wittenberg, Halle (Saale), Alemania

Laboratorio Estatal Clave de Vegetación y Cambio Ambiental, Instituto de Botánica, Academia de Ciencias de China, Beijing, China

Departamento de Geografía, Universidad de Zúrich, Zúrich, Suiza

Instituto de Ecología, Facultad de Ciencias Urbanas y Ambientales, Universidad de Pekín, Beijing, China

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Contribuciones

Y.C. y B.S. concibió el estudio. Y.C. y A.T.C. desarrolló el procedimiento analítico. Y.C. realizó los análisis con contribuciones de Y.H. y B.S. H.B., N.C.-I., Y.C., K.M., Y.H., P.A.N. y B.S. contribuido a la recopilación de datos. Todos los autores discutieron los resultados del análisis y ayudaron a escribir el artículo.

Autor correspondiente


Discusión

Comprender cómo la estructura a nanoescala de los sistemas biológicos se relaciona con la función es una búsqueda constante y desafiante. Una dificultad es que solo unas pocas sondas son capaces de interrogar directamente la estructura a esta escala: electrones, rayos X y neutrones. Los electrones han disfrutado de la aplicación más amplia en biología celular, y la EM sigue siendo la herramienta más poderosa para estudiar la ultraestructura celular. Con respecto a la B. subtilis membrana, un estudio crio-EM de células seccionadas sustituidas por congelación proporcionó una imagen sorprendente de la arquitectura celular, incluida la pared celular. [56] Sin embargo, la estructura de la membrana plasmática no estaba bien determinada y su espesor se estimó en 66 ± 8 Å, un valor sorprendentemente grande. Nuestros resultados complementan esta imagen EM de la envoltura celular al proporcionar una determinación del espesor hidrófobo de alta resolución obtenida en condiciones fisiológicas.

La dispersión de rayos X y neutrones se ha utilizado ampliamente para estudiar la estructura de membranas modelo compuestas por mezclas de lípidos definidas [3–5,28,29,46] o extractos de lípidos naturales. [6–12] La dispersión de rayos X también se ha utilizado utilizado recientemente para el estudio ex vivo de las membranas celulares, [6] pero su aplicación a células intactas se ve confusa por el problema de la dispersión de fondo del agua y las biomoléculas. La dispersión de neutrones proporciona de manera única una solución al problema de fondo en forma de variación de contraste isotópico. Hemos demostrado aquí que la variación de contraste in vivo a través del etiquetado metabólico puede suprimir eficazmente la dispersión del medio celular complejo, al tiempo que resalta características específicas de interés, incluso cuando surgen de componentes menores como los lípidos (aproximadamente el 1% de la masa celular húmeda). Además, los neutrones fríos utilizados para los experimentos de dispersión son muy adecuados para estudios en células vivas debido a su baja energía cinética (& lt0.025 eV) y su carácter no ionizante, en contraste con los rayos X de alta energía y los haces de electrones (& gt5,000 eV).

Las aplicaciones anteriores de la dispersión de neutrones in vivo se han basado únicamente en el contraste de solvente externo, que en algunos casos ha sido suficiente para observar la dispersión de Bragg de las estructuras repetidas en las membranas tilacoides [57,58] y las mitocondrias. [59] Estos estudios no han revelado la estructura de la membrana per se, pero han proporcionado información sobre la disposición de las membranas empaquetadas. Al crear un contraste interno, es decir, al etiquetar de forma diferencial componentes celulares específicos, hemos permitido por primera vez mediciones ultraestructurales de alta resolución en una sola membrana. En este trabajo, demostramos el poder de un enfoque basado en la biología química para crear un contraste interno selectivo, lo que permite realizar mediciones de alta resolución del espesor de la membrana in vivo.

