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Topología del ADN de dos cromosomas circulares

Topología del ADN de dos cromosomas circulares


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Estoy leyendo Topología de ADN: Fundamentos de donde cito:

Los aspectos topológicos de la estructura del ADN surgen principalmente del hecho de que las dos cadenas de ADN se entrelazan repetidamente. Desenredar estas dos hebras, que ocurre en todos los procesos genéticos principales, puede resultar bastante difícil. En el caso más simple de un ADN lineal en solución, es posible desenredarlo debido a la rotación libre de los extremos del ADN. Sin embargo, para todos los ADN naturales, la rotación del extremo libre está restringida o prohibida por completo. En consecuencia, desenredar las dos cadenas de ADN se vuelve topológicamente imposible.

Y de Wikipedia:

Sin embargo, un cromosoma circular puede generar otros desafíos para las células. Después de la replicación, los dos cromosomas circulares de la progenie a veces pueden permanecer entrelazados o enredados., y deben resolverse para que cada célula herede una copia completa del cromosoma durante la división celular.

¿Existe alguna evidencia que demuestre la idea representada en la figura?


Sí, hay abundancia de evidencia. Creo que la siguiente micrografía electrónica es bastante convincente.

Esta imagen es de una revisión:

Gil-Ramirez G, Leigh DA, Stephens AJ. 2015. Catenanes: Cincuenta años de vínculos moleculares. Angew Chem Int Ed. 54: 6110-6150.

Se adaptó del primer artículo para observar moléculas de ADN catenados de origen natural, que se aislaron de las mitocondrias de HeLa:

Hudson B, Vinograd J. 1967. Moléculas de ADN circulares catenados en mitocondrias de células HeLa. Nature 216: 647-652.

Puede ver esta respuesta para obtener una explicación de por qué se forman los catenanos durante la replicación:

¿Cómo se forman los catenanos cuando el ADN se replica?


Superenrollamiento de ADN

Abstracto

El superenrollamiento de ADN describe una estructura de ADN de orden superior. La estructura de doble hélice del ADN implica el entrelazamiento de dos hebras complementarias alrededor de la otra y alrededor de un eje helicoidal común. El retorcimiento de este eje helicoidal en el espacio define la estructura superhelical del ADN (estructura terciaria del ADN). Para un ADN circular o un ADN lineal con sus extremos anclados para crear un bucle, existe un acoplamiento topológico estrecho entre la estructura superhelical del ADN y la estructura de doble hélice (estructura secundaria del ADN). Por lo tanto, la superhelicidad del ADN puede influir en el enrollamiento / desenrollado del ADN, lo que afecta las funciones biológicas del ADN. En la naturaleza, existe una clase ubicua de enzimas, ADN topoisomerasas, que pueden mediar en la transformación topológica en moléculas de ADN.


La importancia del superenrollamiento del ADN

El superenrollamiento del ADN es importante para el empaquetamiento del ADN dentro de todas las células. Debido a que la longitud del ADN puede ser miles de veces mayor que la de una célula, empaquetar este material genético en la célula o núcleo (en eucariotas) es una tarea difícil. El superenrollamiento de ADN reduce el espacio y permite empaquetar mucho más ADN. En los procariotas, predominan las superenrollamientos plectonémicos, debido al cromosoma circular y a una cantidad relativamente pequeña de material genético. En eucariotas, el superenrollamiento del ADN existe en muchos niveles de los superenrollamientos plelectonémicos y solenoidales, siendo el superenrollamiento solenoidal el más eficaz para compactar el ADN. El superenrollamiento solenoidal se logra con histonas para formar una fibra de 10 nm. Esta fibra se enrolla aún más en una fibra de 30 nm y se enrolla sobre sí misma muchas veces más.

El empaquetamiento del ADN aumenta en gran medida durante los eventos de división nuclear como la mitosis o la meiosis, donde el ADN debe compactarse y segregarse a las células hijas. Las condensinas y cohesinas son el mantenimiento estructural de las proteínas cromosómicas (SMC) que ayudan en la condensación de las cromátidas hermanas y el enlace del centrómero en las cromátidas hermanas. Estas proteínas SMC inducen superenrollamientos positivos.

El superenrollamiento también es necesario para la síntesis de ADN y ARN. Debido a que el ADN debe desenrollarse para la acción de la ADN y la ARN polimerasa, se producirán superenrollamientos. La región delante del complejo de polimerasa se desenrollará y esta tensión se compensará con superenrollamientos positivos delante del complejo. Detrás del complejo, el ADN se rebobina y habrá superenrollamientos negativos compensatorios. Es importante señalar que las topoisomerasas como la ADN girasa (topoisomerasa tipo II) desempeñan un papel en el alivio de parte del estrés durante la síntesis de ADN y ARN.


Contenido

En un segmento de doble hélice "relajado" de B-DNA, las dos hebras giran alrededor del eje helicoidal una vez cada 10,4-10,5 pares de bases de secuencia. Sumar o restar giros, como pueden hacer algunas enzimas, impone tensión. Si un segmento de ADN sometido a tensión de torsión se cerrara en un círculo uniendo sus dos extremos y luego se le permitiera moverse libremente, el ADN circular se contorsionaría en una nueva forma, como una simple figura de ocho. Tal contorsión es una superenrollamiento. La forma nominal "superenrollamiento" se utiliza a menudo en el contexto de la topología del ADN.

El ADN positivamente superenrollado (sobreenrollado) se genera transitoriamente durante la replicación y transcripción del ADN y, si no se relaja rápidamente, inhibe (regula) estos procesos. La simple figura de ocho es la superenrollamiento más simple, y es la forma que asume un ADN circular para acomodar demasiados o muy pocos giros helicoidales. Los dos lóbulos de la figura ocho aparecerán girados en sentido horario o antihorario uno con respecto al otro, dependiendo de si la hélice está enrollada o no. Por cada giro helicoidal adicional que se acomode, los lóbulos mostrarán una rotación más alrededor de su eje. Como regla general, el ADN de la mayoría de los organismos está superenrollado negativamente. [2]

Las contorsiones locales de un ADN circular, como la rotación de los lóbulos en forma de ocho anteriores, se denominan retorcerse. El ejemplo anterior ilustra que retorcerse y retorcerse son interconvertibles. El superenrollamiento se puede representar matemáticamente por la suma de torsión y retorcimiento. El giro es el número de vueltas helicoidales en el ADN y el retorcimiento es el número de veces que la doble hélice se cruza sobre sí misma (estas son las superenrollamientos). Los giros helicoidales adicionales son positivos y conducen a un superenrollamiento positivo, mientras que el giro sustractivo provoca un superenrollamiento negativo. Muchas enzimas topoisomerasas detectan el superenrollamiento y lo generan o lo disipan a medida que cambian la topología del ADN.

En parte porque los cromosomas pueden ser muy grandes, los segmentos del medio pueden actuar como si sus extremos estuvieran anclados. Como resultado, es posible que no puedan distribuir el exceso de torsión al resto del cromosoma o absorber la torsión para recuperarse del subbobinado; los segmentos pueden volverse superenrollado, en otras palabras. En respuesta al superenrollamiento, asumirán una cantidad de retorcimiento, como si sus extremos estuvieran unidos.

El ADN superenrollado forma dos estructuras a plectoneme o un toroide, O una combinación de ambos. Una molécula de ADN superenrollada negativamente producirá una hélice izquierda de un comienzo, el toroide, o una hélice derecha de dos inicios con bucles terminales, el plectonema. Los plectonemas suelen ser más comunes en la naturaleza, y esta es la forma que adoptarán la mayoría de los plásmidos bacterianos. Para moléculas más grandes, es común que se formen estructuras híbridas: un bucle en un toroide puede extenderse en un plectonema. Si todos los bucles de un toroide se extienden, se convierte en un punto de ramificación en la estructura plectonémica. El superenrollamiento del ADN es importante para el empaquetamiento del ADN dentro de todas las células y parece que también juega un papel en la expresión génica. [3] [4]

Sobre la base de las propiedades de las moléculas intercaladas, es decir, la fluorescencia al unirse al ADN y el desenrollado de los pares de bases del ADN, recientemente se ha introducido una técnica de una sola molécula para visualizar directamente plectonemas individuales a lo largo del ADN superenrollado [5], lo que permitiría estudiar aún más las interacciones. de proteínas de procesamiento de ADN con ADN superenrollado. En ese estudio, Sytox Orange (un tinte intercalante), se ha utilizado para inducir el superenrollamiento en las moléculas de ADN atadas a la superficie.

Usando este ensayo, se encontró que la secuencia de ADN codifica la posición de superenrollamientos plectonémicos. [6] Además, se encontró que las superenrollamientos de ADN se enriquecían en los sitios de inicio de la transcripción en procariotas.

Empaquetado del genoma Editar

El superenrollamiento del ADN es importante para el empaquetamiento del ADN dentro de todas las células. Debido a que la longitud del ADN puede ser miles de veces mayor que la de una célula, empaquetar este material genético en la célula o núcleo (en eucariotas) es una tarea difícil. El superenrollamiento del ADN reduce el espacio y permite empaquetar el ADN. En los procariotas, predominan las superenrollamientos plectonémicos, debido al cromosoma circular y a una cantidad relativamente pequeña de material genético. En eucariotas, el superenrollamiento del ADN existe en muchos niveles de los superenrollamientos plelectonémicos y solenoidales, y el superenrollamiento solenoidal resulta más eficaz para compactar el ADN. El superenrollamiento solenoidal se logra con histonas para formar una fibra de 10 nm. Esta fibra se enrolla aún más en una fibra de 30 nm y se enrolla sobre sí misma muchas veces más.

El empaquetamiento de ADN aumenta considerablemente durante la mitosis cuando los ADN hermanos duplicados se segregan en células hijas. Se ha demostrado que la condensina, un gran complejo de proteínas que desempeña un papel central en el ensamblaje del cromosoma mitótico, induce superenrollamientos positivos de una manera dependiente de la hidrólisis de ATP. in vitro. [7] [8] El superenrollamiento también podría desempeñar un papel importante durante la interfase en la formación y mantenimiento de dominios de asociación topológica (TAD). [9]

El superenrollamiento también es necesario para la síntesis de ADN / ARN. Debido a que el ADN debe desenrollarse para la acción de la ADN / ARN polimerasa, se producirán superenrollamientos. La región delante del complejo de polimerasa se desenrollará y esta tensión se compensará con superenrollamientos positivos delante del complejo. Detrás del complejo, el ADN se rebobina y habrá compensatorio superenrollamientos negativos. Las topoisomerasas como la ADN girasa (topoisomerasa de tipo II) desempeñan un papel en el alivio de parte del estrés durante la síntesis de ADN / ARN. [10]

Expresión genética Editar

Las proteínas especializadas pueden descomprimir pequeños segmentos de la molécula de ADN cuando se replica o transcribe en ARN. Pero el trabajo publicado en 2015 ilustra cómo el ADN se abre por sí solo. [3] [4]

Simplemente torcer el ADN puede exponer las bases internas al exterior, sin la ayuda de ninguna proteína. Además, la transcripción en sí misma contorsiona el ADN de las células humanas vivas, lo que aprieta algunas partes de la bobina y las afloja en otras. Ese estrés desencadena cambios en la forma, sobre todo abriendo la hélice para ser leído. Desafortunadamente, estas interacciones son muy difíciles de estudiar porque las moléculas biológicas se transforman con mucha facilidad. En 2008 se observó que la transcripción retuerce el ADN, dejando un rastro de ADN subenrollado (o superenrollado negativamente) a su paso. Además, descubrieron que la secuencia de ADN en sí afecta la forma en que la molécula responde al superenrollamiento. [3] [4] Por ejemplo, los investigadores identificaron una secuencia específica de ADN que regula la velocidad de transcripción a medida que la cantidad de superenrollamiento aumenta y disminuye, ralentiza o acelera el ritmo al que la maquinaria molecular lee el ADN. [3] Se plantea la hipótesis de que estos cambios estructurales podrían desencadenar estrés en otros lugares a lo largo de su longitud, lo que a su vez podría proporcionar puntos desencadenantes para la replicación o la expresión génica. [3] [4] Esto implica que es un proceso muy dinámico en el que tanto el ADN como las proteínas influyen en la forma en que el otro actúa y reacciona. [3]

En la naturaleza, el ADN circular siempre se aísla como una hélice sobre una hélice de orden superior, conocida como superhélice. En las discusiones sobre este tema, el giro de Watson-Crick se conoce como un devanado "secundario" y las superhélices como un devanado "terciario". El dibujo de la derecha indica una doble hélice Watson-Crick "relajada" o "circular abierta" y, junto a ella, una superhélice derecha. La estructura "relajada" de la izquierda no se encuentra a menos que el cromosoma tenga una muesca. La superhélice es la forma que normalmente se encuentra en la naturaleza.

A los efectos de los cálculos matemáticos, una superhélice de la mano derecha se define como que tiene un número "negativo" de vueltas de superhélice, y una superhélice de la mano izquierda se define como que tiene un número "positivo" de vueltas de superhélice. En el dibujo (mostrado a la derecha), tanto el secundario (es decir., "Watson – Crick") sinuoso y el terciario (es decir., "superhelical") son diestros, por lo tanto, los superwists son negativos (–3 en este ejemplo).

Se presume que la superhelicidad es el resultado del subbobinado, lo que significa que hay una deficiencia en el número de giros secundarios de Watson-Crick. Tal cromosoma se tensará, al igual que un resorte metálico macroscópico se tensará cuando se sobreenrolla o se desenrolla. En el ADN que así se tensa, aparecerán supergiros.

El superenrollamiento del ADN se puede describir numéricamente mediante cambios en el número de enlace Lk. El número de enlace es la propiedad más descriptiva del ADN superenrollado. Lko, el número de vueltas en el plásmido / molécula de ADN relajado (tipo B) se determina dividiendo los pares de bases totales de la molécula por el pb relajado / vuelta que, según la referencia, es 10,4 [11] 10,5 [12] [13 ] 10.6. [14]

Lk es el número de cruces que hace una hebra con la otra, a menudo visualizado como el número de giros de Watson-Crick que se encuentran en un cromosoma circular en una proyección plana (generalmente imaginaria). Este número está "bloqueado" físicamente en el momento del cierre covalente del cromosoma y no se puede alterar sin que se rompa la hebra.

La topología del ADN se describe mediante la siguiente ecuación en la que el número de enlace es equivalente a la suma de Tw, que es el número de giros o vueltas de la doble hélice, y Wr, que es el número de bobinas o "retorcimientos". Si hay una molécula de ADN cerrada, la suma de Tw y Wr, o el número de enlace, no cambia. Sin embargo, puede haber cambios complementarios en Tw y Wr sin cambiar su suma:

Tw, llamado "torsión", es el número de torsiones de Watson-Crick en el cromosoma cuando no está obligado a permanecer en un plano. Ya hemos visto que el ADN nativo suele ser superhelical. Si uno gira alrededor del cromosoma superhelly retorcido, contando los giros secundarios de Watson-Crick, ese número será diferente del número contado cuando el cromosoma está obligado a permanecer plano. En general, se espera que el número de torsiones secundarias en el cromosoma nativo superretorcido sea el número de bobinado "normal" de Watson-Crick, es decir, una torsión helicoidal única de 10 pares de bases por cada 34 Å de longitud de ADN.

Wr, llamado "retorcerse", es el número de giros superhelical. Dado que el ADN circular biológico suele estar sub-enrollado, Lk generalmente será menos que Tw, Lo que significa que Wr normalmente será negativo.

Si el ADN está subbobinado, estará bajo tensión, exactamente como se tensa un resorte de metal cuando se desenrolla con fuerza, y que la aparición de supertwists permitirá que el cromosoma alivie su tensión asumiendo supertwists negativas, que corrigen el subbobinado secundario de acuerdo con la ecuación de topología anterior.

La ecuación de topología muestra que existe una relación de uno a uno entre los cambios en Tw y Wr. Por ejemplo, si se quita un giro secundario "Watson-Crick", entonces se debe haber quitado un supertwist derecho simultáneamente (o, si el cromosoma está relajado, sin supertwists, se debe agregar un supertwist zurdo).

El cambio en el número de enlace, ΔLk, es el número real de vueltas en el plásmido / molécula, Lk, menos el número de vueltas en el plásmido / molécula relajado Lko:

Una expresión estándar independiente del tamaño de la molécula es la "diferencia de enlace específica" o "densidad superhelical" indicada σ, que representa el número de vueltas añadidas o eliminadas en relación con el número total de vueltas en la molécula / plásmido relajado, lo que indica el nivel de superenrollamiento.

La energía libre de Gibbs asociada con el bobinado viene dada por la siguiente ecuación [15]

La diferencia en la energía libre de Gibbs entre el ADN circular superenrollado y el ADN circular desenrollado con norte & gt 2000 bp se aproxima por:

Dado que el número de enlace L de ADN superenrollado es el número de veces que las dos hebras se entrelazan (y ambas hebras permanecen covalentemente intactas), L no puede cambiar. El estado de referencia (o parámetro) L0 de un dúplex de ADN circular es su estado relajado. En este estado, se retuerce W = 0. Dado que L = T + W, en un estado relajado T = L. Por lo tanto, si tenemos un dúplex de ADN circular relajado de 400 pb, L

10 pb por turno en B-DNA). Luego T

  • Superenrollamiento positivo: T = 0, W = 0, luego L = 0 T = +3, W = 0, luego L = +3 T = +2, W = +1, luego L = +3
  • Superenrollamiento negativo: T = 0, W = 0, luego L = 0 T = -3, W = 0, luego L = -3 T = -2, W = -1, luego L = -3

Los superenrollamientos negativos favorecen el desenrollamiento local del ADN, lo que permite procesos como la transcripción, la replicación del ADN y la recombinación. También se cree que el superenrollamiento negativo favorece la transición entre el ADN-B y el ADN-Z y modera las interacciones de las proteínas de unión al ADN implicadas en la regulación génica. [dieciséis]

Se han propuesto algunos modelos estocásticos para tener en cuenta los efectos de la acumulación de superenrollamiento positivo (PSB) en la dinámica de expresión génica (por ejemplo, en la expresión génica bacteriana), difiriendo, por ejemplo, en el nivel de detalle. En general, el detalle aumenta al agregar procesos afectados por y que afectan al superenrollamiento. A medida que se produce esta adición, aumenta la complejidad del modelo.

Por ejemplo, en [17] se proponen dos modelos de diferente complejidad. En el más detallado, los eventos se modelaron a nivel de nucleótidos, mientras que en el otro los eventos se modelaron solo en la región promotora y, por lo tanto, requirieron muchos menos eventos para ser contabilizados.

Se pueden encontrar ejemplos de modelos estocásticos que se centran en los efectos de la PSB en la actividad de un promotor en: [18] [19]. En general, tales modelos incluyen un promotor, Pro, que es la región del ADN que controla la transcripción y, por tanto, cuya actividad / bloqueo se ve afectada por PSB. También se incluyen las moléculas de ARN (producto de la transcripción), las ARN polimerasas (RNAP) que controlan la transcripción y las Girasas (G) que regulan la PSB. Finalmente, es necesario que exista un medio para cuantificar el PSB en el ADN (es decir, el promotor) en cualquier momento dado. Esto se puede hacer al tener algún componente en el sistema que se produce con el tiempo (por ejemplo, durante los eventos de transcripción) para representar superenrollamientos positivos, y que se elimina mediante la acción de las Girasas. La cantidad de este componente se puede configurar para afectar la tasa de transcripción.

Las propiedades topológicas del ADN circular son complejas. En los textos estándar, estas propiedades se explican invariablemente en términos de un modelo helicoidal para el ADN, pero en 2008 se observó que cada topoisómero, negativo o positivo, adopta una distribución única y sorprendentemente amplia de conformaciones tridimensionales. [4]

Cuando el coeficiente de sedimentación, s, de ADN circular se determina en un amplio rango de pH, se ven las siguientes curvas. Aquí se muestran tres curvas, que representan tres especies de ADN. De arriba a abajo son: "Formulario IV" (verde), "Formulario I" (azul) y "Formulario II" (rojo).

La "Forma I" (curva azul) es la nomenclatura tradicional utilizada para la forma nativa del ADN circular dúplex, recuperado de virus y plásmidos intracelulares. La forma I está covalentemente cerrada y, por lo tanto, cualquier devanado pllectonémico que pueda estar presente está bloqueado. Si se introducen una o más muescas en la forma I, es posible la rotación libre de una hebra con respecto a la otra, y la forma II (curva roja) es visto.

La Forma IV (curva verde) es el producto de la desnaturalización alcalina de la Forma I. Su estructura es desconocida, excepto que es persistentemente dúplex y extremadamente densa.

Entre pH 7 y pH 11,5, el coeficiente de sedimentación s, para la Forma I, es constante. Luego se sumerge y, a un pH justo por debajo de 12, alcanza un mínimo. Con más aumentos en el pH, s luego vuelve a su valor anterior. Sin embargo, no se detiene allí, sino que continúa aumentando sin cesar. Por pH 13, el valor de s ha aumentado a casi 50, dos o tres veces su valor a pH 7, lo que indica una estructura extremadamente compacta.

Si luego se baja el pH, el s el valor no se restaura. En cambio, uno ve la curva verde superior. El ADN, ahora en el estado conocido como Forma IV, permanece extremadamente denso, incluso si el pH se restaura al rango fisiológico original. Como se dijo anteriormente, la estructura de la Forma IV es casi completamente desconocida, y actualmente no existe una explicación aceptada para su extraordinaria densidad. Casi todo lo que se sabe sobre la estructura terciaria es que es dúplex, pero no tiene enlaces de hidrógeno entre las bases.

Se considera que estos comportamientos de las Formas I y IV se deben a las propiedades peculiares del ADN dúplex que se ha cerrado covalentemente en un círculo de doble hebra. Si la integridad covalente se interrumpe incluso por una sola muesca en una de las hebras, todo ese comportamiento topológico cesa y se ve la curva de Forma II inferior (Δ). Para la Forma II, las alteraciones en el pH tienen muy poco efecto sobre s. Sus propiedades físicas son, en general, idénticas a las del ADN lineal. A pH 13, las hebras de la Forma II simplemente se separan, tal como lo hacen las hebras de ADN lineal. Las hebras individuales separadas tienen ligeras diferencias s valores, pero no muestran cambios significativos en s con más aumentos en el pH.

Una explicación completa de estos datos está más allá del alcance de este artículo. En resumen, las alteraciones en s se producen debido a cambios en la superhelicidad del ADN circular. Estos cambios en la superhelicidad se ilustran esquemáticamente mediante cuatro pequeños dibujos que se han superpuesto estratégicamente a la figura anterior.

Brevemente, las alteraciones de s que se ven en la curva de titulación del pH anterior se cree que se deben a cambios en el devanado superhelical del ADN en condiciones de aumento del pH. Hasta un pH de 11,5, el supuesto "subbobinado" produce un supertwist hacia la derecha ("negativo"). Pero a medida que aumenta el pH y la estructura helicoidal secundaria comienza a desnaturalizarse y desenrollarse, el cromosoma (si podemos hablar antropomórficamente) ya no "quiere" tener el devanado Watson-Crick completo, sino que "quiere", cada vez más, ser "subwound". Dado que hay cada vez menos tensión que aliviar mediante el devanado superhelical, las superhélices desaparecen progresivamente a medida que aumenta el pH. A un pH justo por debajo de 12, todo incentivo para la superhelicidad ha expirado y el cromosoma aparecerá como un círculo abierto y relajado.


Los pasos bioquímicos mediante los cuales las topoisomerasas bacterianas alteran la topología del ADN son bien conocidos. Sin embargo, ha sido una tarea más complicada establecer roles fisiológicos y sitios de acción de las diferentes topoisomerasas dentro del contexto del ciclo celular bacteriano. Esta dificultad se puede atribuir en parte a la redundancia entre las actividades de las diferentes enzimas. En esta microrevisión, nos centraremos en los avances recientes en la comprensión de la estructura topológica del cromosoma, el análisis del mecanismo de la topoisomerasa en ensayos de una sola molécula y los datos recientes sobre la regulación e integración de la actividad de la topoisomerasa dentro del ciclo celular que han aportado una nueva perspectiva. a la acción de las topoisomerasas en la célula bacteriana.

Enlace topológico entre las dos cadenas de moléculas de ADN, como el cromosoma circular cerrado de Escherichia coli se describe mediante el número de enlace, Lk, una medida cuantitativa del número de veces que las dos hebras parentales se enrollan entre sí. En un sentido simple, este devanado toma dos formas: los devanados de cada hebra alrededor de la otra en la hélice de ADN, que a menudo se denominan giros dúplex y los devanados de la hélice sobre sí misma en giros superhelical. Nuevamente, en el sentido más simple, Lk es la suma del número de giros dúplex y superhélice con una convención de signos para dar cuenta del hecho de que Lk no se puede cambiar en un anillo de ADN cerrado a menos que al menos una de las hebras esté rota. y resellar. La superhelicidad es una poderosa fuerza impulsora termodinámica para muchas reacciones que ocurren en el cromosoma. Esto se debe a que el estado termodinámico preferido de una molécula de ADN circular cerrada es el relajado, en el que no hay superenrollamientos. Por lo tanto, las reacciones que exigen el desenrollado de las hebras de plantilla parentales, como la transición de un complejo cerrado a abierto entre la ARN polimerasa y un promotor o la replicación del ADN, se ven favorecidas en moléculas superenrolladas negativamente, mientras que las reacciones que exigen el rebobinado de las hebras de plantilla, como como regresión del ADN naciente en una horquilla de replicación estancada, se favorecen en moléculas positivamente superenrolladas. Debido a que Lk no puede cambiar en un anillo cerrado, cualquier alteración de la topología del ADN local es absorbida por una alteración compensadora en una parte distal de la molécula. Ahí radican los problemas resueltos por las topoisomerasas.

Hay tres tareas principales para las topoisomerasas en la célula bacteriana: eliminación del exceso de devanados positivos del cromosoma generados como resultado de la replicación del ADN, mantenimiento de la homeostasis topológica del cromosoma y reducción del enlace topológico entre los cromosomas hermanos a exactamente cero durante la partición cromosómica y citocinesis. Replicación del E. coli El cromosoma es bidireccional y cada horquilla de replicación avanza a una velocidad de 700 a 1000 nucleótidos s -1. La eliminación de cada giro dúplex a medida que se desenrolla la plantilla parental genera un enrollamiento positivo compensatorio que puede tomar una de dos formas: un superenrollamiento positivo que se forma en la región no replicada del cromosoma por delante de la bifurcación o un precatenane, un enrollamiento positivo de los dos. Hebras hermanas parcialmente replicadas entre sí detrás de la horquilla. Esta última forma topológica fue sugerida por primera vez por Champoux y Been (1980), quienes señalaron que, a menos que los replisomas mismos formaran una barrera topológica, los devanados positivos deberían poder equilibrarse tanto delante como detrás de las horquillas de replicación. Si no se eliminan al completarse la replicación, los precateanos se convierten en catenanos, es decir, enlaces entre los dos cromosomas hermanos. Replicación del ADN en E. coli genera en algún lugar en la región de 200 enlaces positivos en exceso s -1 que tienen que ser eliminados por las topoisomerasas.

Como si esto no fuera un problema topológico suficiente, la homeostasis topológica se ve acosada por el hecho de que la transcripción también revuelve el paisaje. Como se señaló en el modelo de superenrollamiento de dominios gemelos de Liu y Wang (1987), el movimiento de la ARN polimerasa a través de una plantilla de ADN crea una acción similar a un tornillo. Si el ADN no puede girar, las superenrollamientos positivos se acumularán delante de la ARN polimerasa de transcripción y los superenrollamientos negativos se acumularán detrás. Por lo tanto, para mantener una densidad superhelical global apropiada en el cromosoma, estos superenrollamientos en exceso deben eliminarse.

Finalmente, incluso un enlace topológico residual entre los cromosomas hermanos en el punto de partición cromosómica y citocinesis durante el ciclo celular es catastrófico, lo que resulta en la rotura de los cromosomas y la generación de células anucleadas. Además, todos estos problemas topológicos se complican por el hecho de que el cromosoma en sí está organizado en dominios topológicos con barreras que impiden la libre difusión de superenrollamientos. Por lo tanto, cualquier descripción completa de la función de la topoisomerasa en la célula debe tener en cuenta la probabilidad de que el control espacial y temporal de la acción de la topoisomerasa sea esencial.

¿Podemos ahora proporcionar una evaluación completa de la acción de la topoisomerasa incluso para una de estas tareas? Probablemente no. Hemos aprendido muchas cosas nuevas sobre la acción de la topoisomerasa en la célula durante los últimos años, pero algunos de los nuevos datos provocan una reconsideración del pensamiento anterior. De las cuatro topoisomerasas presentes en E. coli, análisis bioquímico in vitro ha demostrado que la topoisomerasa (Topo) I, Topo III y Topo IV comparten la capacidad de relajar superenrollamientos negativos [(-) sc]. Topo IV y ADN girasa pueden relajar superenrollamientos positivos [(+) sc]. Además, Topo III, Topo IV y girasa pueden desencadenar y desanudar moléculas circulares de ADN (Champoux, 2001). La idea original era que la girasa es la principal responsable de la relajación de (+) sc. Aunque las mediciones bioquímicas estándar realizadas en solución que promedian la acción de todas las moléculas de topoisomerasa en todas las moléculas de sustrato demostraron que las tasas de eliminación de (+) sc catalizadas por girasa y Topo IV eran comparables (≈ 0,2-0,3 eventos de paso de hebras min −1) , la reacción catalizada por girasa fue procesiva, mientras que la reacción catalizada por Topo IV fue distributiva (Hiasa y Marians, 1994). Además, la capacidad única de la girasa para convertir directamente superenrollamientos positivos en negativos (Brown y Cozzarelli, 1979) implicó fuertemente a la girasa como el agente principal en la eliminación de superenrollamientos positivos para lograr la homeostasis topológica. De manera similar, la gran diferencia en la actividad de decantación observada para Topo IV (eventos de pasaje de cinco hebras min -1) en comparación con girasa (0.07 eventos min -1) (Hiasa y Marians, 1996) sugirió un papel único para Topo IV en la eliminación de precateanos. y catenanos. Esta tarea fue apoyada por la demostración en vivo que Topo IV solo eliminó los catenanos entre los anillos de ADN del plásmido y los nudos dentro de un anillo de ADN generado por la acción de una resolvasa específica del sitio (Zechiedrich et al., 1997 Deibler et al., 2001) y que la velocidad de decantación de las moléculas de ADN plasmídico cuando la girasa sola estaba activa era aproximadamente una centésima parte de la que tenía cuando tanto la girasa como el Topo IV estaban activos (Zechiedrich y Cozzarelli, 1995). Esta imagen ahora se ha enturbiado.

Khodursky et al. (2000) midieron la tasa de progresión de la horquilla de replicación en células sincronizadas en las que la girasa sola o la girasa y el Topo IV se inactivaban mediante el tratamiento con diferentes concentraciones de novobiocina. El paso de la horquilla de replicación se puntuó por el aumento en la dosis de cualquier gen en particular, medido por la hibridación del ADN a microarrays que consisten en productos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que representan el 96% de la E. coli marcos de lectura abiertos (ORF). Tomando muestras a lo largo del tiempo después de la liberación del procedimiento de sincronización y correlacionando el aumento en la dosis de genes con el mapa físico del cromosoma, se pudo visualizar la progresión de la horquilla de replicación y determinar la tasa de progresión. Sus resultados sugieren que, en ausencia de girasa, la tasa de progresión de la horquilla de replicación cromosómica se reduce a un tercio del valor inicial, pero la replicación, presumiblemente ahora respaldada por Topo IV, aún puede progresar a largas distancias. La inhibición tanto de girasa como de Topo IV provocó un cese completo de la progresión de la horquilla. Para evaluar si la progresión de la horquilla de replicación soportada por Topo IV resultó de la eliminación de (+) sc o precatenanes, los autores examinaron la influencia de la ausencia de Topo IV y actividad girasa en la acumulación de (+) sc en los ADN plasmídicos intracelulares. La acumulación de (+) sc, presumiblemente como resultado de un desequilibrio en la eliminación de superenrollamientos generados durante la transcripción en los plásmidos, requirió la eliminación de ambas actividades. Debido a que se espera que ni Topo I ni Topo III tengan la capacidad de relajar (+) sc, los autores argumentaron que Topo IV estaba apoyando la progresión de la horquilla de replicación al eliminar (+) sc, no precatenanes.

Estos estudios desafían dos principios previos del manejo intracelular de la topología: que solo la girasa soporta la progresión de la horquilla de replicación y que Topo IV prefiere trabajar con precatenanos. Con respecto a este último punto, estudios previos establecieron que los precateanos surgen durante la replicación de pequeños ADN plásmidos. en vivo y in vitro (Pedro et al., 1998). Considerando que Khodursky et al. (2000) demostraron que Topo IV se une a (+) sc y (-) sc con igual avidez, otros estudios muestran que Topo IV se une cinco veces mejor a los catenanos diestros en comparación con (+) sc (Hiasa y Marians, 1996). También se ha demostrado in vitro que Topo IV, pero no girasa, puede desvincular el ADN precatenado (Enfermera et al., 2003) y que la eliminación de precatenane puede apoyar la progresión de la horquilla (Hiasa y Marians, 1996). Curiosamente, un estudio que examinó la posición de los sitios de escisión de Topo II inducidos por etopósido en el ADN plasmídico que se replica en Xenopus Los extractos de huevo concluyeron que la enzima funcionaba eliminando los precateanos (Lucas et al., 2001). Bioquímicamente, Topo IV es el ancestro bacteriano directo del Topo II eucariota (Peng y Marians, 1995). Al observar los datos de microarrays sobre la progresión de la bifurcación a través del lente de los datos anteriores sobre precatenanes, debemos considerar que quizás los precatenanes no surgen durante la replicación cromosómica. El anclaje de la fábrica de replicación en el centro de la célula podría posiblemente prevenir la conversión de (+) sc en precatenanes por difusión detrás del replisoma. Esta posibilidad se discutirá nuevamente a continuación.

Las nuevas técnicas de una sola molécula para investigar la acción de la topoisomerasa han proporcionado información importante e interesante. En estos experimentos, un ADN largo (≈ 40 kpb) se estira entre un portaobjetos de vidrio y una cuenta magnética que flota sobre el portaobjetos. La cuenta se puede girar mediante un imán. Por lo tanto, cuando se rota una sola molécula de ADN dúplex, se generan (+) o (-) sc para compensar el rebobinado o el sobreenrollamiento del ADN (Strick et al., 2000). Se utiliza un sistema ligeramente diferente para formar trenzas entre dos ADN dúplex (Charvin et al., 2003 Piedra et al., 2003). Aquí, ambas moléculas están unidas a dos perlas, una en una trampa óptica y la otra en una micropipeta. La rotación de la micropipeta genera una trenza similar al entrelazado de dos dúplex de ADN en un catenano. La variación en la topología corresponde a la distancia entre el cordón y el portaobjetos en el primer caso y entre los dos cordones en el último caso, ambos registrados por una cámara de video.

En experimentos de una sola molécula, Crisona et al. (2000) demostraron que Topo IV relajó (+) sc a una tasa de eventos de paso de tres cadenas s −1, 20 veces mayor que la tasa de relajación de (-) sc. Esta preferencia por los cruces zurdos del dúplex en contraposición a los diestros quedó dramáticamente ilustrada por la actividad de Topo IV en los ADN trenzados (Stone et al., 2003). Cuando las trenzas estaban entrelazadas por un número moderado de vínculos, la preferencia era casi absoluta. Solo se desvinculó la trenza para zurdos. La desvinculación de la trenza de la mano derecha requirió que los ADN se entrelazaran ampliamente para que se generaran superenrollamientos compensatorios para la mano izquierda. Charvin hizo observaciones similares et al. (2003). Para explicar el hecho de que se ha demostrado con bastante claridad que Topo IV es activo en sustratos diestros, como los catenanos que surgen durante la replicación del ADN de tipo θ, Crisona et al. (2000) demostraron que, a la densidad de catenanos que se encuentra típicamente durante la replicación de ADN plásmidos pequeños, el ángulo de cruce adoptado por los dúplex catenados será casi aleatorio. Este fenómeno se produce porque, a estas bajas densidades de catenación específica, los cruces son relativamente móviles, el ángulo de intersección de los ADN dúplex podría reflejar el de un cruce de la mano derecha o de la izquierda, las densidades de catenación altas tenderán a ser más altas. restrictivo. Por lo tanto, a pesar de la clara detección quiral exhibida por la enzima, aún podrá desvincular los cruces nominalmente diestros.