Nuestro enfoque de variación de contraste in vivo también proporciona una nueva herramienta para estudiar la estructura de la membrana lateral en células vivas. Los métodos estructurales basados ​​en neutrones ofrecen distintas ventajas, ya que informan directamente sobre la estructura lipídica nanoscópica, sin la necesidad de modelos o sondas extrínsecas. Las indicaciones de mezcla no uniforme [60,61] dentro de la membrana plasmática surgieron al mismo tiempo que el modelo histórico de mosaico de fluidos propuesto en 1972, [16] el concepto de dominios de membrana quedó bien establecido a mediados de la década de 1970, [62] y la balsa lipídica La hipótesis se formalizó en 1997. [21] No obstante, la existencia de dominios lipídicos sigue siendo controvertida, [63] y debido a que se cree que son transitorios y más pequeños que el límite de difracción de la luz (200 nm), eludieron la observación mediante técnicas microscópicas convencionales. Sin embargo, recientemente se utilizó microscopía de fluorescencia de ultra resolución para identificar islas restringidas por difusión en la escala de 20 nm en la membrana plasmática de células epiteliales de riñón de rata. [6] Nuestra observación de la segregación de lípidos en una escala comparable en la membrana plasmática de B. subtilis es consistente con la existencia de dominios lipídicos análogos en bacterias y apoya la idea de que los ensamblajes lipídicos nanoscópicos son una característica integral de las membranas biológicas.

La barrera crítica que ha impedido la aplicación de técnicas de dispersión de neutrones de alta resolución in vivo fue la falta de un medio para crear contraste interno. En este trabajo, superamos la barrera y demostramos que B. subtilis es un sistema de modelo in vivo ideal para la aplicación de estrategias de variación de contraste de neutrones. A través de condiciones de crecimiento específicas y genotipos seleccionados, pudimos atenuar el contraste celular de manera global y reintroducir con precisión el contraste en la membrana. Con la capacidad de controlar las propiedades químicas e isotópicas de los lípidos de la membrana, pudimos interrogar tanto la estructura de la membrana transversal como la lateral. El mismo enfoque general para el contraste selectivo puede potencialmente extenderse a otras biomoléculas y organismos modelo para aplicaciones fuera del campo de las membranas. De manera más inmediata, la plataforma experimental in vivo se puede utilizar para investigar la respuesta de la membrana plasmática a una amplia gama de estímulos físicos, químicos, genéticos y ambientales. Anticipamos que esta capacidad, por lo tanto, resultará valiosa en muchas áreas, como el desarrollo de antibióticos, la producción de biocombustibles, la función de la proteína de membrana y la comprensión de la interacción entre la membrana, el citoesqueleto y la pared celular para crear una interfaz multifuncional, adaptable y protectora.


LB Media

LB es el medio más común utilizado para cultivar recombinantes Escherichia coli (E. coli). Giuseppe Bertani nombró a LB media como “caldo de lisogenia” debido a la investigación que estaba realizando sobre la lisogenia. LB comúnmente se refiere incorrectamente a los medios Luria-Bertani, Luria Broth o Lennox Broth. Los medios LB también se utilizan para cultivar una variedad de otros organismos facultativos.

Componentes de LB Media

Una razón por la que se usa comúnmente LB es porque es simple de hacer, con solo unos pocos ingredientes, triptona, extracto de levadura y cloruro de sodio (NaCl). La triptona, una mezcla de péptidos generados por la digestión de la caseína con la enzima pancreática tripsina, proporciona nitrógeno y carbono. El extracto de levadura proporciona vitaminas (incluidas las vitaminas B) y algunos oligoelementos. El NaCl proporciona iones de sodio para el transporte y el equilibrio osmótico. E. coli derivada de la cepa K-12, una de las cepas parentales más comúnmente utilizadas de E. coli en uso en biología molecular hoy en día son deficientes en la producción de vitamina B.

Antecedentes históricos de LB

LB es un medio rico en nutrientes que se ha utilizado desde la década de 1950 para cultivar Enterobacteriaceae y para ensayos de placa de bacteriófagos. LB permite un crecimiento rápido con buenos rendimientos de crecimiento para muchas especies. En 1951, Giuseppe Bertani desarrolló LB para optimizar la formación de placa en un Shigella cepa indicadora de Enterobacteriaceae. Hoy en día, el medio LB es el medio más común para el crecimiento de cepas recombinantes de E. coli. Hay tres formulaciones comunes de LB: LB Miller, LB Lennox y LB Luria. Todos se denominan a veces LB, aunque la formulación de LB Miller es la formulación común o más estándar de LB. Las formulaciones alternativas de LB varían en la concentración de NaCl (Tabla 1).