El argumento de que Topo IV relaja (+) sc en la célula ha recibido un apoyo significativo de estos análisis de una sola molécula. La preferencia de Topo IV por los cruces a la izquierda le permite estar activo en los superenrollamientos positivos que surgen durante la replicación, pero sin superar los superenrollamientos negativos, preservando así la superhelicidad negativa general del cromosoma como fuerza impulsora del metabolismo del ADN. La tasa de relajación de superenrollamientos positivos determinada es similar a la tasa de desvinculación de las trenzas de ADN (eventos de paso de 2,5 y una hebra s −1 para las trenzas para zurdos y diestros, respectivamente). Estas tasas son consistentes con la tasa de decantación general durante la replicación del plásmido. en vivo (Zechiedrich y Cozzarelli, 1995). Tales tasas sugieren que la acción de aproximadamente 50 moléculas de Topo IV en cada mitad del cromosoma (o dentro de los dominios topológicos donde la replicación está en curso) sería suficiente para apoyar completamente la progresión de la horquilla de replicación.

Mientras que la numerología de este tipo es seductora y parece dar una respuesta satisfactoria, no parece que se hayan resuelto todos los problemas. Evidentemente, hay muchos factores en la célula que pueden modificar la actividad de las enzimas en cuestión. Sin embargo, en base a los análisis de microarrays y de una sola molécula, un modelo razonable es que la eliminación de (+) sc por girasa y Topo IV seguida de la eliminación de algunos catenanos residuales por Topo IV es la ruta tomada por la célula para tratar las variaciones en Lk producidas por replicación. En este modelo, todos los enredos topológicos entre las hermanas se eliminan al final de la replicación y la segregación completa se puede lograr de inmediato. Sin embargo, la imagen de la celda parece más compleja.

Khodursky et al. (2000) encontraron que Topo IV apoyaba la progresión de la horquilla en un tercio de la tasa observada cuando estaban presentes tanto girasa como Topo IV, sin embargo, las tasas derivadas del análisis de una sola molécula y la concentración de Topo IV en la célula (Espeli et al., 2003a) sugieren que debería poder soportar la progresión de la horquilla a la velocidad máxima. Desafortunadamente, no se ha informado de un análisis de girasa de una sola molécula similar, por lo que es difícil evaluar si se pueden establecer tales correspondencias uno a uno. Será importante determinar si la tasa de desvinculación de (+) sc por girasa está en el rango de 4 s −1, como se predice al combinar las observaciones de microarrays y de una sola molécula discutidas anteriormente. Sin embargo, la reducción en la tasa de progresión de la horquilla observada cuando se inactiva la girasa sugiere que la mayoría de las aproximadamente 1000 moléculas de Topo IV presentes en la célula (Espeli et al., 2003a) no tienen libre acceso al ADN.Además, en estos experimentos, a diferencia de cuando tanto la girasa como el Topo IV estaban activos, la progresión de la horquilla soportada por Topo IV cesó después de algún tiempo y la replicación no se completó.

Observaciones realizadas sobre las consecuencias de la inactivación parcial de la actividad girasa. en vivo cuestionar la opinión de que Topo IV está involucrado en el apoyo de la progresión de la horquilla de replicación. Grompone et al. (2003) han demostrado que, en un contexto en el que la actividad de la girasa se reduce ligeramente (una temperatura sensible gyrB mutante se mantiene a la temperatura semi-permisiva), el crecimiento celular depende completamente de la maquinaria de reinicio de replicación (para una revisión del reinicio de replicación, ver Cox et al., 2000). Esta observación sugiere que, cuando la girasa no es completamente funcional, (+) sc se acumula antes de la progresión de la bifurcación y del bloqueo. Si Topo IV es capaz de soportar la progresión de la horquilla a un tercio de la tasa de tipo salvaje al eliminar (+) sc cuando la girasa está totalmente ausente, ¿por qué no puede compensar una ligera reducción en la actividad de la girasa? Grompone et al. (2003) sugieren que la girasa parcialmente inactiva es incapaz de seguir el ritmo de la generación de (+) sc de manera que un exceso de (+) sc detiene la horquilla de replicación, los componentes del replisoma se disocian y el (+) sc son luego se transforman en precatenanes, lo que permite el ensamblaje posterior de un nuevo replisoma por parte de la maquinaria de reinicio y la reanudación de la progresión de la horquilla de replicación. Estas observaciones sugieren que Topo IV no compensa la ausencia o el debilitamiento de la girasa durante la progresión de la horquilla de replicación al eliminar (+) sc o precatenanes. Esta interpretación implica que los precateanos no son una barrera para la replicación y que el Topo IV presente en la célula no es libre de interactuar con el ADN en todo momento.

El apoyo a la restricción de la actividad de Topo IV proviene de estudios de este laboratorio que sugieren una regulación espacial y temporal de la actividad de Topo IV (Espeli et al., 2003a). Se midió la muerte celular inducida por quinolonas, ADN girasa o mediada por Topo IV como una función del ciclo celular para determinar cuándo se manifestaba la actividad girasa y Topo IV. Se usó un par isogénico de cepas en las que la subunidad GyrA de la ADN girasa era sensible o resistente a la quinolona norfloxacina y también tenía un efecto sensible a la temperatura. dnaC mutación que permitió la sincronización del crecimiento celular mediante un procedimiento de cambio de temperatura triple. La formación de roturas de doble hebra inducidas por quinolonas se correlaciona con la citotoxicidad de estos fármacos y se ha demostrado que ocurre cuando la horquilla de replicación encuentra el complejo topoisomerasa-quinolona-ADN congelado (Hiasa et al., 1996 Hiasa y Shea, 2000). Cuando la girasa era sensible a la norfloxacina, la destrucción de las células coincidía con el inicio de la replicación, de acuerdo con el posicionamiento aleatorio de la girasa en el ADN. Por otro lado, cuando la girasa era resistente a la norfloxacina, la muerte celular se produjo solo al final del ciclo celular, lo que implica que Topo IV tenía restringido el acceso al ADN hasta el final del ciclo de replicación. Esta interpretación fue apoyada por el uso de TUNEL para etiquetar todas las roturas de doble hebra inducidas por SDS mediadas por quinolonas en el nucleoide a lo largo del ciclo celular. Esta técnica debe medir la residencia de cualquier girasa o molécula de Topo IV en el ADN. Los resultados estaban completamente de acuerdo con los experimentos de destrucción de células. Esta regulación de la actividad de Topo IV parece estar relacionada con la localización específica de sus subunidades, ParE y ParC, en la célula. En la mayoría de las células, ParC se localizó en la fábrica de replicación de una manera que dependía de las subunidades τ y γ de la replicasa celular. Sorprendentemente, la localización de ParE no fue la misma. ParE formó focos en los espacios libres de ADN de la célula, principalmente en las proximidades del tabique en formación. Hemos propuesto que la regulación temporal de la actividad del Topo IV es reforzada por una regulación espacial que mantiene las dos subunidades separadas durante la mayor parte del ciclo celular y les permite asociarse en el centro de la célula cuando la decantación es absolutamente necesaria al final de la replicación. . De acuerdo con este modelo es el hallazgo de que una mutación en dnaX (que codifican τ y γ) que no afecta a la replicación, altera la decantación del cromosoma y hace que ParC se deslocalice.

Otra posibilidad interesante es que los componentes del anillo septal son importantes tanto para la localización subcelular como para la actividad de Topo IV. Hemos demostrado una interacción entre ParC y el dominio C-terminal de FtsK (Espeli et al., 2003b). FtsK es una proteína bifuncional compuesta de tres dominios (Liu et al., 1998). El dominio transmembrana N-terminal es necesario para la viabilidad celular y se presume que está involucrado en el cierre del anillo septal (Draper et al., 1998). La parte C-terminal de FtsK es citoplásmica y es necesaria para la resolución catalizada por XerCD de dímeros cromosómicos en dif (Steiner et al., 1999). Esta porción de FtsK se compone de dos dominios: un dominio rico en prolina y glutamina de función desconocida y un dominio AAA de 500 aminoácidos, C-terminal (dominio 3, FtsKC) que es necesario para la segregación cromosómica normal (Liu et al., 1998), en parte debido a su efecto sobre la recombinación de XerCD en dif (Recchia et al., 1999). FtsKC es una ATPasa hexamérica dependiente de ADN que puede alterar la topología del ADN y afectar la dirección de la resolución catalizada por XerCD in vitro (Aussel et al., 2002). Decadenación catalizada por Topo IV de dímeros de ADN con enlaces múltiples in vitro es estimulado de dos a tres veces por FtsKC, mientras que la reacción catalizada por girasa no lo es (Espeli et al., 2003b). Por lo tanto, FtsK puede capturar Topo IV en el tabique y participar en la decantación cromosómica. Esta posibilidad está respaldada por la reciente demostración de que, en presencia de FtsKC, XerCD puede descatenar los ADN plasmídicos que llevan un dif sitio (Ip et al., 2003). Esta interesante observación plantea las interesantes posibilidades de que FtsK participe directamente en la decantación cromosómica, posiblemente con la combinación XerCD-FtsK actuando como una actividad de decantación a prueba de fallos, y que puede haber un locus específico en la célula en el que ocurre toda la decantación cromosómica.

¿Cómo se pueden conciliar las diversas observaciones que indican, por un lado, que Topo IV es libre de acceder al cromosoma y participa en el apoyo a la progresión de la horquilla de replicación e indicar, por otro lado, que el acceso de Topo IV al ADN está restringido al final de la célula? ciclo cuando probablemente actúa solo sobre catenanos? Quizás la clave para hacerlo radica en el hecho de que, en las condiciones utilizadas por Khodursky et al. (2000) para sus mediciones de la progresión de la horquilla de replicación apoyada por Topo IV, la girasa se inactivó, lo que resultó en una relajación global del cromosoma (es decir, el superenrollamiento negativo se perdería rápidamente). Observaciones recientes sugieren que la dinámica cromosómica adecuada requiere un superenrollamiento negativo. MukB es una proteína similar a SMC que se cree que participa en el empaquetado de los cromosomas hermanos poco después de que salen de la fábrica de replicación (Ohsumi et al., 2001). Mutaciones en mukB son sensibles a la temperatura, muestran defectos de segregación cromosómica y producen células anucleadas a la temperatura no permisiva (Niki et al., 1991). Supresión de la mukB Los fenotipos se logran inactivando Topo I (Sawitzke y Austin, 2000). La supresión resulta de un aumento en el superenrollamiento negativo debido a la inactivación parcial de la girasa en mukB topA mutantes dobles restaura el mukB fenotipos. Por lo tanto, parecería que el sondeo de la girasa y la función del Topo IV inactivando la girasa tiene el precio de perturbar la dinámica cromosómica normal. Por lo tanto, se debe considerar la posibilidad de que la regulación específica de la localización del Topo IV se pierda en estas condiciones. Además, el presunto entrelazamiento masivo de los cromosomas hermanos que sigue a la inactivación de la girasa también puede explicar por qué la supuesta progresión de la horquilla de replicación apoyada por Topo IV se agotó en los experimentos de microarrays de Khodursky. et al. (2000). Grompone et al. (2003) no inactivó la girasa por completo, por lo que es posible que, en sus condiciones, hubiera suficiente superenrollamiento negativo global para mantener la dinámica cromosómica adecuada.

Comprender la dinámica de los cromosomas bacterianos es un nuevo esfuerzo. Observaciones recientes plantean la posibilidad de que el cromosoma pueda verse afectado por fuerzas que inducen estrés físico en el ADN. SetB es una proteína de membrana integral que identificamos en una pantalla de supresores de alta copia de los fenotipos sensibles a la temperatura y de partición de la parC1215 alelo (Espeli et al., 2003c). La inactivación de esta proteína provoca un retraso en la segregación cromosómica, mientras que su sobreproducción induce el estiramiento y la desintegración de los nucleoides. SetB se localiza en la celda con un patrón helicoidal e interactúa mediante análisis de dos híbridos con MreB. Recientemente se demostró que ParM, un homólogo de MreB codificado por el plásmido R1, impulsa la partición del plásmido mediante la polimerización de filamentos que separa a las hermanas (Moller-Jensen et al., 2002). Además, la expresión en células de tipo salvaje de formas mutantes de MreB que no pueden polimerizar induce una separación defectuosa de nucleoides y división celular (Kruse et al., 2003). Por lo tanto, favorecemos la hipótesis de que SetB participa en la aplicación de una fuerza al cromosoma que ayuda a impulsar la segregación cromosómica. Los dominios topológicos que están sometidos a estrés asumirán conformaciones dirigidas a aliviar ese estrés. Por tanto, si funciona un sistema de este tipo, hay que considerar que la forma y distribución de la topología en el cromosoma en replicación podrían ser distintas de las que imaginamos ahora. En esta línea, el rescate del parC La cepa sensible a la temperatura por sobreexpresión de SetB es hipersensible a la quinolona norfloxacina (datos no publicados), lo que sugiere que la necesidad de girasa se había vuelto particularmente aguda. Una posible interpretación de esta observación es que el exceso de tensión aplicada al cromosoma cuando se sobreexpresa SetB induce una conformación que permite que la girasa sirva como decatenasa celular.

Una descripción de cómo se maneja la topología de replicación en la celda que podría ajustarse a todos los datos y las interpretaciones discutidas aquí es que la girasa opera para eliminar el (+) sc formado durante la replicación, que los precatenanos formados no interfieren con la replicación y solo se eliminan al final del ciclo celular, probablemente cuando se han convertido en catenanos, y que Topo IV actúa principalmente sobre los catenanos (Fig. 1). El principio principal que rige cómo se distribuyen los devanados positivos en exceso generados por la replicación parece estar relacionado con la naturaleza de los dominios cromosómicos. Si los estudios futuros de una sola molécula apoyan la afirmación de que la girasa opera en aproximadamente dos a cuatro eventos de paso de cadena s −1, entonces cualquier dominio topológico que contenga una horquilla de replicación en avance requiere la acción simultánea de 13-25 moléculas de girasa. Tomemos 20 como valor medio. Debido a que la girasa envuelve 150 pb de ADN sobre sí misma (Liu y Wang, 1978), estas moléculas ocuparán 3 kpb de ADN no replicado.

Posible distribución de la topología del ADN, la ADN girasa y el Topo IV en la célula. La caricatura muestra una célula bacteriana que está a punto de completar la citocinesis. La célula está dividida por el anillo septal invaginable. Los catenanos entre los dos cromosomas hermanos que se están dividiendo están siendo eliminados por Topo IV que está anclado en el anillo septal en virtud de su interacción con el dominio AAA C-terminal de FtsK. La actividad de translocación del ADN de este dominio de FtsK puede participar directamente en la reacción de decantación. La replicación se ha iniciado en los cromosomas hermanos que se someten a partición. Los cromosomas hermanos de segunda generación están organizados en dominios topológicos superenrollados negativamente que posiblemente estén anclados por la ADN girasa. El dominio topológico que está por delante de la bifurcación de replicación (es decir, entre la fábrica de replicación y la barrera de dominio en la caricatura) está positivamente superenrollado. La girasa se concentra en este dominio para proporcionar suficiente actividad de desvinculación. El dibujo no está a escala. El ADN dúplex está representado por una sola línea. Las regiones recién replicadas de los cromosomas están en rojo. El tabique invaginante está representado por rectángulos grises.

¿Qué sucede cuando la bifurcación que avanza aprieta al consorcio giraso contra la barrera del dominio? En parte, el resultado depende tanto del comportamiento de la girasa ligada como de la naturaleza de la barrera del dominio en sí. Una posibilidad es que, como las moléculas de girasa presumiblemente se disocian para permitir el paso de la bifurcación, todos los devanados dúplex de la región no replicada se conviertan en precateanos, 300 de ellos. Tal situación parecería insostenible. Esta conversión requeriría 300 rotaciones de la bifurcación de replicación por dominio, algo que probablemente sea poco probable. Además, si los dominios cromosómicos son del orden de 50 kpb, la aritmética argumenta que habría en el rango de 25 000 precatenanos convertidos en catenanos al final de la replicación. Curiosamente, dadas las tasas medidas para la desvinculación del ADN trenzado de Topo IV, unas 40 moléculas de Topo IV podrían eliminar todas esas uniones en unos 10 minutos, un período que corresponde aproximadamente al período D de la E. coli ciclo celular (Cooper y Helmstetter, 1968). Por otro lado, el grado de vinculación entre los cromosomas hermanos implicado por esta densidad de precatenanes parecería ser una fuerza para la cohesión del cromosoma hermano que actuaría contra la extrusión de las hermanas en mitades opuestas de la célula como se postula en modelos de replicación. partición cromosómica impulsada (Lemon y Grossman, 2001).

Una posibilidad más probable es que las barreras de dominio no estén fijas y puedan deslizarse hacia adelante a medida que avanza la bifurcación. Quizás la presión del consorcio girasa al encontrar la barrera del dominio actúa como algún tipo de desencadenante en este proceso o quizás la barrera del dominio es el propio consorcio giraso. En estas circunstancias, las moléculas de girasa que se disocian para permitir el paso de la bifurcación podrían volver a unirse corriente abajo. De esta manera, habría una pequeña cantidad de superenrollamientos positivos sobre los precatenanes. Claramente, quedan por responder muchas preguntas sobre el manejo de la topología del ADN en la célula.


Topología de ADN & # 8211 Joaquim Roca

La transcripción de genes y la replicación de cromosomas están sujetas a severas limitaciones topológicas debido a la estructura de doble hélice y la enorme longitud de las moléculas de ADN. En primer lugar, si bien las moléculas de ADN intracelular están empaquetadas estrechamente, también deben ser accesibles y desenredadas para facilitar las transacciones del genoma. Aparentemente, esto se logra mediante el enrollamiento y bucle periódico del ADN para producir un fractal de dominios topológicos, que se pueden reorganizar en compartimentos funcionales y fases físico-químicas. En segundo lugar, como la transcripción de genes y la replicación de cromosomas requieren desenrollar la doble hélice, las hebras de ADN experimentan una tensión helicoidal que debe disiparse. Sin embargo, la tensión helicoidal del ADN también es útil para ajustar el plegamiento espacial (superenrollamiento), las transiciones conformacionales y las interacciones moleculares del ADN.

A pesar del papel fundamental de la topología del ADN, su interacción con la multiplicidad de reguladores genómicos comúnmente investigados a menudo se pasa por alto (o se entiende mal). Sin embargo, solo mediante la evaluación de la topología del ADN, será posible comprender verdaderamente la nanomecánica que gobierna la biología cromosómica y sus disfunciones. Nuestra investigación tiene como objetivo descifrar los conjuntos estructurales y enzimáticos que determinan la ruta 3D de las hebras de ADN intracelular, y cómo las fuerzas de tracción y torsión del ADN interactúan con la arquitectura de la cromatina y las actividades genómicas.


ADN topoisomerasa II

La ADN topoisomerasa II es una enzima dependiente de ATP que requiere 2 moléculas de ATP por reacción. Actúa de todo el ADN de doble hebra, lo corta y lo vuelve a unir. Topo II relaja el superenrollamiento positivo en el ADN eucariota.

Un tipo especial de ADN topoisomerasa II que se encuentra en el procariota se llama "ADN girasa" que introduce el superenrollamiento en el ADN bacteriano. La ADN girasa realiza ambas funciones de liberación e introducción de superenrollamiento negativo en el ADN bacteriano.

Crédito de la imagen: “Biología molecular del gen”, 7ª edición de Watson. La imagen representa cómo la topoisomerasa II corta el dsDNA y lo relaja.

Otra función importante que realiza topoII, son la catenación y la desactivación. Imagina dos anillos enlazados. Las moléculas de ADN se catenan de la misma manera. Aquí, la topoisomerasa corta el dsDNA y lo descatenan para relajarse. Además, catena el ADN decatenado para su superenrollamiento.

Crédito de la imagen: “Biología molecular del gen”, 7ª edición de Watson. la Imagen representa catenation y decatenation.

El proceso de decantación es un proceso muy importante ya que permite la separación de la molécula de ADN en dos células hijas, después de la replicación.


8.2: Cromosomas y empaque

Dentro de las células eucariotas, el ADN se organiza en estructuras lineales largas llamadas cromosomas(Figura 4.8). A cromosoma es una molécula de ácido desoxirribonucleico (ADN) con parte o todo el material genético (genoma) de un organismo. La mayoría de los cromosomas eucariotas incluyen proteínas de empaquetamiento que, con la ayuda de las proteínas chaperonas, se unen y condensan la molécula de ADN para evitar que se convierta en una maraña inmanejable. Antes de la división celular típica, estos cromosomas se duplican en el proceso de replicación del ADN, proporcionando un conjunto completo de cromosomas para cada célula hija. Los brazos replicados de un cromosoma se denominan cromátidas. Antes de separarse en las células hijas durante la mitosis, las cromátidas replicadas se mantienen unidas por una estructura cromosómica llamada centrómero.

Figura 4.8 Diagrama de cromosoma eucariota replicado y condensado. (1) Cromátida: una de las dos partes idénticas del cromosoma después de la fase S. (2) Centrómero: el punto donde se unen las dos cromátidas. (3) El brazo corto se denomina pag El brazo largo se denomina q

Los organismos eucariotas (animales, plantas, hongos y protistas) almacenan la mayor parte de su ADN dentro del núcleo celular como ADN nuclear lineal, y algunos en las mitocondrias como ADN mitocondrial circular o en cloroplastos como ADN de cloroplasto circular. Por el contrario, los procariotas (bacterias y arqueas) no tienen estructuras de orgánulos y, por lo tanto, almacenan su ADN solo en una región del citoplasma conocida como región nucleoide. Los cromosomas procariotas constan de ADN circular doble y ndashstranded.

El genoma de una célula suele ser significativamente más grande que la propia célula. Por ejemplo, si el ADN de una célula humana que contiene 46 cromosomas se extendiera en una línea, ¡se extendería más de 6 pies (2 metros)! ¿Cómo es posible que la información genética no solo encaje en la célula, sino que encaje en el núcleo celular? Eukaryota resuelve este problema mediante una combinación de superenrollamiento y empaquetado de ADN alrededor del familia de histonas de proteínas (descrito abajo). Los procariotas no contienen histonas (con algunas excepciones). Los procariotas tienden a comprimir su ADN usando proteínas asociadas a nucleoides (NAP)y superenrollamiento(Figura 4.9).

Superenrollamiento de ADNse refiere al enrollamiento excesivo o insuficiente de una hebra de ADN y es una expresión de la cepa en esa hebra (Figura 4.9). El superenrollamiento es importante en varios procesos biológicos, como la compactación del ADN y la regulación del acceso al código genético. El superenrollamiento del ADN afecta fuertemente al metabolismo del ADN y posiblemente a la expresión génica. Además, ciertas enzimas como topoisomerasas son capaces de cambiar la topología del ADN para facilitar funciones como la replicación o transcripción del ADN.

En un segmento de doble hélice "relajado" de B-DNA, las dos hebras se retuercen alrededor del eje helicoidal una vez cada 10,4 y ndash10,5 pares de bases de secuencia. Sumar o restar giros, como pueden hacer algunas enzimas, impone tensión. Si un segmento de ADN sometido a tensión de torsión se cerrara en un círculo uniendo sus dos extremos y luego se le permitiera moverse libremente, el ADN circular se contorsionaría en una nueva forma, como una simple figura de ocho (Figura 4.9). Tal contorsión es una superenrollamiento. La forma nominal & quotsupercoil & quot se usa a menudo en el contexto de la topología del ADN.

Figura 4.9 Superenrollamiento de ADN. La estructura superenrollada de moléculas de ADN lineales con extremos restringidos. La naturaleza helicoidal del dúplex de ADN se omite para mayor claridad.

El ADN positivamente superenrollado (sobreenrollado) se genera transitoriamente durante la replicación y transcripción del ADN y, si no se relaja rápidamente, inhibe (regula) estos procesos. La simple figura de ocho es la superenrollamiento más simple, y es la forma que asume un ADN circular para acomodar demasiados o muy pocos giros helicoidales. Los dos lóbulos de la figura ocho aparecerán girados en sentido horario o antihorario uno con respecto al otro, dependiendo de si la hélice está enrollada o no. Por cada giro helicoidal adicional que se acomode, los lóbulos mostrarán una rotación más alrededor de su eje. Como regla general, el ADN de la mayoría de los organismos está superenrollado negativamente.

Las contorsiones locales de un ADN circular, como la rotación de los lóbulos en forma de ocho anteriores, se denominan retorcerse. El ejemplo anterior ilustra que retorcerse y retorcerse son interconvertibles. El superenrollamiento se puede representar matemáticamente por la suma de giroy retorcerse (Figura 4.9). los giroes el número de vueltas helicoidales en el ADN y el retorcimiento es el número de veces que la doble hélice se cruza sobre sí misma (estos son los superenrollamientos). Los giros helicoidales adicionales son positivos y conducen a un superenrollamiento positivo, mientras que el giro sustractivo provoca un superenrollamiento negativo. Muchas enzimas topoisomerasas detectan el superenrollamiento y lo generan o lo disipan a medida que cambian la topología del ADN.

En parte porque los cromosomas pueden ser muy grandes, los segmentos del medio pueden actuar como si sus extremos estuvieran anclados. Como resultado, es posible que no puedan distribuir el exceso de torsión al resto del cromosoma o absorber la torsión para recuperarse del subbobinado y los segmentos pueden volverse superenrollado, en otras palabras. En respuesta al superenrollamiento, asumirán una cantidad de retorcimiento, como si sus extremos estuvieran unidos.

El ADN circular superenrollado forma dos estructuras principales: plectoneme o un toroide, o una combinación de ambos (Figura 4.9). Una molécula de ADN superenrollada negativamente producirá una hélice izquierda de un solo comienzo, el toroide, o una hélice diestra de dos salidas con bucles terminales, el plectoneme. Plectonemas son típicamente más comunes en la naturaleza, y esta es la forma que adoptarán la mayoría de los plásmidos bacterianos (Figura 4.10). En el caso de moléculas más grandes, es común que las estructuras híbridas formen un bucle en un toroide que pueda extenderse en un plectonema (Figura 4.10). El superenrollamiento del ADN es importante para el empaquetamiento del ADN dentro de todas las células, y parece que también juega un papel en la expresión génica.

Figura 4.10 Superenrollamiento de ADN bacteriano. Visualización de microscopía de fuerza atómica (AFM) de plásmidos bacterianos pBR322 relajados por torsión (A) y superenrollados negativamente (B). (C) Imagen de microscopía electrónica del ADN cromosómico de E. coli que muestra una estructura híbrida toroidal-plectonema.

Además de formar una estructura superenrollada, se ha demostrado que los cromosomas circulares de bacterias se someten a los procesos de cadena y anudamiento sobre la inhibición de las enzimas topoisomerasas. Cadenaes el proceso mediante el cual dos cadenas circulares de ADN se unen como eslabones de cadena, mientras que Anudado de ADN son las estructuras entrelazadas que ocurren dentro de una única estructura circular de ADN. En vivo, La acción de las enzimas topoisomerasas es fundamental para evitar que los nudos y los catenoides enreden la estructura del ADN.

Figura 4.11 Catenación y anudado del ADN. La estructura superior muestra la forma superenrollada negativa del ADN bacteriano. La inhibición de la actividad de la enzima topoisomerasa conduce a la relajación, catenamiento y anudado de la estructura cromosómica.

Tenga en cuenta la naturaleza circular del cloroplasto y el ADN mitocondrial, lo que sugiere un origen bacteriano para ambas estructuras de orgánulos. Las alineaciones de secuencia apoyan aún más la teoría endosimbiótica, lo que propone que las bacterias fueron engullidas por los primeros organismos eucariotas y posteriormente se volvieron simbióticas con su contraparte eucariota, en lugar de ser digeridas.

En las células de los organismos existentes, la gran mayoría de las proteínas presentes en las mitocondrias (que suman aproximadamente 1500 tipos diferentes en los mamíferos) están codificadas por ADN nuclear. Sin embargo, la secuenciación del genoma mitocondrial humano ha revelado 16 569 pares de bases que codifican 13 proteínas (figura 4.12). Muchas de las proteínas producidas mitocondrialmente son necesarias para el transporte de electrones durante la producción de ATP (figura 4.12).

Figura 4.12 Genoma mitocondrial. Las mitocondrias son estructuras de orgánulos que contienen una doble membrana, que se cree que se originaron como un organismo procariota independiente que originalmente fue engullido por un organismo eucariota, donde se convirtió en una contraparte simbiótica. Las mitocondrias contienen ADN cromosómico circular que comparte una gran similitud de secuencia con las alfaprotobacterias. El genoma mitocondrial humano contiene 16 569 pares de bases que codifican 13 proteínas y componentes de ARN ribosómico (ARNr).

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Dentro de los cromosomas eucariotas, las proteínas de cromatina, conocidas como histonas, compacta y organiza el ADN. Estas estructuras de compactación guían las interacciones entre el ADN y otras proteínas, lo que ayuda a controlar qué partes del ADN se transcriben.

Histonas son proteínas altamente alcalinas que se encuentran en los núcleos de las células eucariotas y que empaquetan y ordenan el ADN en unidades estructurales llamadas nucleosomas. Son los principales componentes proteicos de la cromatina, actúan como bobinas alrededor de las cuales se enrolla el ADN y desempeñan un papel en la regulación genética. Sin histonas, el ADN desenrollado en los cromosomas sería muy largo (una proporción de largo a ancho de más de 10 millones a 1 en el ADN humano). Por ejemplo, cada célula diploide humana (que contiene 23 pares de cromosomas) tiene alrededor de 1,8 metros de ADN enrollado en las histonas, la célula diploide tiene alrededor de 90 micrómetros (0,09 mm) de cromatina.

Existen cinco familias principales de histonas: H1 / H5, H2A, H2B, H3 y H4. Las histonas H2A, H2B, H3 y H4 se conocen como histonas centrales, mientras que las histonas H1 / H5 se conocen como histonas enlazadoras.

Todas las histonas centrales existen como dímeros, que son similares en el sentido de que todas poseen el dominio de pliegue de histonas: tres hélices alfa unidas por dos bucles (Figura 4.13). Es esta estructura helicoidal la que permite la interacción entre distintos dímeros, particularmente en forma de cabeza y cola (también llamado motivo de apretón de manos). Los cuatro dímeros distintos resultantes se unen para formar un núcleo nucleosómico octamérico, de aproximadamente 63 Angstroms de diámetro. Alrededor de 146 pares de bases (pb) de ADN se envuelven alrededor de esta partícula central 1,65 veces en un giro súper helicoidal a la izquierda para dar una partícula de alrededor de 100 Angstroms de ancho, llamada nucleosoma.

Figura 4.13 Estructura del núcleo del nucleosoma. Las histonas H2A y H2B se dimerizan y las histonas H3 y H4 se dimerizan. Dos dímeros de cada uno se unen para formar un octómero con núcleo de histona. La doble hélice de ADN se enrolla 1,65 veces alrededor del núcleo del octómero formando la estructura del nucleosoma.

Imagen adaptada de: Estructura del nucleosoma

La histona enlazadora H1 se une al nucleosoma en los sitios de entrada y salida del ADN, bloqueando así el ADN en su lugar y permitiendo la formación de una estructura de orden superior (Figura 4.14). La formación más básica de este tipo es la fibra o perlas de 10 nm en una conformación de cuerda. Esto implica la envoltura de ADN alrededor de los nucleosomas con aproximadamente 50 pares de bases de ADN que separan cada par de nucleosomas (también conocido como ADN enlazador).

El nucleosoma contiene más de 120 interacciones directas proteína-ADN y varios cientos de interacciones mediadas por agua. Las interacciones directas entre proteína y ADN no se distribuyen uniformemente sobre la superficie del octámero, sino que se ubican en sitios discretos. Estos se deben a la formación de dos tipos de sitios de unión al ADN dentro del octámero, el sitio & alpha1 & alpha1, que utiliza la hélice & alpha1 de dos histonas adyacentes, y el sitio L1L2 formado por los bucles L1 y L2. Los enlaces salinos y los enlaces de hidrógeno entre los grupos hidroxilo y básico de la cadena lateral y las amidas de la cadena principal con los fosfatos de la cadena principal del ADN forman la mayor parte de las interacciones con el ADN. Esto es importante, dado que la distribución ubicua de nucleosomas a lo largo de los genomas requiere que sea un factor de unión al ADN no específico de secuencia. Aunque los nucleosomas tienden a preferir algunas secuencias de ADN sobre otras, son capaces de unirse prácticamente a cualquier secuencia, lo que se cree que se debe a la flexibilidad en la formación de estas interacciones mediadas por agua. Además, se realizan interacciones no polares entre las cadenas laterales de proteínas y los grupos desoxirribosa, y una cadena lateral de arginina se intercala en el surco menor del ADN en los 14 sitios donde se enfrenta a la superficie del octámero. La distribución y la fuerza de los sitios de unión al ADN alrededor de la superficie del octámero distorsionan el ADN dentro del núcleo del nucleosoma. El ADN no está doblado de manera uniforme y también contiene defectos de torsión. La torsión del ADN en forma de B libre en solución es de 10,5 pb por vuelta. Sin embargo, la torsión total del ADN nucleosómico es de solo 10,2 pb por turno, variando desde un valor de 9,4 a 10,9 pb por turno.

Las extensiones de la cola de histonas constituyen hasta un 30% en masa de histonas, pero no son visibles en las estructuras cristalinas de los nucleosomas debido a su alta flexibilidad intrínseca y se ha pensado que están en gran parte desestructuradas (Figura 4.14). Las colas N-terminales de las histonas H3 y H2B pasan a través de un canal formado por los surcos menores de las dos cadenas de ADN, que sobresalen del ADN cada 20 pb. La cola N-terminal de la histona H4, por otro lado, tiene una región de aminoácidos altamente básicos (16-25), que, en la estructura cristalina, forma una interacción con la región de superficie altamente ácida de un dímero H2A-H2B. de otro nucleosoma, siendo potencialmente relevante para la estructura de orden superior de los nucleosomas. Se cree que esta interacción también ocurre en condiciones fisiológicas y sugiere que la acetilación de la cola H4 distorsiona la estructura de orden superior de la cromatina.

Figura 4.14 Estructura general del nucleosoma. (A) Diagrama de vista lateral de la estructura del nucleosoma con el octómero de histona mostrado en azul, la doble hélice de ADN en rojo y el enlazador de histona H1 en verde. (B) Muestra una vista superior del octómero de histona con la hélice de ADN asociada. Tenga en cuenta que las colas de histonas de H3 y H2B sobresalen del ADN.

La formación de la doble hélice de ADN representa el empaquetamiento de primer orden de la estructura cromosómica (Figura 4.15). La formación de nucleosomas representa el segundo nivel de empaquetamiento de los cromosomas eucariotas. In vitro Los datos sugieren que los nucleosomas se organizan en una estructura de solenoide que consta de 6 nucleosomas unidos entre sí por las proteínas enlazadoras de histona H1 o una estructura en zigzag que es similar a la construcción de solenoide (Figura 4.15). Tanto el solenoide como las estructuras en zigzag tienen un diámetro de aproximadamente 30 nm. Las estructuras de solenoide y zigzag informadas desde in vitro aún no se ha confirmado que ocurran datos en vivo.

Durante la interfase, cada cromosoma ocupa un dominio espacialmente limitado, aproximadamente elíptico, que se conoce como territorio cromosómico (CT). Cada territorio cromosómico se compone de unidades de cromatina de orden superior de

1 Mb cada uno. Es probable que estas unidades se construyan a partir de dominios de bucle más pequeños que contienen los motivos estructurales de solenoide / zigzag. Por otro lado, los dominios de 1 Mb pueden servir ellos mismos como unidades más pequeñas en estructuras de cromatina de orden superior.