Tabla 1. Formulaciones de LB.

Ingredientes % Luria (g / L) Lennox (g / L) Miller (g / L)
Triptona 1.0% 10 10 10
Extracto de levadura 0.5% 5 5 5
Cloruro de sodio (NaCl) 0,05, 0,5 o 1,0% 0.5 5 10

La confusión sobre el nombre LB es comprensible dada la historia de Bertani, Luria y Lennox. Giuseppe Bertani era miembro del laboratorio de Luria en la Universidad de Indiana cuando formuló los medios LB. Ed Lennox también fue miembro del laboratorio de Luria y trabajó con Bertani en algunos de los primeros experimentos de lisogenia utilizando Shigella. Salvador Luria publicó un artículo en 1955 en el que copiaba la formulación original de Bertani y LB a veces se atribuye incorrectamente a Luria debido a su estatura científica, por lo que también se puede denominar incorrectamente Luria Broth. La formulación original de Bertani era triptona de Bacto al 1.0% (10.0 g / L), extracto de levadura al 0.5% (5.0 g / L), NaCl al 1.0% (10.0 g / L), glucosa al 0.1% (1.0 g / L) pH ajustado a 7.0 con NaOH 1 N. Se añadió glucosa después de esterilizar en autoclave. Con el tiempo, la adición de glucosa ha desaparecido de todas las formulaciones de LB. El nombre Miller proviene de la formulación del libro. Experimentos en biología molecular de Jeffery Miller, publicado en 1972, que no contiene glucosa. La formulación original y más común de LB, Miller, contiene 1.0% de NaCl. En 1955, Ed Lennox estaba estudiando los mecanismos de síntesis de ADN utilizando cepas de E. coli sensible al estrés osmótico desarrolló una formulación de LB que contiene la mitad de la sal de la formulación original, es decir, 0,5% de NaCl. Esta formulación se conoce como LB Lennox. Hoy, LB Lennox se utiliza para el cultivo de E. coli cuando se utilizan antibióticos sensibles a la sal como Blasticidin, Puromycin y Zeocin. Una tercera formulación de LB, que contiene la menor cantidad de sal, se denomina LB Luria. Esta formulación contiene 0,05% de NaCl. LB Luria se utiliza para aislar organismos marinos como Vibrio cholerae.

Mecanismos de crecimiento en LB

Los medios LB se diseñaron originalmente para el crecimiento de bacterias a bajas densidades. Se estima que el crecimiento exponencial, un período de crecimiento de estado estacionario, terminará cuando la DO600 (densidad óptica a 600 nm) está entre 0,6 y 1,0. Se sabe que el crecimiento de E. coli en LB generalmente se detiene cuando el OD600 alcanza aproximadamente 2,0 en condiciones normales de crecimiento, lo que corresponde a aproximadamente 0,6 mg E. coli (peso seco) por mL. En 2007, D'Ari y sus colegas llevaron a cabo un estudio exhaustivo de las características de crecimiento en LB, mirando específicamente a la fisiología de E. coli K-12, una de las cepas más comúnmente utilizadas en biología molecular en la actualidad. Demostraron que las células K-12 cultivadas en el LB Miller con una DO final600 de 0,6 a 1,0 no siempre están en el mismo estado fisiológico. D’Ari y sus colaboradores confirmaron observaciones anteriores del crecimiento diauxico (crecimiento en dos fases) en LB y notaron que el crecimiento exponencial se detuvo en

sobredosis600 0.3, mucho antes de lo que comúnmente se piensa. Se sabe que E. coli Se sabe que tienen un crecimiento deficiente cuando el pH excede 9,0, y no es raro que los medios LB cambien a un pH cercano a 9,0. Sin embargo, cuando D'Ari y sus colaboradores ajustaron el pH de LB, no hubo ningún efecto en la curva de crecimiento, mientras que, cuando se agregó glucosa al medio, los cultivos pudieron crecer hasta una DO.600 6.49. Esto sugiere que el crecimiento de E. coli en LB tiene limitación de carbono. Como se señaló, la formulación original de LB de Bertani contenía 0,1% de glucosa. Esta investigación demuestra que, si bien LB es un buen medio para el crecimiento de rutina, no debe usarse para estudios fisiológicos donde se requiere reproducibilidad y un período prolongado de crecimiento exponencial.