Se sabe que los territorios cromosómicos están dispuestos radialmente alrededor del núcleo. Esta disposición es específica del tipo de tejido y de célula y también se conserva evolutivamente. Se demostró que la organización radial de los territorios cromosómicos se correlaciona con la densidad y el tamaño de sus genes. En este caso, los cromosomas ricos en genes ocupan posiciones interiores, mientras que los cromosomas más grandes y pobres en genes tienden a ubicarse alrededor de la periferia. Los territorios cromosómicos también son estructuras dinámicas, con genes capaces de reubicarse desde la periferia hacia el interior una vez que se han activado y desactivado. En otros casos, los genes pueden moverse en la dirección opuesta o simplemente mantener su posición. El desalojo de genes de sus territorios cromosómicos hacia el compartimento de intercromatina o un territorio cromosómico vecino suele ir acompañado de la formación de grandes bucles de cromatina descondensada.

Figura 4.15 Estructura cromosómica. (1) La doble hélice de ADN tiene aproximadamente 2 nm de diámetro. (2) La estructura del núcleo del nucleosoma tiene aproximadamente 11 nm de diámetro. (3) La estructura de solenoide / zigzag tiene aproximadamente 30 nm de diámetro y se propone que forme bucles cromosómicos (4) durante la interfase celular y territorios cromosómicos más condensados ​​(5) durante la mitosis.

Modelos que describen la disposición del territorio de los cromosomas

Con el desarrollo de técnicas bioquímicas de alto rendimiento, como 3C (captura de conformación de cromosoma lsquo) y 4C (captura de conformación de cromosoma lsquocromosoma en chip y rsquo y captura de conformación de cromosoma escamosa y rsquo), se han descrito numerosas interacciones espaciales entre territorios de cromatina vecinos (Figura 4.16). Estas descripciones se han complementado con la construcción de mapas de proximidad espacial para todo el genoma (por ejemplo, para una línea celular linfoblastoide humana). En conjunto, estas observaciones y simulaciones físicas han llevado a la propuesta de varios modelos que tienen como objetivo definir la organización estructural de los territorios cromosómicos:

Figura 4.16 Modelos informáticos de la estructura del territorio cromosómico (CT). En el modelo CT-IC, el espacio entre los CT discretos se puede visualizar en un microscopio óptico y electrónico y se denomina compartimento de intercromatina (IC). Las fábricas de transcripción (TF, color verde) se localizan predominantemente en la región de pericromatina. En el modelo ICN, el compartimento de intercromatina no es evidente. En cambio, el espacio entre los TC está ocupado por bucles de cromatina descondensada entremezclados, que a menudo comparten las mismas fábricas de transcripción.

1. El modelo de territorio cromosómico-compartimento de intercromatina (CT-IC) describe dos compartimentos principales: territorios cromosómicos (CT) y un compartimento de intercromatina (IC). En este modelo, los territorios cromosómicos construyen una red de cromatina interconectada que está asociada con un espacio 3D adyacente llamado compartimento de intercromatina. Este último se puede observar mediante microscopía óptica y electrónica.

Dentro de un territorio cromosómico único, el cromosoma en interfase se divide en regiones definidas según el nivel de condensación cromosómica. Aquí, la parte interna del cromosoma en interfase se compone de dominios de cromatina más condensados ​​o fibras de cromatina de orden superior, mientras que una capa delgada (& lt200 nm) de cromatina más descondensada, conocida como región de pericromatina, se puede encontrar alrededor de la periferia cromosómica. Funcionalmente, la región de pericromatina representa el compartimento transcripcional principal, y también es la región donde tiene lugar la mayor parte del corte y empalme de ARN cotranscripcional. La replicación del ADN [20] y la reparación del ADN [21] también se llevan a cabo predominantemente dentro de la región de la pericromatina. Finalmente, las transcripciones de ARN nacientes, denominadas fibrillas de pericromatina, también se generan en la región de pericromatina. Las fibrillas de pericromatina se someten luego a los eventos de empalme por los factores, proporcionados desde el compartimento de intercromatina.

El modelo de celosía, propuesto por Dehgani et al. se basa en informes de que la transcripción también ocurre dentro de los territorios cromosómicos internos más condensados ​​y no solo en la interfaz entre el compartimento de intercromatina y la región de pericromatina. Usando ESI (imágenes espectroscópicas de electrones), Dehgani et al. mostró que la cromatina estaba organizada como una serie de fibras de desoxi-ribonucleoproteína de 10 & ndash30 nm de diámetro. En este estudio, los compartimentos de intercromatina, que se describen en el modelo CT-IC como grandes canales entre territorios cromosómicos, no fueron evidentes. En cambio, las fibras de cromatina crearon una malla suelta de cromatina en todo el núcleo que se entremezcló en la periferia de los territorios cromosómicos. Por lo tanto, los espacios inter e intracromosómicos dentro de esta red son esencialmente contiguos y juntos forman el espacio intranuclear.

2. El modelo de red de intercromatina (ICN) predice que las fibras / bucles de cromatina entremezclados pueden hacer contactos cis- (dentro del mismo cromosoma) y trans- (entre diferentes cromosomas). Esta mezcla es uniforme y hace que la distinción entre el territorio cromosómico y el compartimento de intercromatina carezca de sentido funcional. La ventaja del modelo ICN es que permite una alta dinámica de cromatina y movimientos de difusión. Los autores proponen que la transcripción en curso influye en el grado de entremezclado entre cromosomas específicos al estabilizar las asociaciones entre loci particulares. Es probable que tales interacciones dependan de la actividad transcripcional de los loci y, por lo tanto, son específicas del tipo de célula.

Se ha estudiado la organización específica del tipo celular de los territorios cromosómicos midiendo el volumen y la frecuencia de entremezclado entre cromosomas heterólogos. Mediante el uso de 3C (captura de conformación cromosómica) y FISH (hibridación fluorescente in situ) para mapear las regiones de entremezclado de cromosomas, se reveló que estas regiones contienen una mayor densidad de genes activos y están enriquecidas con marcadores de activación y represión transcripcional, como activado RNAPII. Al comparar las posiciones de los CT en células madre embrionarias (ES) de ratón indiferenciadas, células ES en etapas tempranas de diferenciación y células NIH3T3 diferenciadas terminalmente, se demostró que las células completamente diferenciadas tenían un mayor enriquecimiento de RNAPII, en comparación con las células indiferenciadas o menos. -células diferenciadas. Los hallazgos apoyan la noción de que las regiones entremezcladas tienen un significado funcional en el núcleo y proporcionan una base para comprender cómo evolucionan las posiciones radial y relativa de los territorios cromosómicos durante el proceso de diferenciación, explicando su organización de una manera dependiente del tipo de célula.

3. El modelo de Fraser y Bickmore enfatiza la importancia funcional de los bucles de cromatina gigantes, que se originan en territorios cromosómicos y se expanden a través del espacio nuclear para compartir fábricas de transcripción. En este caso, ambos cis- y trans- los bucles de cromatina descondensada pueden coexpresarse y co-regularse por la misma fábrica de transcripción.

4. Los modelos de polímero de cromatina suponen una amplia gama de tamaños de bucles de cromatina y predicen las distancias observadas entre los loci genómicos y los territorios cromosómicos, así como las probabilidades de que se formen contactos entre loci dados. Estos modelos aplican enfoques basados ​​en la física que destacan la importancia de la entropía para comprender la organización nuclear. Al proponer la existencia de conjuntos de cromatina conformacionales con estructuras basadas en tres posibles estados de homopolímeros, estos modelos también proporcionan estructuras alternativas a la fibra de cromatina tradicional de 30 nm, que se ha puesto en duda tras estudios recientes.

Ante la falta de evidencia experimental que sustente estos modelos descritos, debe recordarse que solo sirven para hipotetizar las propiedades estructurales y químicas de las estructuras de cromatina intermedias, y para resaltar preguntas sin respuesta. Por ejemplo, quedan por definir los mecanismos que existen para controlar la velocidad y la extensión del movimiento de la cromatina.

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Estructuras de telómeros

En los extremos de los cromosomas lineales hay regiones especializadas de ADN llamadas telómeros (Figura 4.17). La función principal de estas regiones es permitir que la célula replique los extremos de los cromosomas utilizando la enzima telomerasa, ya que las enzimas que normalmente replican el ADN no pueden copiar los extremos 3 y primos de los cromosomas. Estas tapas cromosómicas especializadas también ayudan a proteger los extremos del ADN y evitan que los sistemas de reparación del ADN en la célula los traten como daños a corregir. En las células humanas, los telómeros suelen ser longitudes de ADN monocatenario que contienen varios miles de repeticiones de una secuencia TTAGGG simple.

Durante la replicación del ADN, el ADN de doble hebra se desenrolla y la ADN polimerasa sintetiza nuevas hebras. Sin embargo, como la ADN polimerasa se mueve de manera unidireccional (de 5 y rsquo a 3 y rsquo), solo la cadena principal se puede replicar de forma continua. En el caso de la hebra rezagada, la replicación del ADN es discontinua. En los seres humanos, pequeños cebadores de ARN se adhieren a la hebra rezagada de ADN y el ADN se sintetiza en pequeños tramos de aproximadamente 100-200 nucleótidos, que se denominan fragmentos de Okazaki. Los cebadores de ARN se eliminan, se reemplazan con ADN y los fragmentos de Okazaki se ligan. Al final de la hebra rezagada, es imposible unir un cebador de ARN, lo que significa que se perderá una pequeña cantidad de ADN cada vez que la célula se divida. Este "problema de replicación final" tiene graves consecuencias para la célula, ya que significa que la secuencia de ADN no se puede replicar correctamente, con la pérdida de información genética.

Para evitar esto, los telómeros se repiten cientos o miles de veces al final de los cromosomas. Cada vez que ocurre la división celular, se pierde una pequeña sección de secuencias teloméricas al final del problema de replicación, protegiendo así la información genética. En algún momento, los telómeros se vuelven críticamente cortos. Este desgaste conduce a la senescencia celular, donde la célula no puede dividirse, o la muerte celular apoptótica. Los telómeros son la base del límite de Hayflick, el número de veces que una célula puede dividirse antes de alcanzar la senescencia.

Los telómeros pueden ser restaurados por la enzima telomerasa, que extiende la longitud de los telómeros (Figura 4.17). La actividad de la telomerasa se encuentra en las células que se dividen de forma regular, como las células madre y los linfocitos del sistema inmunológico. Los telómeros también se pueden extender a través de la vía de alargamiento alternativo de los telómeros (ALT). En este caso, en lugar de extenderse, los telómeros se cambian entre cromosomas mediante recombinación homóloga. Como resultado del intercambio de telómeros, un conjunto de células hijas tendrá telómeros más cortos y el otro conjunto tendrá telómeros más largos.

Una desventaja de la extensión de los telómeros es el potencial de división celular descontrolada y cáncer. Se ha encontrado una actividad de telomerasa anormalmente alta en la mayoría de las células cancerosas, y los tumores no telomerasa a menudo exhiben activación de la vía ALT. Además de la posibilidad de perder información genética, las células con telómeros cortos tienen un alto riesgo de recombinación cromosómica inadecuada, lo que puede provocar inestabilidad genética y aneuploidía (una cantidad anormal de cromosomas).

Figura 4.17 Estructura de los telómeros. (A) Los telómeros se encuentran al final de los cromosomas, donde ayudan a proteger contra la pérdida de ADN durante la replicación. (B) ADN cuádruple formado por repeticiones de telómeros. La conformación en bucle de la columna vertebral del ADN es muy diferente de la típica hélice de ADN. Las esferas verdes del centro representan iones de potasio.

Estas secuencias de telómeros ricas en guanina también pueden estabilizar los extremos de los cromosomas formando estructuras de conjuntos apilados de unidades de cuatro bases, en lugar de los pares de bases habituales que se encuentran en otras moléculas de ADN (Figura 4.17). Aquí, cuatro bases de guanina forman una placa plana y estas unidades planas de cuatro bases se apilan una encima de la otra, para formar una estructura G-cuádruplex estable. Estas estructuras se estabilizan mediante enlaces de hidrógeno entre los bordes de las bases y la quelación de un ión metálico en el centro de cada unidad de cuatro bases. También se pueden formar otras estructuras, con el conjunto central de cuatro bases provenientes de una sola hebra doblada alrededor de las bases, o de varias hebras paralelas diferentes, cada una aportando una base a la estructura central.

Además de estas estructuras apiladas, los telómeros también forman grandes estructuras de bucle llamadas bucles de telómeros o bucles en T. Aquí, el ADN monocatenario se enrolla en un círculo largo estabilizado por proteínas de unión a telómeros. Al final del bucle en T, el ADN del telómero monocatenario se mantiene en una región del ADN bicatenario mediante la cadena del telómero que interrumpe el ADN de doble hélice y el apareamiento de bases con una de las dos cadenas. Esta estructura de triple hebra se llama bucle de desplazamiento o bucle en D.


Ciclo celular y división celular para la clase 10 | Biología

En este artículo discutiremos sobre: ​​- 1. Introducción al ciclo celular 2. Regulación del ciclo celular 3. División del núcleo de una célula 4. Errores en la división celular.

Introducción a tel ciclo celular:

Las plantas y animales superiores comienzan su vida como una sola célula llamada óvulo que es fertilizada por una célula masculina que da como resultado la formación de un cigoto. El crecimiento y desarrollo del cigoto para formar un embrión se ve afectado por una serie de divisiones. Las células aumentan en número al dividirse en dos, después de lo cual cada célula hija crece y se divide nuevamente.

En otras palabras, las células no se dividen siempre, sino que hay un período de descanso entre dos divisiones sucesivas que se denomina interfase. Anteriormente, la interfase se llamaba fase de reposo, que de hecho es un nombre inapropiado, porque es un período de intensa actividad biosintética en el que la célula duplica su tamaño y duplica su complemento cromosómico. La interfase es seguida inmediatamente por la fase de división o fase M, ambas fases constituyen el ciclo celular.

Howard y Pelc han dividido todo el ciclo celular en cuatro intervalos sucesivos, a saber:

Sigue inmediatamente la fase de división (mitosis o meiosis). También se denomina fase previa a la síntesis de ADN. Esta fase incluye la síntesis de los sustratos y enzimas necesarios para la síntesis de ADN. Por lo tanto G1-fase está marcada por la transcripción de varios tipos de ARN y la síntesis de diferentes tipos de proteínas.

La regulación de la duración del ciclo celular ocurre principalmente deteniéndolo en un punto específico de G1. Se dice que la celda en la condición detenido está en el G0-escenario. Cuando las condiciones cambian y se reanuda el crecimiento, la célula vuelve a entrar en el G1-fase.

El g1-periodo es más variable en duración. Dependiendo del estado fisiológico de la célula, puede durar días, meses o años. Para un ciclo celular de 24 horas de duración, la fase G toma las primeras 10 horas.

Es la fase de la síntesis de ADN. Las histonas también se sintetizan durante esta fase y se asocian con el ADN recién replicado. Durante esta fase, las regiones eucromáticas del genoma se replican antes que las regiones heterocromáticas. Además, en algunas células, las regiones ricas en G-C del genoma se replican antes que las ricas en A-T.

También se denomina fase posterior a la síntesis de ADN. Es el período entre el final de la síntesis de ADN y el inicio de la división celular. Durante esta fase se realizan todas las actividades metabólicas relacionadas con el crecimiento del citoplasma y sus orgánulos y macromoléculas constituyentes. También los factores necesarios para la condensación cromosómica durante la mitosis se sintetizan durante esta fase. Durante G2, una célula contiene 2 veces la cantidad de ADN presente en la célula diploide original.

4. Fase M o fase de división:

Durante esta fase, la célula se divide. Durante la división celular, el núcleo se divide primero (cariocinesis), seguido de la división del citoplasma (citocinesis).

La cariocinesis puede ocurrir de las siguientes formas:

Regulación del ciclo celular:

Para la correcta continuación de los procesos de vida de una célula eucariota, es fundamental que las diferentes fases del ciclo celular estén reguladas con precisión. Cualquier pérdida de regulación puede tener graves consecuencias en forma de anomalías cromosómicas. Para ejercer un control efectivo, se permite que las células crucen estos puntos solo si se cumplen todas las condiciones necesarias, de lo contrario se detiene el ciclo celular.

En una célula eucariota se proponen tres puntos de control, a saber, entre G1 y S, entre G2 y fase M y en la propia fase M. En G1/ S punto de control se comprueba el daño al ADN y el tamaño de una célula. Si son normales, se permite que la celda entre en la fase S.

En G2Punto de control / S, si el ADN se ha replicado completa y correctamente, solo se permite que la célula entre en la fase M.

En la fase M, si la fibra del huso no se forma correctamente y los cromosomas no se adhieren correctamente a la fibra del huso a través de sus centrómeros, la división celular se detiene.

Hay dos teorías para explicar el mecanismo de regulación del ciclo celular:

1. Según la teoría del dominio, la célula entra en la siguiente fase del ciclo celular sólo si la fase anterior se completa correctamente.

2. Sin embargo, de acuerdo con la teoría del reloj, la celda oscila entre la interfase y la fase M debido a un temporizador incorporado. En tal caso, a pesar de la inhibición de una fase del ciclo celular, la célula pasa normalmente a la siguiente fase. La entrada de una célula de una fase a otra está controlada genéticamente. Se propone que está controlado por dos grupos de enzimas, a saber, quinasas dependientes de ciclina (CdK) y enzimas fosforilantes llamadas ciclinas.

La quinasa de la fase M regula la entrada del techo en la fase M. Tiene 2 subunidades: una tiene la propiedad catalítica (subunidad catalítica) y la otra ejerce un control regulador (subunidad reguladora o ciclina). La subunidad catalítica se activa mediante un ciclo reversible de fosforilación y desfosforilación al comienzo de la fase M. Este proceso está regulado por ciclinas, por lo que se denominan quinasas dependientes de ciclina (CdK). Las ciclinas se unen a la quinasa de la fase M y seleccionan las proteínas específicas que se van a fosforilar. De manera similar, la entrada de la célula en la fase S está regulada por una quinasa de la fase S.

Por sus descubrimientos sobre la regulación del ciclo celular, Hartwell, Hunt y Nurse recibieron el Premio Nobel en el año 2001. Compararon las moléculas de CdK con un motor y las ciclinas con una caja de cambios que controla si el motor funcionará en ralentí ( marcha neutra) o impulsará la celda hacia adelante en el ciclo de la celda.

División del núcleo de una célula:

Este tipo de división nuclear se ve afectado simplemente por el alargamiento del núcleo seguido de su división completa en dos mitades. La membrana nuclear permanece intacta durante la duración de la división. La amitosis generalmente se observa en bacterias, protozoos, algas y hongos.

Es la forma habitual de división nuclear. Tiene lugar en células somáticas. Fue informado por primera vez por W. Fleming en 1882.

La mitosis se divide en cuatro etapas sucesivas que se denominan profase, metafase, anafase y telofase.

La cromatina se condensa y toma la forma de cromosomas. Los cromosomas ahora comienzan a contraerse longitudinalmente. Debido a su contracción, los cromosomas se vuelven más gruesos y suaves. Se pierde el enrollamiento en espiral, característico de los primeros cromosomas profase. Este cambio a menudo se denomina despiralización.

Hacia el final de la profase, el nucleolo y la membrana nuclear desaparecen y el nucleoplasma se libera, en esta etapa las fibras del huso hacen su aparición en el citoplasma. Estas fibras forman el huso nuclear.

Cada cromosoma se une a una fibra del huso en el centrómero. Aunque cada cromosoma se divide en dos cromátidas, el centrómero es una estructura única indivisa en esta etapa. Los cromosomas ahora se organizan rápidamente en el ecuador del huso.

Durante esta etapa, el centrómero se divide en dos. Cada mitad del centrómero lleva consigo una cromátida. Debido al acortamiento de las fibras del huso, las dos cromátidas se separan entre sí y se mueven hacia los polos opuestos del huso, de modo que los cromosomas adoptan frecuentemente una forma de V, I, J o L. Los dos grupos de cromosomas convergen hacia los polos, exhibiendo una figura de dos grupos radiantes, que se llama diaster.

Al igual que la profase, la telofase también lleva más tiempo en comparación con otras fases. A medida que los cromosomas alcanzan los polos opuestos, comienzan a absorber agua nuevamente y gradualmente se adelgazan, por lo que son más difíciles de observar. En esta etapa hacen su aparición la membrana nuclear y los nucléolos. Por tanto, se producen dos núcleos hijos a partir de un núcleo.

La división del citoplasma se conoce como citocinesis.

Se lleva a cabo mediante cualquiera de los dos métodos siguientes:

(b) Por escisión del citoplasma.

(a) Por método de placa celular:

Durante la telofase, aparecen gotitas de líquido en la región ecuatorial del huso. Gradualmente, estas gotitas se unen para formar la llamada placa celular. La región del huso junto con la placa ecuatorial se denomina phragmoplast. A continuación, el protoplasma forma membranas protoplásmicas en ambos lados de la capa líquida y las paredes celulares se colocan entre las membranas protoplásmicas.

(b) Por escote o constricción:

Este tipo de división tiene lugar en muchas plantas simples como los hongos y en las células animales. En este caso, la división celular tiene lugar mediante la formación de un anillo en forma de surco en la membrana plasmática. Esta hendidura se profundiza hasta que ha atravesado por completo la célula. El surco da como resultado la formación de dos membranas plasmáticas.

Importancia de la mitosis:

La importancia fundamental de la mitosis es la división cuantitativa y cualitativa equitativa del material nuclear, por lo que se puede mantener la constitución genética de los núcleos. Brinda la oportunidad de crecimiento y desarrollo del organismo al provocar un aumento en el número de células. Incluso las gónadas y las células sexuales también dependen de la mitosis para aumentar su número después de que la meiosis haya reducido a la mitad el número de cromosomas.

Regulación de la mitosis:

R. Hertwig sugirió que la coordinación citoplásmica y nuclear regula la mitosis. Está gobernado por la tasa de metabolismo celular, que a su vez está regulado por la temperatura, los nutrientes, el oxígeno, los productos químicos y otros factores similares. Las células producen unas sustancias llamadas calonas que inhiben la mitosis.

Importancia de la mitosis:

1. Se mantiene el número cromosómico en las células hijas.

2. La mitosis contribuye al crecimiento y desarrollo de los organismos.

3. Mantiene la proporción de ADN y ARN en las células.

4. Mantiene el tamaño y la forma adecuados de las células.

5. Las células viejas y en descomposición del cuerpo son reemplazadas por células nuevas producidas por la mitosis.

3. División de Meiosis o Reducción:

Cada planta tiene un número fijo de cromosomas. Si el óvulo y el espermatozoide tuvieran el mismo número de cromosomas que las células vegetativas, el óvulo fertilizado de cada generación contendría el doble de cromosomas que los núcleos de la generación anterior. Esto se previene por la presencia de dos divisiones sucesivas en el ciclo de vida en las que el número de cromosomas se reduce a la mitad del que se encuentra en los núcleos vegetativos. Por lo tanto, el número de cromosomas siempre permanece constante por un tipo especial de división celular llamada meiosis o división de reducción. El término meiosis fue acuñado por Farmer y Moore (1905).

El proceso de meiosis es fundamentalmente el mismo en todas las plantas y animales, pero algunos biólogos reconocen los siguientes tres tipos de divisiones meióticas según su aparición en diferentes etapas del ciclo de vida de los organismos:

I. Meiosis esporógena o intermedia:

Ocurre durante la esporogénesis en plantas superiores y da como resultado la formación de microesporas y megaesporas.

ii. Meiosis gamética o terminal:

En animales y plantas inferiores, la meiosis ocurre durante la gametogénesis y da como resultado la formación de gametos (espermatozoides u óvulos).

iii. Meiosis cigótica o inicial:

Se ve en plantas inferiores. Aquí la meiosis ocurre en el cigoto inmediatamente después de que se forma por fertilización.

Las células en las que tiene lugar la meiosis se denominan meiocitos. El proceso de la meiosis comprende en realidad las dos divisiones celulares. La primera división es una división reduccional en la que el número de cromosomas se convierte en la mitad y la segunda división es una división ecuacional. La división reduccional se denomina primera división meiótica o división heterotípica y la división ecuacional se denomina segunda división meiótica o división homotípica. Estas dos divisiones nucleares se suceden en una secuencia rápida. Como resultado de estas dos divisiones, se forman cuatro núcleos, pero en cada célula hija el número de cromosomas permanece a la mitad.

Primera división meiótica o división heterotípica:

La división se lleva a cabo en las siguientes etapas:

Ésta es la etapa más larga.

Se divide en una serie de subetapas:

Durante esta etapa, los cromosomas son extremadamente delgados y solo se pueden ver con dificultad. Solo los cromosomas sexuales pueden destacarse como cuerpos heteropicnóticos compactos.

Durante esta etapa, el meiocito y su núcleo se hacen más grandes, los cromosomas se vuelven más distintos y su doble naturaleza (las dos cromátidas) se observa en muchos organismos. Aparecen como hilos delgados que llevan una serie de estructuras en forma de cuentas, llamadas cromómeros.

Durante el zygonema, los cromosomas se vuelven más cortos y más gruesos y los cromosomas homólogos comienzan a emparejarse o sinapsis. Cada par se llama bivalente. El emparejamiento es muy específico, siendo cromómero por cromómero. Si se produce un apareamiento entre cromosomas no homólogos, se denomina pseudosinapsis.

Durante la sinapsis, los cromosomas homólogos permanecen separados por un espacio de aproximadamente 0,15 a 0,20 mm que está ocupado por el complejo sinaptonemal (SC). El SC fue descubierto por Moses (1956). Está compuesto por tres elementos paralelos y se supone que une a los cromosomas homólogos.

En esta etapa, los cromosomas se vuelven más cortos y más gruesos. Cada cromosoma en un bivalente, en esta etapa tiene dos cromátidas, por lo tanto, un bivalente realmente consta de cuatro cromátidas en etapa de paquinema, y ​​se llama tétrada.En esta etapa tiene lugar el intercambio de segmentos de cromátida (es decir, cruzamiento) entre cromosomas homólogos. El nucléolo aún persiste.

Los cromosomas se engrosan y acortan aún más. A estas alturas, los cromosomas íntimamente emparejados se repelen y comienzan a separarse. La separación comienza en el centrómero y continúa hacia el final. Sin embargo, la separación no es completa, ya que los cromosomas homólogos están unidos por quiasmas que representan los lugares de cruce. Debido a la fuerza repulsiva entre los cromosomas, los quiasmas se mueven hacia los extremos de los cromosomas, este proceso se denomina terminalización.

Esta es la etapa final de la profase-1 meiótica. En esta etapa, los cromosomas se vuelven muy cortos, gruesos y enrollados. Los bivalentes se separan y se mueven hacia la periferia del núcleo. Desaparece la membrana nuclear. El nucleolo también desaparece y los husos están completamente formados y bien orientados.

En esta etapa, los bivalentes se disponen a lo largo de las fibras del huso en una región ecuatorial de tal manera que los centrómeros de sus bivalentes estén hacia los polos.

Durante esta etapa, las fibras del huso se contraen debido a que los bivalentes (díada) se mueven hacia los polos opuestos del huso. Debido al tirón, cada díada se convierte en una & # 8216V & # 8217 invertida. La díada de un cromosoma materno está completamente separada de la díada del cromosoma paterno. La separación de cromosomas homólogos en esta etapa se denomina disyunción.

En los polos opuestos, los cromosomas se desenrollan y se alargan mucho. Reaparecen el nucleolo y la membrana nuclear.

Como resultado de la citocinesis, el citoplasma se divide en dos células hijas.

Esta es la etapa de interfase entre la primera división meiótica y la segunda división meiótica. Si puede ser de mayor o menor duración.

Segunda división meiótica o división homotípica:

El proceso meiótico se completa solo cuando dos núcleos haploides de vacuola se dividen mediante un proceso, que es casi similar a la mitosis. Esta segunda división meiótica se llama, a veces, mitosis meiótica. Como resultado de este proceso se forman cuatro núcleos haploides.

Esta división tiene lugar en las siguientes etapas:

En esta etapa, el nucleolo y la membrana nuclear desaparecen y los cromosomas se liberan en el citoplasma. A esta etapa le sigue la formación de un huso.

En esta etapa, los cromosomas se organizan a lo largo del plano ecuatorial del huso. Los centrómeros de los cromosomas se orientan en el centro y los brazos se extienden hacia los polos opuestos y luego los centrómeros también se dividen en dos cada uno.

En esta etapa, las fibras del huso se contraen por lo que se ejerce una fuerza de tracción sobre los centrómeros. Como resultado, las dos cromátidas hermanas van hacia los polos opuestos.

En esta etapa aparece una membrana nuclear alrededor de las cromátidas. El nucleolo también aparece de nuevo.

Como resultado de la citocinesis, los dos núcleos hijos se separan y, por lo tanto, se forman dos células hijas. Cada núcleo tiene un número haploide de cromosomas. Por tanto, se forman cuatro células hijas haploides a partir de una única célula madre diploide.

Importancia de la meiosis:

1. Ayuda en la producción de gametos haploides que mantienen el número cromosómico en la descendencia después de la fertilización.

2. Produce nueva generación.

3. Conduce a variaciones en las generaciones causadas por cruces que ocurren durante la meiosis.

Errores en la división celular:

Durante la división celular, si se produce algún error en cualquier etapa o fase de la división, eso provoca anomalías en un individuo. Estas anomalías pueden deberse a cambios estructurales o numéricos en los cromosomas. Estos cambios pueden ocurrir en los autosomas o en los cromosomas sexuales.

Cariotipo / síndromes humanos anormales:

Los cromosomas son las estructuras que transportan la información genética en forma de ADN. Se trata de estructuras muy dinámicas que cuentan con una organización reguladora adecuada. La confirmación cromosómica juega un papel importante en la expresión del gen, mientras que la topología del cromosoma también juega un papel importante. Un ligero cambio en la topología del cromosoma puede afectar la acción del gen.

Aberraciones estructurales en los cromosomas:

Cuando se altera la estructura de un cromosoma, se denomina aberraciones cromosómicas.

Es de cuatro tipos principales:

Cuando falta o se elimina una parte del cromosoma, se denomina eliminado.

La deleción es una aberración genética en la que falta una parte de un cromosoma o una secuencia de ADN. La supresión es la pérdida de material genético. Se puede eliminar cualquier cantidad de nucleótidos, desde una sola base hasta una pieza completa de cromosoma. Puede deberse a errores en el cruce durante la meiosis. La eliminación de un número de pares de bases que no es uniformemente divisible por tres conducirá a una mutación de cambio de marco, lo que hará que todos los codones que ocurren después de la eliminación se lean incorrectamente durante la traducción, produciendo una proteína severamente alterada y potencialmente no funcional.

La duplicación es lo opuesto a una eliminación. Las duplicaciones surgen de un evento denominado cruce desigual que ocurre durante la meiosis entre cromosomas homólogos desalineados. La posibilidad de que esto suceda depende del grado de intercambio de elementos repetitivos entre dos cromosomas. El producto de esta recombinación es la duplicación en el sitio del intercambio y una deleción recíproca.

3. Translocación:

Cuando una porción de un cromosoma se transfiere a otro cromosoma no homólogo, se denomina translocación. La translocación es una anomalía cromosómica causada por el reordenamiento de partes entre cromosomas no homólogos. Cuando se produce un intercambio uniforme de material sin información genética extra o faltante e idealmente con la funcionalidad completa, se denomina translocación equilibrada. Cuando el intercambio de material cromosómico es desigual, lo que da como resultado genes adicionales o faltantes, se denomina translocación desequilibrada.

Una inversión es un reordenamiento cromosómico en el que un segmento de un cromosoma se invierte de un extremo a otro, es decir, cuando un segmento de cromosomas se rompe pero luego se vuelve a unir después de girar 180 °, se produce una inversión.

Una inversión ocurre cuando un solo cromosoma sufre una ruptura y un reordenamiento dentro de sí mismo. Las inversiones son de dos tipos, es decir, las inversiones paracéntricas no incluyen el centrómero y ambas rupturas ocurren en un brazo del cromosoma. Las inversiones pericéntricas incluyen el centrómero y hay un punto de ruptura en cada brazo.

A. Anormalidades debidas a cambios estructurales en los cromosomas:

1. Síndrome del llanto de gato (síndrome de Cri-Du-Chat):

Se debe a la deleción del brazo corto (p-arm) del 5º cromosoma. El niño afectado tiene una pequeña epiglotis y laringe, por lo tanto llora como un gatito, la cara se vuelve como la luna, la cabeza es pequeña y el niño presenta retraso físico y mental.

Tumor maligno del ojo, se debe a la deleción de parte del cromosoma 13.

3. La deleción del brazo largo del cromosoma 18 produce síntomas como anomalías esqueléticas y oftálmicas junto con un profundo retraso mental y alteraciones faciales.

4. Leucemia granulocítica:

Ocurre debido a la translocación del brazo largo (brazo q) del cromosoma 22 al cromosoma 9, lo que provoca un aumento de la proliferación y acumulación de granulocitos. El cromosoma 22º eliminado se llama cromosoma Filadelfia.

A veces, los cromosomas de un par de cromosomas no pueden separarse en la primera división meiótica. Esto conduce a la formación de un gameto que contiene todos los cromosomas de ese par cromosómico, mientras que el otro gameto no contiene ninguna parte cromosómica.

Este fenómeno se llama no disyunción.

La no disyunción es de dos tipos:

(a) No disyunción primaria:

C.B. Bridges durante sus experimentos informó sobre condiciones inesperadas en la herencia de los personajes vinculados al sexo. Mientras cruzaba un macho de ojos rojos con una hembra de ojos blancos Drosophila, observó machos de ojos rojos y hembras de ojos blancos en F1 generación (contrariamente a la condición esperada de los machos de ojos blancos y las hembras de ojos rojos).

Esta condición se explicó sobre la base de la no disyunción del cromosoma X en la hembra de Drosophila. Según él, las hembras de ojos blancos portan dos cromosomas X que fueron heredados de la madre, por lo tanto, el color de los ojos era el blanco. Por otro lado, los machos de ojos rojos no pudieron obtener el cromosoma X de la madre debido a la falta de disyunción. Recibieron el cromosoma X solo del padre.

(b) Secundario No disyunción:

Cuando Bridges cruzó las hembras de ojos blancos de la F1 generaciones (portadoras del cromosoma XXY debido a la no disyunción primaria) con el macho normal de ojos rojos, las crías tenían 96% de hembras de ojos rojos y 4% de hembras de ojos blancos. En la meiosis, XXY se desunirá para formar X & amp XY en una condición normal, pero la no disyunción secundaria da como resultado el gameto XX y amp Y. Esto dio lugar a hembras de ojos blancos XXY y machos de ojos rojos XY.

B. Anormalidades debidas a cambios numéricos en los cromosomas:

1. Debido a la aneuploidía de los cromosomas sexuales:

Monosomía del cromosoma X (44 + XO). Fenotípicamente, estas hembras son de baja estatura, tienen gónadas estriadas, nervios pigmentados múltiples (marcas de nacimiento) y cuello palmeado.

(b) Síndrome de Klinefelter & # 8217s:

Es la Trisomía de los cromosomas sexuales (44 + XXY). Las trisomías muestran un efecto gigas para ciertos genes. Estos son machos estériles con ginecomastia. Este síndrome incluye incluso varones del tipo XXXY y XXXXY & # 8211 que muestran un grado aún mayor de esterilidad.

(c) Síndrome XXX / Síndrome de súper hombre (Jacob & # 8217s):

Aunque se dice que estos hombres tienen antecedentes penales, varios trabajadores han criticado recientemente esta opinión.

Síndrome de la súper hembra, hembras estériles de baja estatura.

2. Debido a aneuploidía de autosomas:

Comúnmente involucra a los cromosomas de los grupos D, E y G.

Trisoma del cromosoma 13. Los niños afectados presentan retraso mental, ojos defectuosos y trastornos cardíacos.

Trisomía del cromosoma 18. Los niños afectados presentan anomalías en los dedos, acodroplasia, huellas digitales complejas, defectos cardíacos, orejas de implantación baja y boca pequeña. Mueren antes del año de edad.