LB y selección

Existe una variedad de aditivos que se pueden agregar al medio LB para la identificación o selección de una población de organismos. Los antibióticos a menudo se agregan al medio LB para seleccionar células que han sido diseñadas para tener resistencia a uno o más antibióticos. Se puede agregar X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido) o Bluo-Gal (indolil-β-galactósido halogenado) al medio LB para el cribado azul-blanco para la inserción de la secuencia en un sitio de clonación múltiple (MCS) en un plásmido que contiene el fragmento α del gen de la β-galactosidasa. Para inducir la expresión de genes controlados por el promotor lac, se añade al medio el análogo de lactosa no metabolizable IPTG (isopropil-beta-D-tiogalactopiranósido). En las bacterias en las que no hay una secuencia insertada en el plásmido, las colonias de MCS serán azules, ya que X-Gal o Bluo-Gal serán escindidas por la β-galactosidasa para formar 5-bromo-4-cloro-indoxilo. Para los plásmidos donde hay una inserción, no habrá una β-galactosidasa funcional y las colonias permanecerán blancas.


La interrupción del mutualismo por una hormiga invasora reduce la fijación de carbono para una planta de hormiga fundamental de África Oriental

Las hormigas invasoras dan forma a conjuntos e interacciones de especies nativas, pero su efecto sobre los procesos ecológicos fundamentales es poco conocido. En África Oriental, Pheidole megacephala Las hormigas han invadido rodales monodominantes del hormiguero. Acacia drepanolobium, extirpando a los defensores de las hormigas nativas y haciendo que los árboles sean vulnerables al daño del dosel por parte de los herbívoros vertebrados. Usamos experimentos y observaciones para cuantificar los efectos directos e interactivos de las hormigas invasoras y los grandes herbívoros en A. drepanolobium fotosíntesis durante un período de 2 años. Los árboles que habían sido invadidos durante ≥ 5 años exhibieron un 69% menos de fotosíntesis de árboles completos durante las temporadas clave de crecimiento, como resultado de la interacción entre hormigas invasoras y herbívoros vertebrados que causaron disminuciones de la fotosíntesis a nivel de hoja y dosel. También inspeccionamos árboles poco antes y después de la invasión, y descubrimos que la invasión reciente solo indujo cambios menores en la fisiología de las hojas. Nuestros resultados de árboles individuales probablemente se amplíen, destacando el potencial de las especies invasoras para alterar la fijación de carbono a nivel del ecosistema y otros ciclos biogeoquímicos.


Estos autores contribuyeron igualmente: Fernanda Pinheiro, Omar Warsi.

Afiliaciones

Instituto de Física Biológica, Universidad de Colonia, Colonia, Alemania

Fernanda Pinheiro y Michael Lässig

Departamento de Bioquímica y Microbiología Médicas, Universidad de Uppsala, Uppsala, Suecia

Omar Warsi y amp Dan I. Andersson

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Contribuciones

Todos los autores participaron en la investigación, redacción del borrador original, revisión y edición del manuscrito final.

Autores correspondientes


Agradecimientos

Agradecemos a J.R. Luque-Ortega por su ayuda en los experimentos de captación de oxígeno. Agradecemos a M. Abrahams, M. Mo y S. Burning por la lectura crítica del manuscrito. JN agradece a T. Conrad por su ayuda durante la estadía en San Diego y a E. Díaz y M.A. Prieto por su valiosa ayuda y sugerencia durante la reconstrucción metabólica. JN ha recibido una beca predoctoral I3P del Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) y la estancia de JN en San Diego fue apoyada por una beca I3P a corto plazo.



Comentarios:

  1. Darcio

    Creo que está equivocado. Estoy seguro. soy capaz de demostrarlo.

  2. Fitzjames

    En él algo es. Gracias por la información, ahora no admitiré tal error.

  3. Ackerley

    ¡Sólo! ¡Él!

  4. Derham

    Yo debería

  5. Baucis

    Tema incomparable ....

  6. Lennie

    muy extraño

  7. Akiramar

    Se quita (tiene tema mixto)



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