(c) Síndrome de Down & # 8217s / mongolismo / idiotez mongoloide:

Es una trisomía del cromosoma 21 (debido a la no disyunción durante la ovogénesis). Es la trisomía más familiar del hombre. Langdon Down (1866) de Inglaterra lo describió por primera vez.

Los síntomas del síndrome de Down & # 8217s son los siguientes:

(a) Manos cortas y anchas con pliegue palmar tipo simio.

(c) Hiperflexibilidad de las articulaciones.

(e) Cabeza ancha con cara redonda.

(f) Boca abierta con lengua grande.

Genética del comportamiento:

La complejidad de los rasgos de comportamiento de cualquier animal se desarrolla bajo efectos conjuntos y estrechamente entrelazados de la herencia y el medio ambiente.

Por tanto, la genética del comportamiento se ocupa de los efectos del genotipo en el comportamiento y del papel que desempeñan las diferencias genéticas en la determinación de las diferencias de comportamiento en una población.

Disomía uniparental (UPD):

La presencia de dos copias de un cromosoma o parte de un cromosoma de un solo padre y no del otro padre se denomina disomía uniparental o UPD.

En humanos, la disomía uniparental se descubrió por primera vez en 1988 en un niño que padecía una enfermedad llamada fibrosis quística y baja estatura. Spence y sus colaboradores lo descubrieron y demostraron que la niña había recibido dos copias del cromosoma número 7 con un gen de FQ mutante (gen de FQ) de su madre, pero ninguna del padre.

Después de esto, también se informan muchos otros trastornos debido a la disomía uniparental. Aunque la frecuencia de aparición de la disomía uniparental no está clara, se ha estimado que aproximadamente uno de cada 500 individuos afectados se debe a la disomía uniparental materna.

Cromosomas en anillo:

Un cromosoma normal tiene forma lineal y puede tener dos cromátidas hermanas en alguna etapa del ciclo celular. Si la topología cambia de forma lineal a circular, puede afectar la secuencia de eventos o acciones.

El cambio de forma lineal a circular da como resultado la formación de un cromosoma en anillo. Da lugar a diversas anomalías, como tumores, etc.

Los cromosomas en anillo se pueden formar de las siguientes formas:

(a) El cromosoma en anillo puede formarse debido a la rotura de los brazos del cromosoma y la fusión de los extremos proximales, lo que da como resultado la pérdida de material genético en los extremos distales.

(b) También puede estar formado por disyunción telomérica que da como resultado la fusión de extremos cromosómicos relativos. Aquí los materiales genéticos en los extremos distales se pierden causando un efecto mínimo o permanecen intactos.

Se dice que las células (y sus propietarios) son poliploides si contienen más de dos conjuntos de cromosomas haploides (n), es decir, su número de cromosomas es un múltiplo de n mayor que el contenido 2n de células diploides. Por ejemplo, las células triploides (3n) y tetraploides (4n) son poliploides.

Poliploidía en plantas:

La poliploidía es muy común en las plantas, especialmente en las angiospermas. Se cree que entre el 30% y el 70% de las angiospermas actuales son poliploides. Se conocen especies de planta de café con 22, 44, 66 y 88 cromosomas. Esto sugiere que la condición ancestral era una planta con un número haploide (n) de 11 y un número diploide (2n) de 22, a partir de la cual evolucionaron los diferentes descendientes poliploides.

El trigo actual, con sus 42 cromosomas, es un hexaploide (6n) de su planta ancestral con su número haploide (n) igual a 7.

Las plantas poliploides no solo tienen células más grandes, sino que las propias plantas suelen ser más grandes. Esto ha llevado a la creación deliberada de variedades poliploides de plantas como sandías, caléndulas y boca de dragón.

La poliploidía se ha producido a menudo en la evolución de las plantas. El proceso puede comenzar si se forman gametos diploides (2n).

Estos pueden surgir de al menos dos formas:

(a) Los gametos pueden formarse por mitosis en lugar de meiosis.

(b) Las plantas, a diferencia de los animales, forman células germinales (espermatozoides y óvulos) a partir de tejidos somáticos. Si el contenido de cromosomas de una célula somática precursora se ha duplicado accidentalmente (p. Ej., Como resultado de pasar por la fase S del ciclo celular sin seguir con mitosis y citocinesis), entonces se forman gametos que contienen 2n cromosomas.

La poliploidía también ocurre naturalmente en ciertos tejidos vegetales. A medida que el endospermo (3n) se desarrolla en los granos de maíz (Zea mays), sus células experimentan rondas sucesivas (hasta 5) de núcleos productores de endorreplicación que alcanzan los 96n.

La poliploidía puede ser de los siguientes dos tipos:

1. Alopoliploidía:

Los autopoliploides son poliploides con múltiples conjuntos de cromosomas derivados de una sola especie. Los autopoliploides pueden surgir de una duplicación del genoma espontánea y natural, como la papa. Otros pueden formarse después de la fusión de gametos diploides (2n). Los plátanos y las manzanas se pueden encontrar como autotriploides. Las plantas autopoliploides suelen mostrar una herencia polisómica y, por lo tanto, a menudo son infértiles y se propagan de forma clonal perfecta.

2. Alopoliploidía:

Los alopoliploides son poliploides con cromosomas derivados de diferentes especies. Precisamente es el resultado de duplicar el número de cromosomas en un F1 híbrido. El triticale es un ejemplo de alopoliploide, que tiene seis conjuntos de cromosomas, alohexaploide, cuatro de trigo (Triticum turgidum) y dos de centeno (Secale cereale). Anfidiploide es otra palabra para un alopoliploide.


Los pasos bioquímicos mediante los cuales las topoisomerasas bacterianas alteran la topología del ADN son bien conocidos. Sin embargo, ha sido una tarea más complicada establecer roles fisiológicos y sitios de acción de las diferentes topoisomerasas dentro del contexto del ciclo celular bacteriano. Esta dificultad se puede atribuir en parte a la redundancia entre las actividades de las diferentes enzimas. En esta microrevisión, nos centraremos en los avances recientes en la comprensión de la estructura topológica del cromosoma, el análisis del mecanismo de la topoisomerasa en ensayos de una sola molécula y los datos recientes sobre la regulación e integración de la actividad de la topoisomerasa dentro del ciclo celular que han aportado una nueva perspectiva. a la acción de las topoisomerasas en la célula bacteriana.

Enlace topológico entre las dos cadenas de moléculas de ADN, como el cromosoma circular cerrado de Escherichia coli se describe mediante el número de enlace, Lk, una medida cuantitativa del número de veces que las dos hebras parentales se enrollan entre sí. En un sentido simple, este devanado toma dos formas: los devanados de cada hebra alrededor de la otra en la hélice de ADN, que a menudo se denominan giros dúplex y los devanados de la hélice sobre sí misma en giros superhelical. Nuevamente, en el sentido más simple, Lk es la suma del número de giros dúplex y superhélice con una convención de signos para dar cuenta del hecho de que Lk no se puede cambiar en un anillo de ADN cerrado a menos que al menos una de las hebras esté rota. y resellar. La superhelicidad es una poderosa fuerza impulsora termodinámica para muchas reacciones que ocurren en el cromosoma. Esto se debe a que el estado termodinámico preferido de una molécula de ADN circular cerrada es el relajado, en el que no hay superenrollamientos. Por lo tanto, las reacciones que exigen el desenrollado de las hebras de plantilla parentales, como la transición de un complejo cerrado a abierto entre la ARN polimerasa y un promotor o la replicación del ADN, se ven favorecidas en moléculas superenrolladas negativamente, mientras que las reacciones que exigen el rebobinado de las hebras de plantilla, como como regresión del ADN naciente en una horquilla de replicación estancada, se favorecen en moléculas positivamente superenrolladas. Debido a que Lk no puede cambiar en un anillo cerrado, cualquier alteración de la topología del ADN local es absorbida por una alteración compensadora en una parte distal de la molécula. Ahí radican los problemas resueltos por las topoisomerasas.

Hay tres tareas principales para las topoisomerasas en la célula bacteriana: eliminación del exceso de devanados positivos del cromosoma generados como resultado de la replicación del ADN, mantenimiento de la homeostasis topológica del cromosoma y reducción del enlace topológico entre los cromosomas hermanos a exactamente cero durante la partición cromosómica y citocinesis. Replicación del E. coli El cromosoma es bidireccional y cada horquilla de replicación avanza a una velocidad de 700 a 1000 nucleótidos s -1. La eliminación de cada giro dúplex a medida que se desenrolla la plantilla parental genera un enrollamiento positivo compensatorio que puede tomar una de dos formas: un superenrollamiento positivo que se forma en la región no replicada del cromosoma por delante de la bifurcación o un precatenane, un enrollamiento positivo de los dos. Hebras hermanas parcialmente replicadas entre sí detrás de la horquilla. Esta última forma topológica fue sugerida por primera vez por Champoux y Been (1980), quienes señalaron que, a menos que los replisomas mismos formaran una barrera topológica, los devanados positivos deberían poder equilibrarse tanto delante como detrás de las horquillas de replicación. Si no se eliminan al completarse la replicación, los precateanos se convierten en catenanos, es decir, enlaces entre los dos cromosomas hermanos. Replicación del ADN en E. coli genera en algún lugar en la región de 200 enlaces positivos en exceso s -1 que tienen que ser eliminados por las topoisomerasas.

Como si esto no fuera un problema topológico suficiente, la homeostasis topológica se ve acosada por el hecho de que la transcripción también revuelve el paisaje. Como se señaló en el modelo de superenrollamiento de dominios gemelos de Liu y Wang (1987), el movimiento de la ARN polimerasa a través de una plantilla de ADN crea una acción similar a un tornillo. Si el ADN no puede girar, las superenrollamientos positivos se acumularán delante de la ARN polimerasa de transcripción y los superenrollamientos negativos se acumularán detrás.Por lo tanto, para mantener una densidad superhelical global apropiada en el cromosoma, estos superenrollamientos en exceso deben eliminarse.

Finalmente, incluso un enlace topológico residual entre los cromosomas hermanos en el punto de partición cromosómica y citocinesis durante el ciclo celular es catastrófico, lo que resulta en la rotura de los cromosomas y la generación de células anucleadas. Además, todos estos problemas topológicos se complican por el hecho de que el cromosoma en sí está organizado en dominios topológicos con barreras que impiden la libre difusión de superenrollamientos. Por lo tanto, cualquier descripción completa de la función de la topoisomerasa en la célula debe tener en cuenta la probabilidad de que el control espacial y temporal de la acción de la topoisomerasa sea esencial.

¿Podemos ahora proporcionar una evaluación completa de la acción de la topoisomerasa incluso para una de estas tareas? Probablemente no. Hemos aprendido muchas cosas nuevas sobre la acción de la topoisomerasa en la célula durante los últimos años, pero algunos de los nuevos datos provocan una reconsideración del pensamiento anterior. De las cuatro topoisomerasas presentes en E. coli, análisis bioquímico in vitro ha demostrado que la topoisomerasa (Topo) I, Topo III y Topo IV comparten la capacidad de relajar superenrollamientos negativos [(-) sc]. Topo IV y ADN girasa pueden relajar superenrollamientos positivos [(+) sc]. Además, Topo III, Topo IV y girasa pueden desencadenar y desanudar moléculas circulares de ADN (Champoux, 2001). La idea original era que la girasa es la principal responsable de la relajación de (+) sc. Aunque las mediciones bioquímicas estándar realizadas en solución que promedian la acción de todas las moléculas de topoisomerasa en todas las moléculas de sustrato demostraron que las tasas de eliminación de (+) sc catalizadas por girasa y Topo IV eran comparables (≈ 0,2-0,3 eventos de paso de hebras min −1) , la reacción catalizada por girasa fue procesiva, mientras que la reacción catalizada por Topo IV fue distributiva (Hiasa y Marians, 1994). Además, la capacidad única de la girasa para convertir directamente superenrollamientos positivos en negativos (Brown y Cozzarelli, 1979) implicó fuertemente a la girasa como el agente principal en la eliminación de superenrollamientos positivos para lograr la homeostasis topológica. De manera similar, la gran diferencia en la actividad de decantación observada para Topo IV (eventos de pasaje de cinco hebras min -1) en comparación con girasa (0.07 eventos min -1) (Hiasa y Marians, 1996) sugirió un papel único para Topo IV en la eliminación de precateanos. y catenanos. Esta tarea fue apoyada por la demostración en vivo que Topo IV solo eliminó los catenanos entre los anillos de ADN del plásmido y los nudos dentro de un anillo de ADN generado por la acción de una resolvasa específica del sitio (Zechiedrich et al., 1997 Deibler et al., 2001) y que la velocidad de decantación de las moléculas de ADN plasmídico cuando la girasa sola estaba activa era aproximadamente una centésima parte de la que tenía cuando tanto la girasa como el Topo IV estaban activos (Zechiedrich y Cozzarelli, 1995). Esta imagen ahora se ha enturbiado.

Khodursky et al. (2000) midieron la tasa de progresión de la horquilla de replicación en células sincronizadas en las que la girasa sola o la girasa y el Topo IV se inactivaban mediante el tratamiento con diferentes concentraciones de novobiocina. El paso de la horquilla de replicación se puntuó por el aumento en la dosis de cualquier gen en particular, medido por la hibridación del ADN a microarrays que consisten en productos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que representan el 96% de la E. coli marcos de lectura abiertos (ORF). Tomando muestras a lo largo del tiempo después de la liberación del procedimiento de sincronización y correlacionando el aumento en la dosis de genes con el mapa físico del cromosoma, se pudo visualizar la progresión de la horquilla de replicación y determinar la tasa de progresión. Sus resultados sugieren que, en ausencia de girasa, la tasa de progresión de la horquilla de replicación cromosómica se reduce a un tercio del valor inicial, pero la replicación, presumiblemente ahora respaldada por Topo IV, aún puede progresar a largas distancias. La inhibición tanto de girasa como de Topo IV provocó un cese completo de la progresión de la horquilla. Para evaluar si la progresión de la horquilla de replicación soportada por Topo IV resultó de la eliminación de (+) sc o precatenanes, los autores examinaron la influencia de la ausencia de Topo IV y actividad girasa en la acumulación de (+) sc en los ADN plasmídicos intracelulares. La acumulación de (+) sc, presumiblemente como resultado de un desequilibrio en la eliminación de superenrollamientos generados durante la transcripción en los plásmidos, requirió la eliminación de ambas actividades. Debido a que se espera que ni Topo I ni Topo III tengan la capacidad de relajar (+) sc, los autores argumentaron que Topo IV estaba apoyando la progresión de la horquilla de replicación al eliminar (+) sc, no precatenanes.

Estos estudios desafían dos principios previos del manejo intracelular de la topología: que solo la girasa soporta la progresión de la horquilla de replicación y que Topo IV prefiere trabajar con precatenanos. Con respecto a este último punto, estudios previos establecieron que los precateanos surgen durante la replicación de pequeños ADN plásmidos. en vivo y in vitro (Pedro et al., 1998). Considerando que Khodursky et al. (2000) demostraron que Topo IV se une a (+) sc y (-) sc con igual avidez, otros estudios muestran que Topo IV se une cinco veces mejor a los catenanos diestros en comparación con (+) sc (Hiasa y Marians, 1996). También se ha demostrado in vitro que Topo IV, pero no girasa, puede desvincular el ADN precatenado (Enfermera et al., 2003) y que la eliminación de precatenane puede apoyar la progresión de la horquilla (Hiasa y Marians, 1996). Curiosamente, un estudio que examinó la posición de los sitios de escisión de Topo II inducidos por etopósido en el ADN plasmídico que se replica en Xenopus Los extractos de huevo concluyeron que la enzima funcionaba eliminando los precateanos (Lucas et al., 2001). Bioquímicamente, Topo IV es el ancestro bacteriano directo del Topo II eucariota (Peng y Marians, 1995). Al observar los datos de microarrays sobre la progresión de la bifurcación a través del lente de los datos anteriores sobre precatenanes, debemos considerar que quizás los precatenanes no surgen durante la replicación cromosómica. El anclaje de la fábrica de replicación en el centro de la célula podría posiblemente prevenir la conversión de (+) sc en precatenanes por difusión detrás del replisoma. Esta posibilidad se discutirá nuevamente a continuación.

Las nuevas técnicas de una sola molécula para investigar la acción de la topoisomerasa han proporcionado información importante e interesante. En estos experimentos, un ADN largo (≈ 40 kpb) se estira entre un portaobjetos de vidrio y una cuenta magnética que flota sobre el portaobjetos. La cuenta se puede girar mediante un imán. Por lo tanto, cuando se rota una sola molécula de ADN dúplex, se generan (+) o (-) sc para compensar el rebobinado o el sobreenrollamiento del ADN (Strick et al., 2000). Se utiliza un sistema ligeramente diferente para formar trenzas entre dos ADN dúplex (Charvin et al., 2003 Piedra et al., 2003). Aquí, ambas moléculas están unidas a dos perlas, una en una trampa óptica y la otra en una micropipeta. La rotación de la micropipeta genera una trenza similar al entrelazado de dos dúplex de ADN en un catenano. La variación en la topología corresponde a la distancia entre el cordón y el portaobjetos en el primer caso y entre los dos cordones en el último caso, ambos registrados por una cámara de video.

En experimentos de una sola molécula, Crisona et al. (2000) demostraron que Topo IV relajó (+) sc a una tasa de eventos de paso de tres cadenas s −1, 20 veces mayor que la tasa de relajación de (-) sc. Esta preferencia por los cruces zurdos del dúplex en contraposición a los diestros quedó dramáticamente ilustrada por la actividad de Topo IV en los ADN trenzados (Stone et al., 2003). Cuando las trenzas estaban entrelazadas por un número moderado de vínculos, la preferencia era casi absoluta. Solo se desvinculó la trenza para zurdos. La desvinculación de la trenza de la mano derecha requirió que los ADN se entrelazaran ampliamente para que se generaran superenrollamientos compensatorios para la mano izquierda. Charvin hizo observaciones similares et al. (2003). Para explicar el hecho de que se ha demostrado con bastante claridad que Topo IV es activo en sustratos diestros, como los catenanos que surgen durante la replicación del ADN de tipo θ, Crisona et al. (2000) demostraron que, a la densidad de catenanos que se encuentra típicamente durante la replicación de ADN plásmidos pequeños, el ángulo de cruce adoptado por los dúplex catenados será casi aleatorio. Este fenómeno se produce porque, a estas bajas densidades de catenación específica, los cruces son relativamente móviles, el ángulo de intersección de los ADN dúplex podría reflejar el de un cruce de la mano derecha o de la izquierda, las densidades de catenación altas tenderán a ser más altas. restrictivo. Por lo tanto, a pesar de la clara detección quiral exhibida por la enzima, aún podrá desvincular los cruces nominalmente diestros.

El argumento de que Topo IV relaja (+) sc en la célula ha recibido un apoyo significativo de estos análisis de una sola molécula. La preferencia de Topo IV por los cruces a la izquierda le permite estar activo en los superenrollamientos positivos que surgen durante la replicación, pero sin superar los superenrollamientos negativos, preservando así la superhelicidad negativa general del cromosoma como fuerza impulsora del metabolismo del ADN. La tasa de relajación de superenrollamientos positivos determinada es similar a la tasa de desvinculación de las trenzas de ADN (eventos de paso de 2,5 y una hebra s −1 para las trenzas para zurdos y diestros, respectivamente). Estas tasas son consistentes con la tasa de decantación general durante la replicación del plásmido. en vivo (Zechiedrich y Cozzarelli, 1995). Tales tasas sugieren que la acción de aproximadamente 50 moléculas de Topo IV en cada mitad del cromosoma (o dentro de los dominios topológicos donde la replicación está en curso) sería suficiente para apoyar completamente la progresión de la horquilla de replicación.

Mientras que la numerología de este tipo es seductora y parece dar una respuesta satisfactoria, no parece que se hayan resuelto todos los problemas. Evidentemente, hay muchos factores en la célula que pueden modificar la actividad de las enzimas en cuestión. Sin embargo, en base a los análisis de microarrays y de una sola molécula, un modelo razonable es que la eliminación de (+) sc por girasa y Topo IV seguida de la eliminación de algunos catenanos residuales por Topo IV es la ruta tomada por la célula para tratar las variaciones en Lk producidas por replicación. En este modelo, todos los enredos topológicos entre las hermanas se eliminan al final de la replicación y la segregación completa se puede lograr de inmediato. Sin embargo, la imagen de la celda parece más compleja.

Khodursky et al. (2000) encontraron que Topo IV apoyaba la progresión de la horquilla en un tercio de la tasa observada cuando estaban presentes tanto girasa como Topo IV, sin embargo, las tasas derivadas del análisis de una sola molécula y la concentración de Topo IV en la célula (Espeli et al., 2003a) sugieren que debería poder soportar la progresión de la horquilla a la velocidad máxima. Desafortunadamente, no se ha informado de un análisis de girasa de una sola molécula similar, por lo que es difícil evaluar si se pueden establecer tales correspondencias uno a uno. Será importante determinar si la tasa de desvinculación de (+) sc por girasa está en el rango de 4 s −1, como se predice al combinar las observaciones de microarrays y de una sola molécula discutidas anteriormente. Sin embargo, la reducción en la tasa de progresión de la horquilla observada cuando se inactiva la girasa sugiere que la mayoría de las aproximadamente 1000 moléculas de Topo IV presentes en la célula (Espeli et al., 2003a) no tienen libre acceso al ADN. Además, en estos experimentos, a diferencia de cuando tanto la girasa como el Topo IV estaban activos, la progresión de la horquilla soportada por Topo IV cesó después de algún tiempo y la replicación no se completó.

Observaciones realizadas sobre las consecuencias de la inactivación parcial de la actividad girasa. en vivo cuestionar la opinión de que Topo IV está involucrado en el apoyo de la progresión de la horquilla de replicación. Grompone et al. (2003) han demostrado que, en un contexto en el que la actividad de la girasa se reduce ligeramente (una temperatura sensible gyrB mutante se mantiene a la temperatura semi-permisiva), el crecimiento celular depende completamente de la maquinaria de reinicio de replicación (para una revisión del reinicio de replicación, ver Cox et al., 2000). Esta observación sugiere que, cuando la girasa no es completamente funcional, (+) sc se acumula antes de la progresión de la bifurcación y del bloqueo. Si Topo IV es capaz de soportar la progresión de la horquilla a un tercio de la tasa de tipo salvaje al eliminar (+) sc cuando la girasa está totalmente ausente, ¿por qué no puede compensar una ligera reducción en la actividad de la girasa? Grompone et al. (2003) sugieren que la girasa parcialmente inactiva es incapaz de seguir el ritmo de la generación de (+) sc de manera que un exceso de (+) sc detiene la horquilla de replicación, los componentes del replisoma se disocian y el (+) sc son luego se transforman en precatenanes, lo que permite el ensamblaje posterior de un nuevo replisoma por parte de la maquinaria de reinicio y la reanudación de la progresión de la horquilla de replicación. Estas observaciones sugieren que Topo IV no compensa la ausencia o el debilitamiento de la girasa durante la progresión de la horquilla de replicación al eliminar (+) sc o precatenanes. Esta interpretación implica que los precateanos no son una barrera para la replicación y que el Topo IV presente en la célula no es libre de interactuar con el ADN en todo momento.

El apoyo a la restricción de la actividad de Topo IV proviene de estudios de este laboratorio que sugieren una regulación espacial y temporal de la actividad de Topo IV (Espeli et al., 2003a). Se midió la muerte celular inducida por quinolonas, ADN girasa o mediada por Topo IV como una función del ciclo celular para determinar cuándo se manifestaba la actividad girasa y Topo IV. Se usó un par isogénico de cepas en las que la subunidad GyrA de la ADN girasa era sensible o resistente a la quinolona norfloxacina y también tenía un efecto sensible a la temperatura. dnaC mutación que permitió la sincronización del crecimiento celular mediante un procedimiento de cambio de temperatura triple. La formación de roturas de doble hebra inducidas por quinolonas se correlaciona con la citotoxicidad de estos fármacos y se ha demostrado que ocurre cuando la horquilla de replicación encuentra el complejo topoisomerasa-quinolona-ADN congelado (Hiasa et al., 1996 Hiasa y Shea, 2000). Cuando la girasa era sensible a la norfloxacina, la destrucción de las células coincidía con el inicio de la replicación, de acuerdo con el posicionamiento aleatorio de la girasa en el ADN. Por otro lado, cuando la girasa era resistente a la norfloxacina, la muerte celular se produjo solo al final del ciclo celular, lo que implica que Topo IV tenía restringido el acceso al ADN hasta el final del ciclo de replicación. Esta interpretación fue apoyada por el uso de TUNEL para etiquetar todas las roturas de doble hebra inducidas por SDS mediadas por quinolonas en el nucleoide a lo largo del ciclo celular. Esta técnica debe medir la residencia de cualquier girasa o molécula de Topo IV en el ADN. Los resultados estaban completamente de acuerdo con los experimentos de destrucción de células. Esta regulación de la actividad de Topo IV parece estar relacionada con la localización específica de sus subunidades, ParE y ParC, en la célula. En la mayoría de las células, ParC se localizó en la fábrica de replicación de una manera que dependía de las subunidades τ y γ de la replicasa celular. Sorprendentemente, la localización de ParE no fue la misma. ParE formó focos en los espacios libres de ADN de la célula, principalmente en las proximidades del tabique en formación. Hemos propuesto que la regulación temporal de la actividad del Topo IV es reforzada por una regulación espacial que mantiene las dos subunidades separadas durante la mayor parte del ciclo celular y les permite asociarse en el centro de la célula cuando la decantación es absolutamente necesaria al final de la replicación. . De acuerdo con este modelo es el hallazgo de que una mutación en dnaX (que codifican τ y γ) que no afecta a la replicación, altera la decantación del cromosoma y hace que ParC se deslocalice.

Otra posibilidad interesante es que los componentes del anillo septal son importantes tanto para la localización subcelular como para la actividad de Topo IV. Hemos demostrado una interacción entre ParC y el dominio C-terminal de FtsK (Espeli et al., 2003b). FtsK es una proteína bifuncional compuesta de tres dominios (Liu et al., 1998). El dominio transmembrana N-terminal es necesario para la viabilidad celular y se presume que está involucrado en el cierre del anillo septal (Draper et al., 1998). La parte C-terminal de FtsK es citoplásmica y es necesaria para la resolución catalizada por XerCD de dímeros cromosómicos en dif (Steiner et al., 1999). Esta porción de FtsK se compone de dos dominios: un dominio rico en prolina y glutamina de función desconocida y un dominio AAA de 500 aminoácidos, C-terminal (dominio 3, FtsKC) que es necesario para la segregación cromosómica normal (Liu et al., 1998), en parte debido a su efecto sobre la recombinación de XerCD en dif (Recchia et al., 1999). FtsKC es una ATPasa hexamérica dependiente de ADN que puede alterar la topología del ADN y afectar la dirección de la resolución catalizada por XerCD in vitro (Aussel et al., 2002). Decadenación catalizada por Topo IV de dímeros de ADN con enlaces múltiples in vitro es estimulado de dos a tres veces por FtsKC, mientras que la reacción catalizada por girasa no lo es (Espeli et al., 2003b). Por lo tanto, FtsK puede capturar Topo IV en el tabique y participar en la decantación cromosómica. Esta posibilidad está respaldada por la reciente demostración de que, en presencia de FtsKC, XerCD puede descatenar los ADN plasmídicos que llevan un dif sitio (Ip et al., 2003). Esta interesante observación plantea las interesantes posibilidades de que FtsK participe directamente en la decantación cromosómica, posiblemente con la combinación XerCD-FtsK actuando como una actividad de decantación a prueba de fallos, y que puede haber un locus específico en la célula en el que ocurre toda la decantación cromosómica.

¿Cómo se pueden conciliar las diversas observaciones que indican, por un lado, que Topo IV es libre de acceder al cromosoma y participa en el apoyo a la progresión de la horquilla de replicación e indicar, por otro lado, que el acceso de Topo IV al ADN está restringido al final de la célula? ciclo cuando probablemente actúa solo sobre catenanos? Quizás la clave para hacerlo radica en el hecho de que, en las condiciones utilizadas por Khodursky et al. (2000) para sus mediciones de la progresión de la horquilla de replicación apoyada por Topo IV, la girasa se inactivó, lo que resultó en una relajación global del cromosoma (es decir, el superenrollamiento negativo se perdería rápidamente). Observaciones recientes sugieren que la dinámica cromosómica adecuada requiere un superenrollamiento negativo. MukB es una proteína similar a SMC que se cree que participa en el empaquetado de los cromosomas hermanos poco después de que salen de la fábrica de replicación (Ohsumi et al., 2001). Mutaciones en mukB son sensibles a la temperatura, muestran defectos de segregación cromosómica y producen células anucleadas a la temperatura no permisiva (Niki et al., 1991). Supresión de la mukB Los fenotipos se logran inactivando Topo I (Sawitzke y Austin, 2000). La supresión resulta de un aumento en el superenrollamiento negativo debido a la inactivación parcial de la girasa en mukB topA mutantes dobles restaura el mukB fenotipos.Por lo tanto, parecería que el sondeo de la girasa y la función del Topo IV inactivando la girasa tiene el precio de perturbar la dinámica cromosómica normal. Por lo tanto, se debe considerar la posibilidad de que la regulación específica de la localización del Topo IV se pierda en estas condiciones. Además, el presunto entrelazamiento masivo de los cromosomas hermanos que sigue a la inactivación de la girasa también puede explicar por qué la supuesta progresión de la horquilla de replicación apoyada por Topo IV se agotó en los experimentos de microarrays de Khodursky. et al. (2000). Grompone et al. (2003) no inactivó la girasa por completo, por lo que es posible que, en sus condiciones, hubiera suficiente superenrollamiento negativo global para mantener la dinámica cromosómica adecuada.

Comprender la dinámica de los cromosomas bacterianos es un nuevo esfuerzo. Observaciones recientes plantean la posibilidad de que el cromosoma pueda verse afectado por fuerzas que inducen estrés físico en el ADN. SetB es una proteína de membrana integral que identificamos en una pantalla de supresores de alta copia de los fenotipos sensibles a la temperatura y de partición de la parC1215 alelo (Espeli et al., 2003c). La inactivación de esta proteína provoca un retraso en la segregación cromosómica, mientras que su sobreproducción induce el estiramiento y la desintegración de los nucleoides. SetB se localiza en la celda con un patrón helicoidal e interactúa mediante análisis de dos híbridos con MreB. Recientemente se demostró que ParM, un homólogo de MreB codificado por el plásmido R1, impulsa la partición del plásmido mediante la polimerización de filamentos que separa a las hermanas (Moller-Jensen et al., 2002). Además, la expresión en células de tipo salvaje de formas mutantes de MreB que no pueden polimerizar induce una separación defectuosa de nucleoides y división celular (Kruse et al., 2003). Por lo tanto, favorecemos la hipótesis de que SetB participa en la aplicación de una fuerza al cromosoma que ayuda a impulsar la segregación cromosómica. Los dominios topológicos que están sometidos a estrés asumirán conformaciones dirigidas a aliviar ese estrés. Por tanto, si funciona un sistema de este tipo, hay que considerar que la forma y distribución de la topología en el cromosoma en replicación podrían ser distintas de las que imaginamos ahora. En esta línea, el rescate del parC La cepa sensible a la temperatura por sobreexpresión de SetB es hipersensible a la quinolona norfloxacina (datos no publicados), lo que sugiere que la necesidad de girasa se había vuelto particularmente aguda. Una posible interpretación de esta observación es que el exceso de tensión aplicada al cromosoma cuando se sobreexpresa SetB induce una conformación que permite que la girasa sirva como decatenasa celular.

Una descripción de cómo se maneja la topología de replicación en la celda que podría ajustarse a todos los datos y las interpretaciones discutidas aquí es que la girasa opera para eliminar el (+) sc formado durante la replicación, que los precatenanos formados no interfieren con la replicación y solo se eliminan al final del ciclo celular, probablemente cuando se han convertido en catenanos, y que Topo IV actúa principalmente sobre los catenanos (Fig. 1). El principio principal que rige cómo se distribuyen los devanados positivos en exceso generados por la replicación parece estar relacionado con la naturaleza de los dominios cromosómicos. Si los estudios futuros de una sola molécula apoyan la afirmación de que la girasa opera en aproximadamente dos a cuatro eventos de paso de cadena s −1, entonces cualquier dominio topológico que contenga una horquilla de replicación en avance requiere la acción simultánea de 13-25 moléculas de girasa. Tomemos 20 como valor medio. Debido a que la girasa envuelve 150 pb de ADN sobre sí misma (Liu y Wang, 1978), estas moléculas ocuparán 3 kpb de ADN no replicado.

Posible distribución de la topología del ADN, la ADN girasa y el Topo IV en la célula. La caricatura muestra una célula bacteriana que está a punto de completar la citocinesis. La célula está dividida por el anillo septal invaginable. Los catenanos entre los dos cromosomas hermanos que se están dividiendo están siendo eliminados por Topo IV que está anclado en el anillo septal en virtud de su interacción con el dominio AAA C-terminal de FtsK. La actividad de translocación del ADN de este dominio de FtsK puede participar directamente en la reacción de decantación. La replicación se ha iniciado en los cromosomas hermanos que se someten a partición. Los cromosomas hermanos de segunda generación están organizados en dominios topológicos superenrollados negativamente que posiblemente estén anclados por la ADN girasa. El dominio topológico que está por delante de la bifurcación de replicación (es decir, entre la fábrica de replicación y la barrera de dominio en la caricatura) está positivamente superenrollado. La girasa se concentra en este dominio para proporcionar suficiente actividad de desvinculación. El dibujo no está a escala. El ADN dúplex está representado por una sola línea. Las regiones recién replicadas de los cromosomas están en rojo. El tabique invaginante está representado por rectángulos grises.

¿Qué sucede cuando la bifurcación que avanza aprieta al consorcio giraso contra la barrera del dominio? En parte, el resultado depende tanto del comportamiento de la girasa ligada como de la naturaleza de la barrera del dominio en sí. Una posibilidad es que, como las moléculas de girasa presumiblemente se disocian para permitir el paso de la bifurcación, todos los devanados dúplex de la región no replicada se conviertan en precateanos, 300 de ellos. Tal situación parecería insostenible. Esta conversión requeriría 300 rotaciones de la bifurcación de replicación por dominio, algo que probablemente sea poco probable. Además, si los dominios cromosómicos son del orden de 50 kpb, la aritmética argumenta que habría en el rango de 25 000 precatenanos convertidos en catenanos al final de la replicación. Curiosamente, dadas las tasas medidas para la desvinculación del ADN trenzado de Topo IV, unas 40 moléculas de Topo IV podrían eliminar todas esas uniones en unos 10 minutos, un período que corresponde aproximadamente al período D de la E. coli ciclo celular (Cooper y Helmstetter, 1968). Por otro lado, el grado de vinculación entre los cromosomas hermanos implicado por esta densidad de precatenanes parecería ser una fuerza para la cohesión del cromosoma hermano que actuaría contra la extrusión de las hermanas en mitades opuestas de la célula como se postula en modelos de replicación. partición cromosómica impulsada (Lemon y Grossman, 2001).

Una posibilidad más probable es que las barreras de dominio no estén fijas y puedan deslizarse hacia adelante a medida que avanza la bifurcación. Quizás la presión del consorcio girasa al encontrar la barrera del dominio actúa como algún tipo de desencadenante en este proceso o quizás la barrera del dominio es el propio consorcio giraso. En estas circunstancias, las moléculas de girasa que se disocian para permitir el paso de la bifurcación podrían volver a unirse corriente abajo. De esta manera, habría una pequeña cantidad de superenrollamientos positivos sobre los precatenanes. Claramente, quedan por responder muchas preguntas sobre el manejo de la topología del ADN en la célula.


Ver el vídeo: The 3D Organization of our Genome: now corrected on (Julio 2022).


Comentarios:

  1. Symer

    Una persona expande el camino, y no el camino expande a una persona ...

  2. Benoni

    Creo que está equivocado. Intentemos discutir esto. Escríbeme en PM, te habla.

  3. Alafin

    Yes, quite



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